生物化学实验原理与方法.ppt

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1、生物化学实验原理与方法12/28/202212/28/2022SWAUSWAUn n第一章：生物化学物质的制备n n第二章：离心技术n n第三章：层析技术n n第四章：电泳技术n n第五章：基因克隆技术n n第六章：PCR技术n n第七章：生物芯片技术12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第一章:生化物质的制备 n n生化物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时产生的蛋白质生化物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物。这些大分子物质在生物体内具有各（包括酶）和核酸等有机化合物。这些大分子物质在生物体内具有各种生理活性，这些活性的

2、产生与其结构有着密切关系，因此，分离此种生理活性，这些活性的产生与其结构有着密切关系，因此，分离此类物质不能用一般的化学分离方法，而是采用比较特殊的方法。这些类物质不能用一般的化学分离方法，而是采用比较特殊的方法。这些方法与一般的化学分离方法相比，有下列几个方法与一般的化学分离方法相比，有下列几个特点特点：n n1 1、生物材料组成非常复杂生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化合物，并。其中包括数百种甚至数千种化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢变化，如蛋白质和核酸的且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢变化，如蛋白质和核酸的水解。水解。n n2 2、有些化合物的、有些化

3、合物的含量极微含量极微，如激素等。，如激素等。n n3 3、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变变性破坏很易变变性破坏，因此，因此常选用比较温和的条件进行制备。常选用比较温和的条件进行制备。n n4 4、生化分离制备几乎都在、生化分离制备几乎都在溶液溶液中进行，中进行，影响因素很多影响因素很多，实验方法经，实验方法经验性较强。验性较强。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第一节：生物材料的选择n n选择生物材料的原则选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好；来源：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综

4、合利用价值等。丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价值等。n n生物材料一般可以分为生物材料一般可以分为两大类两大类：天然生物材料和人工生物：天然生物材料和人工生物材料。材料。n n天然生物材料天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的生物个体、器官或组织。高的生物个体、器官或组织。n n人工生物材料人工生物材料又分为三种：又分为三种：1 1、新品种材料新品种材料 2 2、组织培养材料、组织培养材料 3 3、生物产品与生物制品材料、生物产品与生物制品材料12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第二 节：细胞及组织的破碎n n

5、细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的和材料的不同可以采用不同的细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的和材料的不同可以采用不同的 细胞破细胞破碎方法，细胞破碎方法大致可以分为四类：碎方法，细胞破碎方法大致可以分为四类：n n机械破碎机械破碎：研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法n n溶胀和自溶溶胀和自溶 溶胀：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压溶胀：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象。差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞

6、膜发生胀破的现象。自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用，发生溶解的现象。自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用，发生溶解的现象。n n化学处理化学处理 用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDSSDS）处理细胞时，可以把）处理细胞时，可以把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类物质，并导致整个细胞细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类物质，并导致整个细胞破碎。破碎。n n生物酶降解生物酶降解 生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞时，先是细胞壁降解，

7、随之而来生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞时，先是细胞壁降解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第三节：生物分子的提取n n提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。提取液应具备的条提取液应具备的条件件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；

8、来源广对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等泛、价格低廉、操作安全等。n n生物分子可以分为生物大分子和生物小分子。生物小分子的结构由较强的共生物分子可以分为生物大分子和生物小分子。生物小分子的结构由较强的共价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。因此，这两类生物分子的温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。因此，这两类生物分子的提取液成分和操作条件差别很大。提取液成分和操作条件差别很大。n n1 1、生物小

9、分子的提取生物小分子的提取n n2 2、生物大分子的提取生物大分子的提取 蛋白质和酶的提取蛋白质和酶的提取 核酸的提取核酸的提取12/28/202212/28/2022SWAUSWAU溶剂提取法n n原理原理:利用溶剂的利用溶剂的溶解作用溶解作用把所需物质从细胞中转移出来把所需物质从细胞中转移出来n n影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素）影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素）1 1、溶剂的性质溶剂的性质：（根据相似相溶原理）：（根据相似相溶原理）2 2、离子强度离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同物质溶解度

10、的影响不同，如高离子强度下对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-DNA-核蛋白溶解度增核蛋白溶解度增加，而低离子强度下加，而低离子强度下RNA-RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶盐溶）。）。3 3、PHPH值值：溶剂的：溶剂的PHPH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，不能是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有不能是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。机溶剂。4 4、温度温度：温度的升高可以增

11、加物质的溶解度。：温度的升高可以增加物质的溶解度。5 5、去垢剂去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDSSDS，Tween20Tween20，Triton X-100Triton X-100。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第四节：生物大分子的浓缩n n1 1、沉淀法沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，

12、在经离心出去不淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等 。n n2 2、吸附法吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。缩小三倍左右。n n3 3、超过滤法超过滤法：把提取液装入过

13、滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。质通过半透膜，大分子物质留在膜内。n n4 4、透析浓缩法透析浓缩法n n5 5、减压蒸馏浓缩法减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。蒸馏。n n6 6、冰冻干燥法冰冻干燥法12/28/202212/28/2022SWAUSWAU一、硫酸氨盐析法n n原理原理：根基蛋白质在稀盐溶液中：根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度溶解度会随着盐浓度的增会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一

14、定数值时，其溶高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出，。解度又逐渐下降，直至蛋白质析出，。盐析盐析的发生在于盐的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU影响蛋白质盐析的因素影响蛋白质盐析的因素 、蛋白质浓度蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时对盐

15、析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般为过大，蛋白质回收率也低。一般为2.5%-3.0%2.5%-3.0%的蛋白质浓的蛋白质浓度较适中。度较适中。n n、离子强度和离子类型离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。低的离子对

16、盐析影响弱。n n、对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将值调到越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。n n、温度温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在 操操作。作。12/28/202212/28/2022S

17、WAUSWAU二、有机溶剂沉淀法n n原理原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂的沉淀作用主要是的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数从而从而增强分子之增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低间的相互作用，使其溶解度降低。对于具有表面水层的生。对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，破坏溶质分子表面的水膜，使使这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度这些大分子脱

18、水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。n n优点优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤比较容易。盐，过滤比较容易。n n缺点缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强度及离子种类对其也有影响。度及离子种类对其也有影响。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU三、透析浓缩法n

19、n原理原理：天然或人工半透膜只允许小分子通过而阻碍大分子：天然或人工半透膜只允许小分子通过而阻碍大分子通过。当膜的两侧存在小分子通过。当膜的两侧存在小分子浓度梯度差浓度梯度差时，小分子就从时，小分子就从高浓度一侧向低浓度一侧扩散，直至达到平衡，如果能不高浓度一侧向低浓度一侧扩散，直至达到平衡，如果能不断去除扩散出来的小分子，从而达到分离纯化的目的。断去除扩散出来的小分子，从而达到分离纯化的目的。n n影响透析的因素影响透析的因素 1 1、半透膜的通透性半透膜的通透性：半透膜的通透性取决于膜孔径的大：半透膜的通透性取决于膜孔径的大小，在能阻碍大分子扩散的前提下，孔径越大，透析速度小，在能阻碍大分

20、子扩散的前提下，孔径越大，透析速度越快。越快。2 2、透析外液的更换透析外液的更换 3 3、温度温度：温度越高，透析速度越快。：温度越高，透析速度越快。4 4、压力压力：用跨膜的压力梯度可加速大分子的分离速度。：用跨膜的压力梯度可加速大分子的分离速度。5 5、溶剂溶剂12/28/202212/28/2022SWAUSWAU12/28/202212/28/2022SWAUSWAU四、等电点沉淀法n n原理：利用两性电解质在等电点处溶解度最小的性质。不同的两性电解质其等电点不同，其在电中性时溶解度不相同。因而等电点沉淀法可用于某些两性电解质的分离如氨基酸、蛋白质、核苷酸等，为了增加沉淀效果，往往在

21、等电点时再加上其他沉淀因素，所以幻灯片 2等电点沉淀法一般不单独使用，常和盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用，以提高其沉淀能力。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第二章：离心技术 第一节、离心技术的原理第一节、离心技术的原理 当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，的离

22、心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。在轴。在相同转速相同转速条件下，容器中不同大小的悬条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降速率沉降。经。经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。浮颗粒或高分子溶质的有效分离。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第二节、影响离心沉降速率的因素 球型颗粒在自然沉降过程中：球型颗粒在自然沉降过程中：摩擦力摩擦力F1=6F1=6r rpdr/d

23、tpdr/dt 浮力浮力F2=(F2=(p p-mm )V)Vg g V=4/3 V=4/3 r rP P2 2 球形颗粒的自然沉降速率：球形颗粒的自然沉降速率：dr/dtdr/dt=2 2r rp p2 2(p p-mm)g/9)g/9 在离心力作用下，非球形颗粒的沉降速率在离心力作用下，非球形颗粒的沉降速率:dr/dtdr/dt=2 2r rp p2 2(p p-mm)w w2 2 r/9/9 (f/f0)(f/f0)影响沉降速率的主要因素：颗粒半径影响沉降速率的主要因素：颗粒半径r rp p的大小；颗粒形状；颗粒与悬浮的密度差的大小；颗粒形状；颗粒与悬浮的密度差(p p-mm )；一定温

24、度下悬浮介质的黏度系数；一定温度下悬浮介质的黏度系数；离心加速度；离心加速度w w2 2r。在确定的条件下，沉降速率主要取决于在确定的条件下，沉降速率主要取决于离心机的转速离心机的转速。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第三节、沉降系数 dr/dt=2rp p2(p p-m)w2 r/9 9(f/f0(f/f0）s=2rp p2(p p-m)/9 9(f/f0(f/f0）dr/dtsw2 r S为沉降系数为沉降系数，表示单位离心力场下的沉降速，表示单位离心力场下的沉降速率即通过单位离心力场所需的时间，因此单位率即通过单位离心力场所需的时间，因此单位为秒。为秒。12/28/

25、202212/28/2022SWAUSWAU沉降系数的作用：沉降系数的作用：1 1、描述颗粒的大小描述颗粒的大小 2 2、预计沉降时间预计沉降时间 对已知对已知S S值的物质，可预计在离心管中的沉降所需时间。值的物质，可预计在离心管中的沉降所需时间。3 3、测定物质的分子量测定物质的分子量 根据根据SvedbergSvedberg公式可计算出分子量。公式可计算出分子量。M=RTS20,w/D20,w(1-V)R R-气体常数，等于气体常数，等于1.9871.987卡卡/度度.摩尔摩尔 T T热力学温度热力学温度 S S20,w20,w-标准状况下粒子的沉降系数标准状况下粒子的沉降系数 D D2

26、0,w20,w-理想状态时粒子的扩散系数理想状态时粒子的扩散系数 V V-微分比容，等于溶质粒子密度的倒数微分比容，等于溶质粒子密度的倒数 -溶剂密度溶剂密度12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第四节、离心设备n n离心机一般由离心机离心机一般由离心机主机，转头，离心管主机，转头，离心管三部分组成。三部分组成。n n根据转速的高低把离心机分为三种：根据转速的高低把离心机分为三种：低速离心机低速离心机（转速在（转速在20006000r/min20006000r/min，最大，最大RCFRCF可达可达6000g6000g）；）；高速离心机高速离心机（转速在（转速在1800025

27、000r/min1800025000r/min，最大，最大RCFdRCFd达达60000g60000g）；）；超速离心机超速离心机（转速在（转速在40000100000r/min40000100000r/min，最大，最大RCFRCF可达可达803000g803000g）。）。n n根据离心机的性能可分为：根据离心机的性能可分为：分析型，制备型和分析制备型。分析型，制备型和分析制备型。n n转头可分为：转头可分为：角度转头，垂直转头，水平转头角度转头，垂直转头，水平转头。n n离心管及其管帽是转头重要的附件，制造离心管的材料主离心管及其管帽是转头重要的附件，制造离心管的材料主要有特种玻璃，塑料

28、和不锈钢。要有特种玻璃，塑料和不锈钢。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU12/28/202212/28/2022SWAUSWAU12/28/202212/28/2022SWAUSWAU12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第五节、制备型超速离心法n n制备型超速离心法可以用来分离细胞，亚细胞结构或高分制备型超速离心法可以用来分离细胞，亚细胞结构或高分子。根据分离的原理的不同，制备超速离心法又可分为子。根据分离的原理的不同，制备超速离心法又可分为差差速离心法和密度梯度离心法。速离心法和密度梯度离心法。n n一、一、差速离心法差速离心法 原理及操作步骤原理及

29、操作步骤：差速离心法又叫差速离心法又叫分级分离法分级分离法。装有不。装有不均一的粒子的离心管在离心机中高速旋转时，大小，密度均一的粒子的离心管在离心机中高速旋转时，大小，密度不同的粒子将以各自的不同的粒子将以各自的沉降速率沉降速率移向离心管底部。如果设移向离心管底部。如果设计一定的转速和时间，沉降速率最大的首先沉淀在离心管计一定的转速和时间，沉降速率最大的首先沉淀在离心管底部，沉降速率中等及较小的组分继续留在上清液中。将底部，沉降速率中等及较小的组分继续留在上清液中。将上清液转移到另一离心管中，提高转速并掌握一定的时间，上清液转移到另一离心管中，提高转速并掌握一定的时间，就可获得沉降速率中等的

30、组分，如此反复操作，就可实现就可获得沉降速率中等的组分，如此反复操作，就可实现对不同组分的分离。对不同组分的分离。优点优点：操作简单操作简单。缺点缺点：效率低，费时，所得组分不单一效率低，费时，所得组分不单一。12/28/202212/28/2022SWAUSWAUn n二、二、密度梯度离心法密度梯度离心法 原理原理：离心操作在离心操作在密度梯度介质密度梯度介质中进行的离心方法。根中进行的离心方法。根据操作方法的不同，密度梯度离心法又可分为据操作方法的不同，密度梯度离心法又可分为速率区带离速率区带离心和等密度梯度离心。心和等密度梯度离心。1 1、速率区带离心：速率区带离心：速率区带离心法依据样

31、品中各组分速率区带离心法依据样品中各组分沉降速率沉降速率的差别而的差别而使其互相分离。在离心管中灌制好预制的一种使其互相分离。在离心管中灌制好预制的一种正密度梯度正密度梯度介质液，在其表面铺上一层介质液，在其表面铺上一层样品溶液样品溶液，离心期间，样品中，离心期间，样品中各组分会按照它们各自的各组分会按照它们各自的速率沉降速率沉降，被分离成一系列的样，被分离成一系列的样品组分区带，故称速率区带离心。品组分区带，故称速率区带离心。预制密度梯度介质的作用有二个，一是预制密度梯度介质的作用有二个，一是支撑样品支撑样品，二，二是是防止离心过程中产生的对流对已形成区带的破坏作用防止离心过程中产生的对流对

32、已形成区带的破坏作用。但是但是样品液的密度一定要大于密度梯度介质的最大密度样品液的密度一定要大于密度梯度介质的最大密度，否则就不能使样品各组分得到有效分离。否则就不能使样品各组分得到有效分离。离心过程中，各组分的移动是相互独立的。因此，离心过程中，各组分的移动是相互独立的。因此，S S值值相差很小的组分也能得到很好的分离，这是差速离心法做相差很小的组分也能得到很好的分离，这是差速离心法做不到的。但速率区带离心不到的。但速率区带离心不适于大量制备实验。不适于大量制备实验。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU2 2、等密度梯度离心等密度梯度离心 依据粒子本身的密度差异而进行分离

33、。如果依据粒子本身的密度差异而进行分离。如果离心管中离心管中介质的密度梯度范围包括待分离样品中介质的密度梯度范围包括待分离样品中所有组分的密度所有组分的密度，离心过程中各组分将逐步移至，离心过程中各组分将逐步移至与它本身密度相同的地方形成区带，这种分离方与它本身密度相同的地方形成区带，这种分离方法称为等密度梯度离心。法称为等密度梯度离心。在等密度梯度离心中，组分的分离完全取决在等密度梯度离心中，组分的分离完全取决于组分之间的于组分之间的密度差密度差。离心时间的延长或转速提离心时间的延长或转速提高不会破坏已经形成的样品区带，也不会发生共高不会破坏已经形成的样品区带，也不会发生共沉现象沉现象。12

34、/28/202212/28/2022SWAUSWAUn n三、三、速率区带离心与等密度梯度离心的区别速率区带离心与等密度梯度离心的区别 1 1、依据的原理不同依据的原理不同 速率区带离心依据粒子的速率区带离心依据粒子的沉降速率沉降速率被分离；等密度梯被分离；等密度梯度离心依据粒子本身的度离心依据粒子本身的密度差异密度差异被分离。被分离。2 2、介质的梯度范围不同介质的梯度范围不同，速率区带离心介质的密度速率区带离心介质的密度小于小于样品中各种粒子的密度；样品中各种粒子的密度；等密度梯度离心介质密度等密度梯度离心介质密度大于大于样品各种粒子的密度。样品各种粒子的密度。3 3、时间效应不同时间效应

35、不同 速率区带离心速率区带离心不能长时间离心不能长时间离心；等密度梯度离心；等密度梯度离心长时间长时间离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第三章、层析技术 第一节、层析技术的原理第一节、层析技术的原理n n原理原理：层析技术：层析技术是层析分离技术是一种物理的分离方法，利用混合物是层析分离技术是一种物理的分离方法，利用混合物中各组份物理化学性质的差别（如吸引力，分子形状和大小，分子的中各组份物理化学性质的差别（如吸引力，分子形状和大小，分子

36、的极性，分子亲和力，分配系数等），使各组分以不同程度分布度在两极性，分子亲和力，分配系数等），使各组分以不同程度分布度在两相中（其中一相为固定相，另一相为流动相），从而使各组分以不同相中（其中一相为固定相，另一相为流动相），从而使各组分以不同速度移动而达到分离。速度移动而达到分离。n n 层析分离技术在上个世纪就已在生产实践上应用。层析分离技术在上个世纪就已在生产实践上应用。19031903年用于植年用于植物色素的分离提取，分离后的叶绿素和叶黄素等在碳酸钙的吸附柱上物色素的分离提取，分离后的叶绿素和叶黄素等在碳酸钙的吸附柱上从上到下排列成色谱，故也称为从上到下排列成色谱，故也称为“色层分离法色

37、层分离法”。19311931年，有人用氧年，有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构异构体，显示了这一分离技术化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构异构体，显示了这一分离技术的高度分辨力，从此吸引了人们的广泛关注。自的高度分辨力，从此吸引了人们的广泛关注。自19441944年应用滤纸作为年应用滤纸作为固定支持物的固定支持物的“纸层析纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快。诞生以来，层析技术的发展越来越快。19501950年以来，相继出现了气相层析，高压液相层析，薄层层析，薄膜层析，年以来，相继出现了气相层析，高压液相层析，薄层层析，薄膜层析，亲和层析，凝胶层析等亲和层析，凝胶层析等12/28/

38、202212/28/2022SWAUSWAU第三节、层析技术的分类n n分类分类：根据：根据操作形式操作形式的不同，层析技术可分为的不同，层析技术可分为纸纸层析，薄层层析层析，薄层层析和和柱层析柱层析。根据根据理化性质理化性质的不同，层析技术可分为的不同，层析技术可分为吸附层析吸附层析，分配层析分配层析，高压液相层析高压液相层析，吸附分配层析吸附分配层析，离子离子交换层析交换层析，排阻层析排阻层析，亲和层析亲和层析，气相色普层析气相色普层析。层析基本层析基本操作步骤操作步骤：1 1，选择适当的吸附剂选择适当的吸附剂 2 2，加样加样 3 3，展开展开 4 4，检出和鉴定，检出和鉴定12/28/

39、202212/28/2022SWAUSWAU第三节、薄层层析n n原理原理：以薄层板作为支持介质的层析。：以薄层板作为支持介质的层析。在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流过，从而使各组分得到分离的一端，然后让推动剂从上流过，从而使各组分得到分离的物理方法。物理方法。n n常用的常用的支持剂支持剂：硅胶：硅胶G G，硅胶，硅胶GFGF，氧化铝，纤维素，硅藻，氧化铝，纤维素，硅藻土，纤维素土，纤维素G G，交联葡聚糖凝胶等。，交联葡聚糖凝胶等。n n基本操作步骤：基本操作步骤：薄层板的准备；点样；展开；定位；定量。薄层

40、板的准备；点样；展开；定位；定量。n n应用应用：氨基酸，多肽，蛋白质及酶，维生素，核甘酸，脂：氨基酸，多肽，蛋白质及酶，维生素，核甘酸，脂肪酸，脂类，糖类，磷脂，生物碱，酚类等物质的分离肪酸，脂类，糖类，磷脂，生物碱，酚类等物质的分离n n优点优点：设备简单，操作方便，快速灵敏，分析制备兼适设备简单，操作方便，快速灵敏，分析制备兼适12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第四节、聚酰胺薄层层析n n原理原理：用于层析的聚酰胺基团有两类：锦纶：用于层析的聚酰胺基团有两类：锦纶6666（尼龙）和锦纶（尼龙）和锦纶6 6，这两类材料中都含有大量的酰，这两类材料中都含有大量的酰胺基团

41、，故统称为胺基团，故统称为聚酰胺聚酰胺。聚酰胺以其。聚酰胺以其COCO或或NHNH与极性化合物的与极性化合物的OHOH或或O O之间形成氢键之间形成氢键，从而发生从而发生吸附作用吸附作用。不同物质与聚酰胺之间形成。不同物质与聚酰胺之间形成氢键的能力不同。在聚酰胺薄膜上做层析分离时，氢键的能力不同。在聚酰胺薄膜上做层析分离时，流动相从薄膜表面流过，被分离物质在溶剂和薄流动相从薄膜表面流过，被分离物质在溶剂和薄膜之间按膜之间按分配系数分配系数的大小，发生不同速率的吸附的大小，发生不同速率的吸附与解吸过程，从而使混合物得到有序的分离。与解吸过程，从而使混合物得到有序的分离。12/28/202212/

42、28/2022SWAUSWAUn n影响影响迁移率迁移率的主要因素的主要因素 1 1、成键基团数目越多，吸附力越大、成键基团数目越多，吸附力越大 2 2、成键基团的位置，影响氢键数目和强度、成键基团的位置，影响氢键数目和强度 3 3、芳香环，共双键越多，成键越强、芳香环，共双键越多，成键越强 4 4、被分离物质分子内氢键的形成，可以削弱它与、被分离物质分子内氢键的形成，可以削弱它与聚酰胺之间氢键的形成聚酰胺之间氢键的形成 5 5、溶剂的影响、溶剂的影响 优点优点：对极性化合物有特异的分辨能力，灵敏度高，：对极性化合物有特异的分辨能力，灵敏度高，操作方便，速度快，样点不扩散，有荧光的物质操作方便

43、，速度快，样点不扩散，有荧光的物质可用紫外灯检出，不必喷显色剂显色。可用紫外灯检出，不必喷显色剂显色。用途用途：分离多种化合物，在蛋白质或肽的：分离多种化合物，在蛋白质或肽的N N末端残末端残基分析中是个比较理想的方法，对基分析中是个比较理想的方法，对丹酰氨基酸丹酰氨基酸的的分析可达分析可达10109 91010101012/28/202212/28/2022SWAUSWAU第五节、纸层析n n原理原理：依据物质在两相中：依据物质在两相中分配系数分配系数的不同进行的分离。的不同进行的分离。分配系数是指一种溶质在两种互不相容的溶剂中达到平衡分配系数是指一种溶质在两种互不相容的溶剂中达到平衡时，该

44、物质在固定相和流动相中的浓度比，时，该物质在固定相和流动相中的浓度比，K=CK=C固固/C/C液液 分配系数分配系数K K与温度，压力，溶质和溶剂有关。在同一条与温度，压力，溶质和溶剂有关。在同一条件下，各种物质的分配系数不同，因此可以用纸层析进行件下，各种物质的分配系数不同，因此可以用纸层析进行分离。分离。纸层析以滤纸为介质滤纸纤维和水有较强的亲和力，纸层析以滤纸为介质滤纸纤维和水有较强的亲和力，能吸收能吸收2222左右的水，其中左右的水，其中6 67 7的水以氢键形式与纤维的水以氢键形式与纤维的羟基结合，在一般条件下较难脱去。而滤纸纤维与有机的羟基结合，在一般条件下较难脱去。而滤纸纤维与有

45、机溶剂的亲和力较弱，所以纸层析实际上是以滤纸纤维及其溶剂的亲和力较弱，所以纸层析实际上是以滤纸纤维及其结合水作为固定相，以其有机溶剂作为流动相。当有机相结合水作为固定相，以其有机溶剂作为流动相。当有机相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水相和有机相之沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水相和有机相之间进行分配，一部分溶质离开原点随着有机相移动，进入间进行分配，一部分溶质离开原点随着有机相移动，进入无溶质区，此时又进行重新分配，沿着有机相方向移动。无溶质区，此时又进行重新分配，沿着有机相方向移动。溶质中各种不同组分有不同的分配系数，移动速度也不同，溶质中各种不同组分有不同的分配系数，移动速度也

46、不同，从而使混合物得到分离。从而使混合物得到分离。12/28/202212/28/2022SWAUSWAUn n影响迁移率的主要因素影响迁移率的主要因素 1 1、物质结构与极性、物质结构与极性 2 2、层析溶剂、层析溶剂 3 3、PHPH值值、温度、温度、展开方式、展开方式n n纸层析的应用：既可以用来定性，也可以用来定纸层析的应用：既可以用来定性，也可以用来定量。量。1 1、剪洗法、剪洗法 2 2、扫描法、扫描法12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第六节、凝胶层析n n一、一、原理原理：又称：又称凝胶过滤凝胶过滤，是一种，是一种柱层析柱层析方法。方法。层析柱中装有水不溶凝

47、胶颗粒，颗粒内部形成多层析柱中装有水不溶凝胶颗粒，颗粒内部形成多孔的三维网状结构，凝胶是高度亲水的，在水溶孔的三维网状结构，凝胶是高度亲水的，在水溶液里吸水膨胀，当在胶床表面加上分子大小不同液里吸水膨胀，当在胶床表面加上分子大小不同的样品混合物并用洗脱液洗脱时，直径的样品混合物并用洗脱液洗脱时，直径小于小于网孔网孔的自由通透小分子可以进入胶粒内部，需层层扩的自由通透小分子可以进入胶粒内部，需层层扩散，流过的路程比较散，流过的路程比较长，最后流出长，最后流出；而直径；而直径大于大于网孔直径的大分子不能进入胶粒内部，沿着胶粒网孔直径的大分子不能进入胶粒内部，沿着胶粒的间隙向下流出，所经路程的间隙向

48、下流出，所经路程短短，最先流出最先流出；通透通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出，从而按从大到小的顺序实现对从而按从大到小的顺序实现对大中小大中小分子的分离。分子的分离。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU12/28/202212/28/2022SWAUSWAU12/28/202212/28/2022SWAUSWAUn n二、常用的二、常用的凝胶材料凝胶材料：交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯：交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯等。酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯等。n n三、三、操作步骤操作步

49、骤 1 1、凝胶的选择和处理、凝胶的选择和处理 2 2、凝胶柱的制备、凝胶柱的制备 3 3、加样、加样 4 4、洗脱、洗脱 5 5、凝胶柱的再生和保存、凝胶柱的再生和保存 四、四、优点优点：操作条件温和，适于分离不稳定的化合物，回：操作条件温和，适于分离不稳定的化合物，回收率高，分离效果好，重现性强，分离需时短，收率高，分离效果好，重现性强，分离需时短，柱可反复柱可反复使用使用。n n五、五、用途：用途：广泛用于生化物质的分离，脱盐，制备，广泛用于生化物质的分离，脱盐，制备，分子分子质量的测定质量的测定等。等。12/28/202212/28/2022SWAUSWAU第七节、离子交换层析n n一

50、、原理一、原理：在含有可与：在含有可与周围介质周围介质进行离子交换的进行离子交换的基质上进行化合物分离的方法叫基质上进行化合物分离的方法叫离子交换层析离子交换层析。离子交换层析是根据物质的离子交换层析是根据物质的酸碱性，极性酸碱性，极性，和，和分分子的大小子的大小的差异而进行的的差异而进行的柱层析柱层析技术。技术。n n二、二、离子交换材料离子交换材料：阳离子交换树脂阳离子交换树脂和和阴离子交阴离子交换树脂换树脂。带有酸性可电离基团的以。带有酸性可电离基团的以SO3HSO3H表示，表示，称为称为阳离子交换树脂阳离子交换树脂；带有碱性可以电离基团以；带有碱性可以电离基团以R4NOHR4NOH表示