生物化学分析鉴定方法.ppt

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1、第三章第三章生物化学分析鉴定方法生物化学分析鉴定方法2 2蛋白质蛋白质n本章内容概要及要求：本章内容概要及要求：第一节：蛋白质的分析鉴定第一节：蛋白质的分析鉴定一、蛋白质理化性质测定一、蛋白质理化性质测定（一）蛋白质含量测定（一）蛋白质含量测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定（三）蛋白质纯度测定（三）蛋白质纯度测定二、蛋白质鉴定二、蛋白质鉴定（一）蛋白质免疫印迹（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）（二）蛋白质序列分析（二）蛋白质序列分析（三）蛋白质结晶（三）蛋白质结晶三、三、同工酶测定同工酶测定四、四、酶学分析在临床诊断上的应用酶学分析在

2、临床诊断上的应用第五节第五节 酶活性测定最适条件的选择酶活性测定最适条件的选择在在蛋蛋白白质质分分离离纯纯化化过过程程中中，需需要要对对蛋蛋白白质质的的含含量量和和纯纯度度不不断断进进行行检检测测，通通过过优优化化纯纯化化方方法法获获得得高高含含量量、高高纯纯度度的的蛋蛋白白质质产产品品，为为蛋蛋白白质质的的结结构构、功功能能分分析析及及产产品品开开发提供材料。发提供材料。为为了了鉴鉴定定某某种种微微量量蛋蛋白白质质在在样样品品中中的的存存在在，常常采采用用蛋蛋白白质质免免疫疫印印迹迹的的方方法法，利利用用抗原抗体的特异性来鉴定。抗原抗体的特异性来鉴定。此此外外，还还可可测测定定蛋蛋白白质质的

3、的氨氨基基酸酸序序列列，对其生物学功能进行鉴定等。对其生物学功能进行鉴定等。一、蛋白质理化性质测定一、蛋白质理化性质测定（一）蛋白质含量测定（一）蛋白质含量测定（1）凯氏定氮：是最经典的蛋白质含量测定方法。）凯氏定氮：是最经典的蛋白质含量测定方法。氮素含量除16，或乘6.25即为蛋白质含量。适于较纯，粗蛋白值偏高。此法操作比较复杂，目前已不常用。（2）双缩脲法：快速不需十分精确。）双缩脲法：快速不需十分精确。原理：原理：两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成紫红色络合物，540nm波长最大吸收，值大小与蛋白质浓度成正比。含有两个或两个以上肽键肽键的化合物，能发生同样的反应，肽键的反应，肽键越多颜色

4、越深特点特点：受蛋白质特异性影响小应用：应用：蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度，测定范围在测定范围在mg/mL作用作用（3）福林）福林-酚法（酚法（Lowry）：多年被选为蛋白质标准测定方法。）：多年被选为蛋白质标准测定方法。原理：原理：蛋白质与双缩脲试剂形成络合物后，蛋白质中的酪氨酸，色氨酸及半胱氨酸会使磷钼酸一磷钨酸还原生产蓝色物质，在650nm最大吸收，与蛋白质浓度成正比。特点：特点：灵敏度比双缩脲法提高提高10倍左右倍左右，缺点是试剂的配制较为困难，费时间较长，很多物质对此法有干扰，比较适合于较纯蛋白的含量测定。（一）蛋白质含量测定（一）蛋白质含量测定（4）紫外吸收法：此法简便快速。

5、）紫外吸收法：此法简便快速。通过测定样品的紫外吸收值，根据经验公式或标准曲线也可以测定蛋白质含量。此法测定简单，而且不破坏样品，样品测定后可以再利用，缺点是样品中的核酸，高浓度缓冲液等具有紫外吸收的物质会干扰测定，引起实验误差。A、280nm和和260nm的吸收差法：的吸收差法：蛋白质在280nm波长有最大吸收，而核酸在260nm波长有最大吸收，对于较粗的蛋白质样品，可以利用280nm及260nm吸收差，用下列经验公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度蛋白质浓度(mgmL)1.45A280nm0.74A260nmB、215nm和和225nm的吸收差法：的吸收差法：蛋白质的肽键在230nm波长以下有强吸

6、收。其吸收值与蛋白质浓度成正比。对稀溶液中蛋白质浓度的测定，可用下列经验公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度蛋白质浓度(mgmL)0.144(A215nm一一A225nm)该法虽然灵敏度较高，但是干扰物质较多。酪氨酸的酪氨酸的 max275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm，257=2.0 x102;色氨酸的色氨酸的 max280nm，280=5.6x103;光吸收：光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有、和有吸收光的能力。（一）蛋白质含量测定（一）蛋白质含量测定（5）考马斯

7、亮蓝染色法（）考马斯亮蓝染色法（Bradford）：目前应用最广。）：目前应用最广。原理：原理：考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，最大光吸收在488nm，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色，在595nm有最大吸收，大小与蛋白质浓度成正比。特点：特点：此法测定简单，只要将蛋白质样品加到染料试剂中，即可进行比色测定。其灵敏度与福林-酚法相当，测定浓度范围在0.011.0mg/mL。高浓度缓冲液、尿素、甘油、蔗糖、硫酸铵等对测定有干扰。应用：应用：该方法是目前应用最广的蛋白质测定方法之一。（6）胶体金测定法：是灵敏度最高的蛋白质测定方法。）胶体金测定法：是灵敏度最高的蛋白质测定方法。测

8、定浓度范围为ng/mL水平。胶体金本身呈洋红色，与蛋白质结合后转变为蓝色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，缺点是成本较高。n蛋白质理化性质测定蛋白质理化性质测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定分子量目前常用：分子量目前常用：1、分子筛层析法：、分子筛层析法：可以测定活性多亚基蛋白质的相对分子量。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：、聚丙烯酰胺凝胶电泳：也可测定活性多亚基蛋白的相对分子量，但由于蛋白质的迁移率还受到分子形状、所带电荷等的影响，因此测定的分子量不够准确。3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：测定变性蛋白质中单亚基相对分子量的最有效最常用的方法。4、

9、此外，还可以根据蛋白质特殊元素组成计算法、氨基酸序列推导法、此外，还可以根据蛋白质特殊元素组成计算法、氨基酸序列推导法、渗透压法、沉降法、质谱法等。渗透压法、沉降法、质谱法等。蛋白质等电点：蛋白质等电点：等电聚焦电泳法主要方法，等电聚焦电泳法主要方法，通过等电点沉淀可以测定蛋白质等电点的大致范围，通过蛋白质氨基酸序列以可直接预测蛋白质的等电点。生物信息法：生物信息法：http:/www.expasy.ch/（一）蛋白质含量测定（一）蛋白质含量测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定（二）蛋白质相对分子量及等电点测定（三）蛋白质纯度测定（三）蛋白质纯度测定1、色谱法：如、色谱法：如HPLC如果制备

10、蛋白酶，需要利用的是蛋白酶的活性，只要其中的杂质不影响酶的活性即可，此时可以利用柱层析表示其纯度，在特定条件下，层析图谱只有一个或少数几个洗脱峰，也就是达到了色谱色谱纯纯，可以满足常规的酶活分析等。如果通过结晶与再结晶的方法纯化蛋白质，则得到的蛋白质则为结晶纯结晶纯，获得的晶体可用于蛋白质三维结构分析。2、SDS-PAGE法：法：通常情况下，蛋白质的纯度采用SDS-PAGE法。凝胶经过染色脱色后，用目标蛋白质条带占整个泳道蛋白条带的百分比来表示目标蛋白的纯度。二、蛋白质鉴定二、蛋白质鉴定为了研究蛋白质的结构与功能，需要对蛋白质进行鉴定。为了研究蛋白质的结构与功能，需要对蛋白质进行鉴定。蛋白质鉴

11、定的方法有多种，比如蛋白质鉴定的方法有多种，比如1.成份测定（氨基酸组成及其含量），序列测定成份测定（氨基酸组成及其含量），序列测定2.理化特性分析（蛋白质分子量，等电点，密度，变性与复性，结晶理化特性分析（蛋白质分子量，等电点，密度，变性与复性，结晶等）、等）、3.生物活性及功能测定（比如酶活性分析，通过转基因技术进行突变生物活性及功能测定（比如酶活性分析，通过转基因技术进行突变回复等），回复等），对于一个蛋白质的鉴定，往往需要上述多种方法共同使用，相互印证，才对于一个蛋白质的鉴定，往往需要上述多种方法共同使用，相互印证，才能最终证明一个蛋白质是什么。能最终证明一个蛋白质是什么。序列测定：可

12、以一步确定某一个蛋白，但蛋白质序列测定需要高纯度的蛋序列测定：可以一步确定某一个蛋白，但蛋白质序列测定需要高纯度的蛋白，测序代价极高，因此其应用受到了较大的限制。白，测序代价极高，因此其应用受到了较大的限制。免疫活性分析（蛋白质免疫印迹）：鉴定一个蛋白质，不仅弥补了传统鉴免疫活性分析（蛋白质免疫印迹）：鉴定一个蛋白质，不仅弥补了传统鉴定方法需要多方印证的繁琐，而且代价相比于蛋白质测序要低的多，定方法需要多方印证的繁琐，而且代价相比于蛋白质测序要低的多，是目前使用最广泛的蛋白质鉴定方法之一。是目前使用最广泛的蛋白质鉴定方法之一。n蛋白质鉴定蛋白质鉴定（一）蛋白质免疫印迹（一）蛋白质免疫印迹（We

13、stern-Blotting）（二）蛋白质序列分析（二）蛋白质序列分析（三）蛋白质结晶（三）蛋白质结晶n蛋白质鉴定蛋白质鉴定（一）蛋白质免疫印迹（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）http:/210.38.57.228/151/re1/mei/html/jbzs/jb_index_elisa.htm免疫印迹（westernblotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。（一）蛋白质免疫印迹（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）典型的印迹实验包括三个步

14、骤：蛋白质的电泳分离将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。（一）蛋白质免疫印迹（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）典型的印迹实验包括三个步骤具体解析：第一阶段为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶

15、段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（12A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。n蛋白质鉴定蛋白质鉴定（一）蛋白质免疫印迹（一）蛋白质免疫印迹（Western-Blotting）（

16、二）蛋白质序列分析（二）蛋白质序列分析（三）蛋白质结晶（三）蛋白质结晶三、蛋白质组研究的相关技术三、蛋白质组研究的相关技术（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：2-D电泳电泳1.1975年，年，Patrick OFarrel发明了二维凝胶电泳。发明了二维凝胶电泳。2.操作操作（1）等电聚焦。）等电聚焦。（2）平衡胶条。）平衡胶条。（3）第二）第二相相SDS-PAGE。3.2-D胶上蛋白质鉴定胶上蛋白质鉴定（1）早期）早期Western blot鉴定鉴定（2）Edman降解法鉴定降解法鉴定（3）肽质量指纹（）肽质量指纹（peptide-mass

17、fingerprinting）技术技术 鉴定鉴定（4）蛋白质组信息学）蛋白质组信息学2D電泳Mass定序分析（三）蛋白质序列测定（三）蛋白质序列测定 肽序列分析的基本步骤：肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。）测定头尾氨基酸。（3）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解降解 蛋白质测序发展简史蛋白质测序发展简史1.英国科学家英国科学家Sanger测序（测序（20世纪世纪50年代）。年代）。2.建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（建立色谱技术和定量

18、氨基酸分析技术（20世纪世纪50年代）。年代）。3.Edman降解（降解（20世纪世纪70年代出现）。年代出现）。仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。进入进入20世纪世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。单和操作方便。4.20世世纪纪70年年代代，华华裔裔学学者者张张瑞瑞

19、耀耀提提出出的的有有色色Edman试试剂剂DABITC，使手工测序技术更加灵敏可靠。使手工测序技术更加灵敏可靠。5.对对2-D胶胶上上的的点点进进行行测测序序：将将蛋蛋白白质质转转印印到到PVDF（聚聚偏偏二二氟氟乙乙烯烯）膜膜上上，然然后后将将膜膜片片放放入入测测序序仪仪的的反反应应室室中中进进行行Edman降解。降解。6.毛毛细细管管电电泳泳技技术术（20世世纪纪90年年代代发发展展起起来来的的微微量量分分析析技技术术）的的采采用用，是是蛋蛋白白质质N端端微微量量顺顺序序测测定定方方法法学学一一个个引引人人注注目的发展。目的发展。其其灵灵敏敏度度比比HPLC高高两两个个数数量量级级。可可在

20、在10fmol的的水水平平检检测测氨氨基基酸酸。微微型型测测序序仪仪与与毛毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。7.蛋蛋白白质质C端端测测序序：C端端测测序序的的重重要要性性：为为PCR扩扩增增出出某某一一蛋蛋白白的的完完整整基基因因提提供供合合成成C端端引引物物的的重重要要依依据据；以以及及为为基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。基因表达的蛋白质的鉴定提供关键的证据等。（1）最成功的方法是在）最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。（2）直直到到20世

21、世纪纪90年年代代初初由由于于发发展展出出一一些些新新的的偶偶联联和和裂裂解解试试剂剂，配配合合用用HPLC对对乙乙酰酰内内硫硫脲脲氨氨基基酸酸（TH）的的鉴鉴定定，该该方方法法才才得得以以较较快快地地发发展展。目目前前已已有有自自动动化化C端端测测序序仪仪，能常规地进行能常规地进行6-8个残基的个残基的C端顺序测定。端顺序测定。8.质谱法用于蛋白质顺序测定：质谱法用于蛋白质顺序测定：（1）必必要要性性：DNA顺顺序序测测定定解解决决不不了了翻翻译译后后加加工工所所导导致致的的氨氨基基酸酸残残基基的的修修饰饰问问题题，Edman降降解解不不能能解解决决N端端封封闭闭肽肽的的测序问题，而质谱法能

22、使上述问题迎刃而解。测序问题，而质谱法能使上述问题迎刃而解。（2）20世世纪纪80年年代代初初出出现现快快原原子子轰轰击击质质谱谱（FAB质质谱谱）能能准准确确确确定定的的分分子子量量达达到到数数千千。相相继继发发展展的的串串行行质质谱谱可可以以把把FAB得得到到的的分分子子离离子子进进行行再再一一次次惰惰性性原原子子轰轰击击，使使肽肽链链在在不不同同部部位位断断裂裂从从而而得得到到一一组组片片段段的的质质谱谱信信息息，使使多多肽肽顺顺序序测定得以实现。测定得以实现。（3）20世世纪纪80年年代代末末出出现现了了电电喷喷雾雾质质谱谱和和基基质质辅辅助助激激光光解解吸吸电离电离-飞行时间质谱。飞

23、行时间质谱。电电喷喷雾雾质质谱谱测测定定分分子子量量数数万万的的蛋蛋白白质质准准确确度度可可达达万万分分之之一一，主主要要优优点点是是可可与与HPLC仪仪实实现现液液质质联联用用，因因而而能能使使一一个个蛋蛋白白质质的的酶解产物在得到酶解产物在得到HPLC肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。肽谱的同时得到一张精确的肽质量谱。飞行时间质谱能对分子量达飞行时间质谱能对分子量达30万道尔顿的分子进行准确质谱万道尔顿的分子进行准确质谱分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学分析。误差率可精确到十万分之一，因而该技术对蛋白质化学结构分析已呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的结构分析已

24、呈现极大应用前景。该技术结合羧肽酶或氨肽酶的应用可成功地进行蛋白质应用可成功地进行蛋白质C端与端与N端的顺序测定，该方法一个端的顺序测定，该方法一个显著的优点是用样品量极微（显著的优点是用样品量极微（1-2pmol），），且非常快速，每次且非常快速，每次质谱分析只需数分钟。质谱分析只需数分钟。9.质质谱谱技技术术不不能能完完全全取取代代Edman降降解解与与其其他他蛋蛋白白质质分分析析方方法法。通常是联合运用这些技术。通常是联合运用这些技术。10.蛋白质测序展望：蛋白质测序展望：（1）N 端测序仪在灵敏度上还需提高。端测序仪在灵敏度上还需提高。（2）C 端端测测序序技技术术需需要要更更新新型型

25、的的偶偶联联试试剂剂和和更更有有效效的的裂裂解解方法。方法。（3）质谱技术将有令人刮目相看的作为。质谱技术将有令人刮目相看的作为。（4）一一些些新新的的分分析析技技术术很很可可能能进进入入蛋蛋白白质质顺顺序序分分析析领领域域，如多维核磁共振方法。如多维核磁共振方法。蛋白质组：蛋白质组：一种细胞、组织或完整的一种细胞、组织或完整的生物体生物体所拥有的全套的蛋白质所拥有的全套的蛋白质基因组基因组基本是固定不基本是固定不变的变的,蛋白质组却是动态的蛋白质组却是动态的,具有时空性和可调节性具有时空性和可调节性,能反映出特定基因的表达时能反映出特定基因的表达时间、表达量以及蛋白质翻译后的加工修饰和亚细胞

26、分布等。间、表达量以及蛋白质翻译后的加工修饰和亚细胞分布等。三大基本三大基本支撑技术支撑技术：双向电泳双向电泳技术技术(2-DE)计算机成像数分析与大规模计算机成像数分析与大规模数据处理数据处理技术以技术以质谱技术质谱技术蛋白质组的研究：蛋白质组的研究：是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。基因组基因

27、组：是指一个细胞是指一个细胞单倍型单倍型(haploidy)所含的全部所含的全部遗传信息遗传信息,即即DNA或或RNA编码的遗编码的遗传信息传信息.蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和蛋白质组学：是指研究细胞或机体全部蛋白质的表达及其活动方式(包括翻译后修饰、转运定位、结构变化、蛋白质间及其他相互作用等)一、一、双向电泳双向电泳二、二、质谱技术质谱技术（一）概念：（一）概念：质谱（质谱（MassSpectrometry,MS）是带电原子、分子或分子碎片按是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。的大小顺

28、序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。生物质谱技术生物质谱技术电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于

29、小分子物质研究的质谱技术电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol（10-12甚至甚至fmol（10-15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，的生物大分子成为可能，从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域，并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。（二）分类

30、（二）分类1、电喷雾质谱技术、电喷雾质谱技术（ElectrosprayIonizsationMassSpectrometry,ESI-MS）电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用（LCMS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。2、基质辅助激光解吸附质谱技术、基质辅助激光解吸附质谱技术基质辅助激光解吸附质谱技术（MatriXAssistedLaserDesorption/Ionization,MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基

31、质和分析物膨胀并进入气相。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。3、快原子轰击质谱技术、快原子轰击质谱技术（FastAtomBomebard-mentMassSpectrometry,FABMS）。4、同位素质谱、同位素质谱（三）生物质谱应用（三）生物质谱应用随着质谱技术的不断改进和完善，质谱的应用范围

32、已扩展到生命科学研究的随着质谱技术的不断改进和完善，质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域，特别是质谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的许多领域，特别是质谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的应用，不仅为生命科学研究提供了新方法，同时也促进了质谱技术的发展。应用，不仅为生命科学研究提供了新方法，同时也促进了质谱技术的发展。、应用于蛋白质：、应用于蛋白质：1、蛋白质分子量的测定MALIMS技术以其极高的灵敏度、精确度很快在生物医学领域得到了广泛的应用，特别是在蛋白质分析中的应用，至今已被分析的蛋白质已有数百种之多，不仅可测定各种亲水性、疏水性及糖蛋白等的分子量，还可直

33、接用来测定蛋白质混合物的分子量，也能被用来测定经酶等降解后的混合物，以确定多肽的氨基酸序列。可以认为这是蛋白质分析领域的一项重大突破。2、蛋白质组研究蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一，除了用于多肽、蛋白质的质量测定外，还广泛地应用于肽指纹图谱测定以及氨基酸序列恻定等。3、肽指纹图谱（PePtideMassFingerprinting,PMF）测

34、定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法，对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进行比较，从而判别所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。对肽序列的测定往往要通过串联质谱技术才能达到分析目的，它采用不同的质谱技术选择具有特定质荷比的离子，并对其进行碰撞诱导解高，通过推断肽片的断裂，即可导出肽序列、应用于核酸、应用于核酸常规的色谱或电泳技术只能对其浓度和纯度进行分析，而对其碱基组成、序列等结构信息却无能为力。ESI和MALDI质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了强有力的方法，它是将被测寡核

35、苷酸样品先用外切酶从3或5端进行部分降解，在不同时间内分别取样进行质谱分析，获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号，通过对相邻两个碎片分子质量进行比较，可以计算出被切割的核苷酸单体分子质量，将其与四个脱氧苷酸的标准分子量进行对照，就可以读出寡核苷酸的序列。由于MALDI技术分辨率的问题，使得其更适合于减基数较少的短链核酸的分析。、质谱与临床医学、质谱与临床医学除了应用于蛋白质和核酸研究以外，质谱还以其灵敏度和高分辨率在临床医学检直中得到了广泛的应用，如对药物代谢产物的动态分析，癌细胞蛋白质的鉴定，同位素标记物的检测等。其中用同位素14C标记的14C-尿素呼吸试验和15N标记的15N-排泄试验已成

36、为临床检测胃幽门螺杆菌（HP）的有效手段。、质谱与检测、质谱与检测随着生物工程技术的发展，大量的生物工程产品不断出现，传统的测定分子量及纯度的方法已不能担当此重任，现在人们把MALDI-TOF-MS应用于此领域，得到了很好的效果。蔡耘等用上述技术对重组的人表皮生长因子（hEGF）白细胞介素-3（IL3）、肿瘤坏死因子（TNF）粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、粒细胞集落刺激因子（GCSF）碱性成纤维生长因子（bFGF）等六种基因工程产品进行了测定，获得了准确的分子量信息及纯度信息，这为基因工程产品的检测研究开辟了一条新途径。denovodenovo”来源于拉丁文，意思是来源于拉丁文，意

37、思是“创新创新根据离子的二级质谱和三级质谱的谱图，确定含有的氨基酸数量和种类，然后进根据离子的二级质谱和三级质谱的谱图，确定含有的氨基酸数量和种类，然后进行实际的谱图和理论谱图进行比对然后给出序列，通过这种方式不仅可以测行实际的谱图和理论谱图进行比对然后给出序列，通过这种方式不仅可以测序，还可以确定蛋白翻译后修饰（序，还可以确定蛋白翻译后修饰（PTM）分析。）分析。denovo从头测序是生物学家的名称从头测序是生物学家的名称，化学家一般称为，化学家一般称为LC-MS/MS测序测序DENOVO是对于数据库里面没有蛋白或者相应核酸序列是对于数据库里面没有蛋白或者相应核酸序列,所以通过对于多肽碎片所以通过对于多肽碎片的分析的分析,从而知道它的氨基酸序列从而知道它的氨基酸序列.但是对于具有相同质量数的但是对于具有相同质量数的LEU和和ILE,对给对给序列分析带来一些困难序列分析带来一些困难.泛素泛素Ubiquitin：http:/