课题3　血红蛋白的提取和分离 (4).ppt

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1、课题课题3 血红蛋白的提取和血红蛋白的提取和分离分离考纲内容：考纲内容：1.说出色谱法、电泳法等分离生物大分说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。子的基本原理。2.用流程图表示并体验血红蛋白的提取用流程图表示并体验血红蛋白的提取和分离过程。和分离过程。蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子分子的形状和大小的形状和大小、所带、所带电荷的性质电荷的性质和和多少多少、溶解度溶解度、吸附性质吸附性质和对其他分子的和对其他分子的亲和亲和力力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种类不同种类的蛋白的蛋白质。质。一、一、基础知识

2、基础知识（一）（一）凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1.1.概念：概念：根据被分离物质的蛋白质根据被分离物质的蛋白质相对分相对分子质量子质量的大小，利用具有的大小，利用具有网状结构网状结构的的凝胶，来进行分离。凝胶，来进行分离。2.2.凝胶：凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类多糖类化合物化合物（如（如葡聚糖葡聚糖或或琼脂糖琼脂糖）构成的多孔）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道小球体，内部有许多贯穿的通道（三维网状结构三维网状结构）。）。琼脂：红藻中提取的多糖。琼脂：红藻中提取的多糖。（主要成分：（主要成分：琼脂糖琼脂糖、琼脂胶琼脂胶）琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的琼

3、脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶大分子凝胶 。3.3.凝胶色谱法的原理：凝胶色谱法的原理：相对分子量较相对分子量较小小的蛋白质的蛋白质容易进入容易进入凝胶内部的通道，路程较凝胶内部的通道，路程较长长，移动速，移动速度较度较慢慢;相对分子量较相对分子量较大大的蛋白质的蛋白质无法进入无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较动，路程较短短，移动速度较，移动速度较快快。结果：结果：相对分子质量相对分子质量不同的蛋白质分子不同的蛋白质分子因此得以因此得以分离分离。思考：凝胶颗粒在色谱柱中填得十分思考：凝胶颗粒在色谱柱中填得十分紧密。为什么？紧密。为什么？

4、如果装填不够紧密、均匀，就会如果装填不够紧密、均匀，就会形成形成无效的空隙无效的空隙，使本该进入凝胶内，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，影部的样品分子从这些空隙中通过，影响分离效果。响分离效果。4.4.凝胶色谱法凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的具体过程：的具体过程：蛋白质混蛋白质混合物上柱合物上柱洗脱洗脱大分子移动速度快，大分子移动速度快，小分子移动速度慢小分子移动速度慢收集大分子收集大分子收集小分子收集小分子具体过程：具体过程：1.1.作用作用:能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，维持值的影响，维持PHPH基本不变。基本不变。（二）缓冲溶液（二

5、）缓冲溶液2.2.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2种种缓冲剂缓冲剂溶解于溶解于水水中配制中配制而成。调节缓冲剂的而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制就可以制得在不同得在不同PHPH范围范围内使用的缓冲液。内使用的缓冲液。3.3.在本课题中使用的缓冲液是在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液磷酸缓冲液 （成分：（成分：磷酸二氢钠磷酸二氢钠与与磷酸氢二钠磷酸氢二钠）（三）（三）电泳电泳1.1.概念：概念：带电粒子在带电粒子在电场电场作用下发生迁移作用下发生迁移的过程。的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离

6、的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基团会带上下，这些基团会带上正电正电或或负电负电。在电场的作用下，这些带电分子在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带会向着与其所带电荷电荷相反的电极移动。相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种电泳利用了待分离样品中各种分子分子带电性质的差异带电性质的差异以及以及分子本身的分子本身的大小大小、形状形状的不同，使带电分子产生的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。种分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。

7、1、在测定蛋白质分子量时常用、在测定蛋白质分子量时常用（SDS）聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。2、聚丙烯酰胺凝胶是由单体、聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺丙烯酰胺和和交联剂交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成的具有的作用下聚合交联成的具有三三维网状结构维网状结构的凝胶。的凝胶。4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2 2、原理：、原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带移率取决于它所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。3.SDS作用机理作用机理:

8、SDS能使蛋白质发生能使蛋白质发生完全变性完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会的作用下会解聚解聚成成单条肽链单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是单条肽链单条肽链的分子的分子量。量。SDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDS复合物复合物，SDS所带所带负电荷负电荷的的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使荷差别，使电泳迁移率电泳迁移率完全取决于完全取决于分分子的大小子的大小。4、过程、过程蛋白质基蛋白质基团（带电）团（带

9、电）加入加入SDS一定一定PH蛋白质蛋白质-SDS复合物复合物迁移率迁移率取决于取决于形成形成蛋白质分蛋白质分子大小子大小+N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应SDS：十二烷基硫酸钠。：十二烷基硫酸钠。是一种是一种阴离子阴离子去垢剂，与蛋白质结合，去垢剂，与蛋白质结合，形成形成SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物。带负电，向正。带负电，向正极移动。极移动。使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳测定凝胶电泳测定蛋白质的分子量蛋白质的分子量时，可选用一组时，可选用一组已知已知分分子量的子量的标准蛋白标准蛋白同时同时进行电泳，根据已进行电泳，根据已知分子量的知分子量的标准蛋白标准蛋白的电泳区带位置，的电泳区带位置，可以可以测定测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。市场上的分子量。市场上有有高分子量高分子量、次高分子量次高分子量及及低分子量低分子量的的标准蛋白试剂出售。标准蛋白试剂出售。用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法