DB62∕T 2948-2018 马铃薯种质资源离体保存技术规程(甘肃省).pdf

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1、ICS 65.020.01 B 05 甘肃省地DB62 万析、准DB62/T 2948-2018 马铃薯种质资源离体保存技术规程2018-11-23发布2019一01一01实施甘肃省市场监督管理局发布0862/T 2948-2018 目;欠前言II I 范围.1 2 规范性引用文件-.1 3 缩略语1 4 术语和定义.1 5 组织培养.2 6 离休保存.4 I DB62/T 2948-2018 目IJ1=1 本标准按照GB厅1.1-2009给出的规则起草。本标准由甘肃省农业科学院提出。本标准由甘肃省粮食作物栽培标准化技术委员会归口。本标准起草单位:甘肃省农业科学院马铃薯研究所。本标准主要起草人

2、齐恩芳、吕和平、文国宏、贾小霞、文IJ石、王敏、李高峰、李建武、张武、黄伟。II 0862/T 2948-2018 马铃薯种质资源离体保存技术规程1 范围下列文件对于凡是不注日期的GB 18133 定义，组织培养、离休保存等技术规体离质4旧t4旧tf东付1千古厅1薯薯铃铃马马了子定用规适准准标标本本程2 规范性引用文件的版本适用于本文件。3 宿略语PVA,PVM PLRV PSTVd,DAS-ELISA enzyme linked immunosorbent assay,R-PAGE，双向4 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。4.1 外植体用于马铃薯茎尖培养的幼芽段。4.2 培养基种人工配

3、制的、适合培养材料生长繁殖的混合养料。主要由定比例的无机盐、有机物、黑糖、植物生长调节剂组成，其中不加凝固剂呈液态的培养基质称为液体培养基，加入凝固剂呈固态的培养基质称为固体培养基。1 0862/T 2948-2018 4.3 母液把培养基中的各种大量元素用量扩大10倍，微量元素、有机元素和植物生长调节剂等用量扩大100倍，分别或混合j自解制成的浓缩液。4.4 脱毒试管苗在无菌条件下，应用茎尖分生组织培养技术获得的，不带PVX、PVY、PVS、PVA、PLRV、PVM病毒和PSTVd类病毒，在封闭容器内繁殖的试管苗。4.5 试管薯脱毒苗经诱导培养，直接在试管内结的小薯。4.6 离体保存将试管苗

4、、试管薯等植物组织培养物储存在使其抑制生长或无生长条件下，达到保存目的的方法。5 组织培养5.1 培养基制备5.1.1 母液的配制和保存称量按照配方称取药品。每称好一种药品应作一记号。i自解用蒸馆水或双蒸水等纯度较高的水i窑解药品。有些药品不易棍子水，可以加热并不断搅拌促使i窑解，再加水定容。配制母液可配成10倍100倍。各种药品必须在充分i自解后才能混合，同时在混合时要注意先后次序，把Ca+、陆1+、Ba+和S042、P043错开，以免生成硫酸钙、硫酸顿、磷酸钙、磷酸镜等沉淀。在混合各种无机盐时，其稀释度要大，慢慢地混合，同时边混合边搅拌，最后定容。保存配制好的母液瓶应分别贴上标签，注明母液

5、名称，配制倍数、日期及配制人姓名。母液最好在20C40C的冰箱中贮存，有机类物质贮存时间不宜过长，无机盐母液在一个月内用完。发现有霉菌深沉产生，则不能再使用。5.1.2 培养基制备程序水、母液、糖、琼脂混合pH周试加热i窑解 试管水洗干燥分装加封口材料高压灭菌i令却凝固接种5.1.3 pH值的调整培养基配好后，应随即进行pH值的调试。一般用酸度i十或精密pH试纸测试。培养基pH值小子5用1M的氢氧化纳调节，pH 值大子7用1M的盐酸调节，一般pH周至5.86.2。5.1.4 培养基的分装培养基封装于试管中，加盖硅胶塞。5.1.5 培养基的灾菌2 0862/T 2948-2018 试管置于高压蒸

6、汽灭菌锅，于1.105Kpa，121C灭菌15min20min。5.2 无菌操作5.2.1 灾菌用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌;玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌;空间采用紫外线和熏蒸灭茵;工作台面用紫外线照射及75%酒精啧雾灭菌;植物材料表面用消毒剂灭菌。5.2.2 无菌操作注意事项接种用甲腔熏蒸接种室;用实验服和拖鞋，洗净接种时，接种人员双5.3 脱毒复壮5.3.1 选材5.3.2 5.3.3 5.3.4 热处理化，31C条件下活力。5.3.5 茎尖剥离无菌条件下，剪点，切取带l个2个叶原基，大小5.3.6 茎尖组织培养以及台上的紫外灯;接种员换穿专作台面和接种工具进行消毒;用纱布罩住自来币!

7、7min8min(或，温度37C条件下培养31 C可提高分化茵的生叶，露出带有叶原基的圆滑生长于茎尖培养基上。温度23C土2C，湿度75%，光照时间l仙，初期光照强度1000Lx,4周后2000Lx，出苗后增加至40Lx。培养30d40d可分化小芽，然后转入快繁培养基生根，发育成3个-4个叶片的小植株后，单节切段快繁，并注明编号，繁3瓶-4瓶。5.3.7 试管茵的病毒鉴定应按照GB18133规定的方法进行检测。经检测不带PVX、PVY、PLRV、PVS、PVM、PVA六种病毒的试管茵可用于离休保存。3 0862/T 2948-2018 6 离体保存6.1 试管苗低温保存6.1.1 保存培养基配

8、方MS+3%白糖+3g!L琼脂粉，pH 值5.8。6.1.2 保存苗接种挑选生长健壮的马铃薯试管茵进行剪切，取带l片叶的中间茎段，叶面朝上接种在装有保存培养基的试管中(每试管接2株)，每个材料至少保存6份。6.1.3 保存条件先将保存茵置于温度22C土2C、光照强度2OLx3000Lx、光照时间16h/d的条件下培养2周，试管茵生根后将培养温度调节为lOC土2C、光照时间12h、光照强度30Lx，持续培养。6.1.4 保存方法在试管苗离休培养过程中定期对培养室进行紫外和熏蒸消毒，防止试管苗二次污染;若发现污染材料要及时取出并处理。6.2 试管薯离体保存6.2.1 保存培养基配方MS+8%白糖+

9、4.5g!L琼脂粉+0.5%活性炭，pH 值为5.8。6.2.2 试管苗接种同6.1.2。6.2.3 保存条件先将保存苗置于温度22C土2C、光照强度2OLx3000Lx、光照时间16h/d的条件下培养4周，试管茵生根后将培养温度调节为1TC土2C、光照时间8h、光照强度1000Lx，进行试管薯诱导，待形成试管薯后在此条件下持续培养。6.2.4 保存方法同6.14。6.3 继代保存对连续保存6个12个月以上的马铃薯种质资源，观察试管苗及试管薯生长形态，若试管苗开始枯萎，或试管薯休眠期己过并在芽i处发育出小苗，则将试管茵剪段转接到MS基本培养基上，试管薯也转接到UMS基本培养基上，在光照培养室培养一周左右，试管苗正常生长，试管薯也能萌发出新苗。待生长势恢复再继续保存。4