实验室的标准操作规程(SOP)(PPT 13).ppt

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1、实验室的标准操作规程（SOP）水产品和畜、禽肉中氯霉素残留量检验方法水产品和畜、禽肉中氯霉素残留量检验方法气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法1 方法提要方法提要根据方法进行验证修改后,并依据欧盟指令建立了质谱测定条件，将某些关键步骤进行细化。本方法适用于水产品和畜、禽肉组织、肠衣中氯霉素残留确证检测。用乙酸乙酯提取，提取液用正己烷净化，硅烷化后用气相色谱配有负化学源的5973N质谱检测器检测。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素2 实验室设备2.1 仪器和设备2.1.1 Agilent6890气相色谱仪：配有负化学源的5973N质

2、谱检测器。2.1.2 离心机：5810型，Eppendorf公司。2.1.3 均质器：T25型，18G 刀，IKA公司2.1.4 旋转蒸发器：R-200，BUCHI公司。2.1.5 移液枪：200L、1000L、5000L，Eppendorf公司。2.1.6 具塞塑料离心管：15 mL、50 ML。2.1.7 涡流混匀器：39760型，Thermolyne公司。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素2.2 试剂所有试剂均为分析纯级（有机试剂需重蒸馏），水为去离子水。2.2.1 乙酸乙酯。2.2.2 甲醇。2.2.3 正己烷。2.2.4 氯化

3、钠。2.2.5 无水硫酸钠：经650灼烧4 h，置于干燥器内备用。2.2.6 硅烷化试剂：Sylon BFT 99%N,O-双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（BSTFA）+1%三甲基氯硅烷（TMCS）美国 Supelco产品，货号33154-u，0.1mL/ampul。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素2.3 标准物质2.3.1 氯霉素（chloramphenicol）：纯度99%，Amresco分装，上海生工生物工程有限公司和Sigma公司。2.4 标准溶液的配制2.4.1 标准储备液的配制准确称取氯霉素标样50mg置50ml棕色容量瓶中，

4、用甲醇溶解，并定容至刻度，混匀，浓度为1 mg/mL，4保存6个月。2.4.2 标准工作溶液配制：取1mL储备液用甲醇溶解定容到100Ml，此时浓度为1g/mL，取1g/mL 1mL定容至10mL，浓度为0.1g/mL；取1g/mL 0.5 mL定容至10mL，浓度为0.05g/mL。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素3 实验方法3.1 试样制备从所取原始样品中取出部分有代表性样品，经充分混匀。用四分法缩分出不少于500 g试样，混匀，均分成两份。装入清洁容器内，加封后，表明标记。3.2 测定步骤3.2.1 提取与净化称取5 g（精确至

5、0.01 g）试样于50 mL离心管中。加入25 mL乙酸乙酯，用均质器均质提取2 min，4000 r/min离心3 min。将乙酸乙酯层移入50 mL鸡心瓶中，试样再加入5 mL乙酸乙酯，涡流混匀器混匀1min，合并乙酸乙酯提取液，于40旋转蒸发至近干。加入1 mL甲醇溶解残渣，再加入20 mL 4%氯化钠溶液和15 mL正己烷，用涡流混匀器混合1 min，4000 r/min离心3 min。弃去正己烷层，水层加15 mL正己烷，同上操作，弃去正己烷层。水层中加入15 mL乙酸乙酯，用涡流混匀器混合2 min，3000 r/min离心3min。吸取乙酸乙酯层，通过无水硫酸钠柱（5g）脱水于

6、另一个50 mL鸡心瓶中，用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱。于40 旋转蒸发至约1 mL。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素3.2.2 衍生化将浓缩液移入5 mL离心管中，用1 mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯。于40吹氮气蒸发至干。加入100 L正己烷和100 L硅烷化试剂，于70烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液（6：4），混匀溶解，供气相色谱测定。3.2.3 测定3.2.3.1 气相色谱条件a)色谱柱：30 m 0.25 mm 0.25 m，HP-5MS；c)PTV进样口温度：70(1.

7、0 min)700/min 250(6.0 min)700/min 300；d)载气：氦气，恒压模式，柱头压 10psi；e)进样量：2uL实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素3.2.3.2 质谱条件 a)传输线温度：280C b)溶剂延迟：5min c)离子源温度：150Cd)四极杆温度：100Ce)反应气：甲烷，流量：2ml/minf)选择离子监测目标物 监测离子氯霉素 466，468，470，376其中定量离子为466，定性离子为468，470，376 g)离子停留时间：60毫秒实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质

8、谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素3.2.3.3 标准溶液的衍生化取适量标准溶液，用氮气吹干，加入200 L正己烷和100 L硅烷化试剂，于80烘箱中加热30min。吹氮气蒸发至干，加入0.50 mL正己烷与环己烷混合液（6:4），混匀溶解，供气相色谱-质谱测定。在上述色谱条件下：氯霉素保留时间为 11.65 min。3.2.3.4 样品测定分别注射等体积的标准工作液、试剂空白、阴性控制样品、待检样品（不超过10个）、阴性控制和阳性控制样品，按上述色谱条件测定，峰面积定量。4、气相色谱-质谱定性(1)保 留 时 间 定 性：在 上 述 条 件 下,目 标 化 合 物 的 保 留 时 间 为

9、11.650.1min实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素(2)质谱确证在保留时间窗口内出现色谱峰后，获取其质谱图，扣除本底后如果以下判别标准全部符合，则可判定氯霉素存在：所有4个监测离子全部在质谱图中出现离子466为基峰和定量离子，其它3个离子与基峰丰度之比应符合如下标准质荷比标准丰度比（%）允许相对偏离范围（%）468 7620470 1830376 2025实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素5、质量控制每组实验除标准、样品，需同时进行溶剂空白实验、阴性控制样品实验和阳性控制样

10、品实验。5.1 溶剂空白不加试样，用与样品相同的方法进行处理。5.2 阴性控制样品称取5.0克阴性控制样品，置于50 mL离心管中，用与样品相同的方法进行处理。5.3 阳性控制样品称取5.0克阴性控制样品，置于50 mL离心管中，用微量注射器加入0.1g/mL的氯霉素标准工作液25 L，相当于样品浓度0.5ng/g用与样品相同的方法进行处理。用相同浓度的标准进行定量，计算回收率，用来判断本组操作的可靠性。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素6 结果计算6.1 外标法定量 用色谱数据处理机或按下列公式计算：式中：X 试样中氯霉素药物残留含量

11、，mg/kg；A 样液中硅烷化氯霉素色谱峰面积；AS标准工作溶液中硅烷化氯霉素色谱峰面积；c 标准工作溶液中氯霉素的浓度，g/mL；V 最终样液的定容体积，mL；m 最终样液所代表试样量，g。计算结果需扣除空白值。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素7 测定低限本方法氯霉素的测定低限为 0.2 g/kg.8 可接受的检验结果在添加浓度0.5g/kg时，回收率，50%120%。9 检测报告按照SPSBA00024检验报告管理程序执行。10 方法验证10.1 取相当于1g/g的氯霉素衍生化物，在200-600M/z范围，进行全扫描分析，确定定

12、量离了和确证离子及其丰度比，见附录1。实验室的标准操作规程（SOP）气相色谱法气相色谱法-质谱检测法质谱检测法检测检测氯霉素氯霉素10.2 标准工作曲线用注射器分别移取0.05g/mL，20L、30L、60L；0.1g/mL，50L,1g/mL,25L、标准工作液置于6个5ML 离心管中，氮气吹干，其系列分别相当于样品中0.2、0.3、0.4、1、5 ng/g的浓度。分别注射等体积的标准工作液按给定的色谱条件进行测定，用GC-NCI-MS测定。记录峰面积，以峰面积为纵坐标，目标化合物浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，计算线性关系，得到相关系数，结果见附录2。10.3 回收率实验和室内精密度实验以阴性控制样品为测试样品，添加水平分别为0.2g/kg，0.3g/kg，0.4g/kg，做6个平行样，共做三次，用对应工作曲线计算每个样品的浓度，并计算回收率、标准偏差和变异系数。参考文献