土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(2).ppt
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1、专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用课课题题2 2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数背景:背景:背景:背景:问:问:问:问:1 1 1 1 尿素如何被利用的呢?尿素如何被利用的呢?尿素如何被利用的呢?尿素如何被利用的呢?尿素尿素尿素尿素是一种重要的是一种重要的是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素尿素尿素不能直接不能直接不能直接不能直接被农被农被农被农作物作物作物作物吸收。吸收。吸收。吸收。2 2 2 2 细菌利用尿素的原因是什么呢?细菌利用尿素的原因是什么呢?细菌利用尿素的原因是什么呢?细菌利用尿素的原因是什么呢
2、?本课题本课题本课题本课题“土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数分离与计数分离与计数”的的的的目的目的目的目的从土壤中从土壤中从土壤中从土壤中分离分离分离分离出能够分解尿素的出能够分解尿素的出能够分解尿素的出能够分解尿素的细菌细菌细菌细菌统计统计统计统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的每克土壤样品中究竟含有多少这样的每克土壤样品中究竟含有多少这样的每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌细菌细菌细菌思考:思考:如何研究细菌的分离与计数,你的研究思路是什么呢?如何研究细菌的分离与计数,你的研究思路是什么呢?课题课题课题课题22土
3、壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数筛选菌株;统计菌落数目;设置对照。筛选菌株;统计菌落数目;设置对照。1 1、实例:、实例:DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR(PCR技术技术)是一种在体是一种在体外将外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术,此项技术要求的技术,此项技术要求使用使用耐高温(耐高温(93930 0C C)的)的DNADNA聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株 提出的问题提出的问题?解决问题的思路?解决问题的思路?如果让你筛选某一目的菌株,从中你会得到了什么
4、启示?如果让你筛选某一目的菌株,从中你会得到了什么启示?如果让你筛选某一目的菌株,从中你会得到了什么启示?如果让你筛选某一目的菌株,从中你会得到了什么启示?解决问题的原理解决问题的原理?高温(高温()其他菌,选出耐高温细)其他菌,选出耐高温细菌,从(菌,从()菌种提取耐高温酶菌种提取耐高温酶。如何寻找如何寻找耐高温耐高温的酶?的酶?寻找什么环境?寻找什么环境?2 2、实验室中微生物的筛选原理:、实验室中微生物的筛选原理:人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件(包包括营养、温度、括营养、温度、pHpH等等),同时,同时抑制或阻止其他抑制或阻止其他微生物微生物生长。生长。
5、3筛选的方法:筛选的方法:利用选择培养基进行分离利用选择培养基进行分离15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4请设计:请设计:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:问问问问 :1 1 1 1 从物理性质看此培养基属于哪类?从物理性质看此培养基属于哪类?从物理性质看此培养基
6、属于哪类?从物理性质看此培养基属于哪类?2 2 2 2 在此培养基中哪些作为碳源、氮源?在此培养基中哪些作为碳源、氮源?在此培养基中哪些作为碳源、氮源?在此培养基中哪些作为碳源、氮源?33此培养基能否筛选出选择分解尿素的细菌?此培养基能否筛选出选择分解尿素的细菌?此培养基能否筛选出选择分解尿素的细菌?此培养基能否筛选出选择分解尿素的细菌?4 4 4 4 怎怎怎怎样证样证明此培养基具有明此培养基具有明此培养基具有明此培养基具有选择选择性呢?性呢?性呢?性呢?问问 怎样证明此培养基具有选择性呢?怎样证明此培养基具有选择性呢?以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培
7、养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌作对照作对照判断实验判断实验组培养基组培养基有无选择有无选择性性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长分解只生长分解尿素的细菌尿素的细菌生长多种生长多种微生物微生物是是配置好培养基后,该实验流程的下一步是什么?1 1、显微镜直接计数法(菌株):、显微镜直接计数法(菌株):利用利用利用利用血球计数板血球计数板血球计数板血球计数板,在显微镜下计算一定容积里样,在显微镜下计算一定容积里样,在显微镜下计算一定容积里样,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。品中微生物的数量。品中微生物的数量。品中微生物的数量。由于此
8、法计得的是由于此法计得的是由于此法计得的是由于此法计得的是活菌和死菌的活菌和死菌的活菌和死菌的活菌和死菌的总和总和总和总和,又称,又称,又称,又称总菌计数法。总菌计数法。总菌计数法。总菌计数法。.统计菌落的数目:统计菌落的数目:不能区分死菌与活菌;不能区分死菌与活菌;不能区分死菌与活菌;不能区分死菌与活菌;难以计数微小的细菌难以计数微小的细菌。缺点缺点优点:优点:直观、快速,能观察微生物的形态特征且技术简单直观、快速,能观察微生物的形态特征且技术简单.统计菌落的数目:2 2 稀释涂布平板法稀释涂布平板法(活体计数法或间接计数法)(计数菌落)活体计数法或间接计数法)(计数菌落)(1)操作方法:)
9、操作方法:稀释涂布平板稀释涂布平板统计菌落数统计菌落数(2)原理:)原理:1个菌落个菌落推测推测1个活菌个活菌(3)统计原则:)统计原则:思考:思考:思考:思考:为了保证结果准确,一般选择多少数目的菌落数的平板上为了保证结果准确,一般选择多少数目的菌落数的平板上为了保证结果准确,一般选择多少数目的菌落数的平板上为了保证结果准确,一般选择多少数目的菌落数的平板上进行计数?进行计数?进行计数?进行计数?你如何知道该平板中培养出的菌落在你如何知道该平板中培养出的菌落在30 300个?个?测细菌数:一般用测细菌数:一般用104、105、106稀释液稀释液测放线菌:一般用测放线菌:一般用103、104、
10、105稀释液稀释液测真菌数:一般用测真菌数:一般用102、103、104稀释液?稀释液?你如何使统计菌落的结果更具有准确性?你如何使统计菌落的结果更具有准确性?例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为品中的细菌数。从对应稀释倍数为10106 6的培养基中,的培养基中,得到以下两种统计结果。得到以下两种统计结果。1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为菌落数为230230。2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板,三个平板,统
11、计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256,该同学以这三,该同学以这三个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗?如果有问题,你认为这两位同学的作法正确吗?如果有问题,错在哪?错在哪?甲:没有甲:没有重复实验重复实验(至少涂布(至少涂布3 3个平板)个平板)乙:乙:A A组结果误差过大,不应用于计算平均值。组结果误差过大,不应用于计算平均值。你从中得到什么启示?你从中得到什么启示?.统计菌落的数目:统计菌落的数目:2 2、稀释涂布平板法(稀释涂布平板法(活体计数法或间接计数法)活体计数法或间接计数
12、法)如何计算如何计算每克样品中的菌株数?每克样品中的菌株数?每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=(C/V)*MC/V)*M C:C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数;某一稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:V:所用稀释液的体积;所用稀释液的体积;M:M:稀释倍数。稀释倍数。.统计菌落的数目:统计菌落的数目:统计菌落的数目:统计菌落的数目:2、稀释涂布平板法(稀释涂布平板法(活体计数法或间接计数法)活体计数法或间接计数法)总结:总结:总结:总结:1 1 1 1 为为为为了保证结果准确,一了保证结果准确,一了保证结果准确,一了保证结果准确,一般般般般选选30 300个菌落个菌落的平板的平板进行
13、进行统计统计 2 2 2 2 为为为为使结果接近真实值可将同一稀释度加到使结果接近真实值可将同一稀释度加到使结果接近真实值可将同一稀释度加到使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三三个或三三个或三三个或三个以上个以上个以上个以上的平皿中,经涂布,培养计算出菌落的平皿中,经涂布,培养计算出菌落的平皿中,经涂布,培养计算出菌落的平皿中,经涂布,培养计算出菌落平均数平均数平均数平均数。3 3 3 3 统统统统计的菌落往往比活菌的计的菌落往往比活菌的计的菌落往往比活菌的计的菌落往往比活菌的实际数目实际数目实际数目实际数目低低低低。4 4 4 4 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=(C/V)*MC
14、:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数;某一稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:所用稀释液的体积;所用稀释液的体积;M:稀释倍数。稀释倍数。利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中,从对利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中,从对应稀释倍数为应稀释倍数为10106 6的培养基中,的培养基中,A A、B B两同学分别得到以下两种两同学分别得到以下两种统计结果。统计结果。1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了,或培养基中混入了其他含的培养基被杂菌污染了,或培养基中混入了其他含氮
15、物质,因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。氮物质,因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A A确认自己的操作无误,但也拿不出能令人信服的证据。确认自己的操作无误,但也拿不出能令人信服的证据。请你帮助请你帮助A A同学改进实验,提供具有说明了的证据。同学改进实验,提供具有说明了的证据。原因:原因:原因:原因:土样不同,土样不同,土样不同,土样不同,培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)设设置对照的主要目的是排除实验组中置对照的
16、主要目的是排除实验组中非测试非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。信度。.设置对照:设置对照:实例:在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例:在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时,落数目的实验时,A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落,但是其他同学在同样的稀释度下落,但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因:原因:土样不同,土样不同,培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了
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