第七讲RNA的提取原理及提取技术ppt课件.ppt

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1、在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么 RNA的提取原理及提取技术在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么RNA的分类:rRNA 核糖体核糖核酸 tRNA 转移核糖核酸 mRNA 信使核糖核酸 一个典型哺乳动物细胞含10-5ugRNA，其中 rRNA占80%-85%（28S、18S和5S）tRNA 占15%-20%mRNA占1%-5%在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么 mRNA是单链的，易受到核酸

2、酶的攻击，而RNA核酸酶存在十分广泛且稳定，耐热，能适应较宽的PH范围。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么 提取提取RNA 过程中防止过程中防止RNA酶污染所采取酶污染所采取的措施：的措施：1 所有的玻璃器皿在烘箱（186 ）中烘烤4-6h，不能高温灭菌的，用0.1%DEPC水溶液处理，再用洁净的蒸馏水冲洗；2 所用的水先用0.1%DEPC37处理12h以上，再经过高压灭菌；3 全部试验过程中戴手套、口罩操作，并经常更换；在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么

3、 4 RNA电泳槽用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥后，室温下用3%H2O2溶液浸泡10min，最后用0.1%DEPC处理过的水彻底冲洗；5 工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离，最好是单独的操作空间。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么影响影响RNA提取的因素提取的因素q材料材料：l切忌使用反复冻融的材料；切忌使用反复冻融的材料；l如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在样品贮存液中，于隔。可以先将材料贮存在样品贮存液中，于70或或20保存；保存；l如要多次提取

4、，请分成多份保存；如要多次提取，请分成多份保存；l液氮长期保存，液氮长期保存，70短期保存。短期保存。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么影响影响RNA提取的因素提取的因素q样品破碎及裂解：样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：根据不同材料选择不同的处理方法：l培养细胞：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解通常可直接加裂解液裂解;l酵母和细菌：酵母和细菌：一般一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁的材料可先用酶或者机械方法破壁;l动植物组织：动植物组织：先液氮研磨和

5、匀浆，后加裂解液裂解。先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻。期间动作快速，样品保持冷冻。注意：样品量适当，保证充分裂解。注意：样品量适当，保证充分裂解。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么TRIzol：主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也

6、许你认为浪费这一点点算不了什么影响影响RNA提取的因素提取的因素q 纯化：纯化：l 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；动作快速；l 经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成但操作时间长，易造成 RNA 降解；降解；l 亲和层析法纯化。亲和层析法纯化。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么RNA提取方法提取方法q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 原理：原理：异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将异硫氰酸胍能使核蛋

7、白复合体解离，并将RNA释放到溶液中，采用酸性释放到溶液中，采用酸性酚酚/氯仿氯仿混合液抽提，低混合液抽提，低pH值的酚将使值的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和进入水相，而蛋白质和DNA仍仍留在有机相，从而可以完成留在有机相，从而可以完成RNA的提取工作。的提取工作。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么操作步骤：操作步骤：1 液氮研磨组织或细胞；2 加入trizol试剂，进一步在保证RNA完整的情况下破碎细胞并溶解细胞成分；3 加入氯仿抽提，离心分离水相和有机相，收集含有RNA的水相；4 通过异丙醇沉淀，获得RNA 样品。在日

8、常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么 mRNA的提取的提取 分离纯化完整的mRNA是进行分子克隆、基因表达分析的基础。在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么DNA或或RNA浓度、纯度和相对分子浓度、纯度和相对分子质量的测定质量的测定1 仪器测定 紫外分光光度计

9、ssDNA=33（OD2600D310)稀释倍数 dsDNA=50（OD2600D310)稀释倍数 ssRNA=40（OD2600D310)稀释倍数在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么核酸蛋白测定仪在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么DNA纯度的判断 A260/A280=1.8 1.9表明有RNA污染 1.6表明有蛋白质、苯酚等污染RNA纯度的判断 A260/A280 1.72.0 1.7表明有蛋白质、苯酚的污染 2.0表明有异硫氰酸胍残存在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么2 琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA电泳图谱 在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么 RNA电泳图谱在日常生活中，随处都可以看到浪费粮食的现象。也许你并未意识到自己在浪费，也许你认为浪费这一点点算不了什么思考题：1 提取RNA 过程中防止RNA酶污染所采取的措施是什么？2 如何根据A260/A280 的值判断DNA和RNA的纯度？