原位杂交与凋亡检测技术.ppt

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1、原位分子杂交技术原位分子杂交技术原位杂交原位杂交(insituhybridization,ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探针与组织、细胞中的待测的核酸按碱基配针与组织、细胞中的待测的核酸按碱基配对的原则进行特异的结合而形成杂交体。对的原则进行特异的结合而形成杂交体。再应用与标记物相应的检测系统，通再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带有颜色的杂交信号，在的核酸原位形成带有颜色的杂交信号，在显微镜下进行细胞内定位。显微镜下进行细胞内定位。DNA-DNA;RNA-DNA

2、;RNA-RNA人工合成寡核苷酸人工合成寡核苷酸-DNA(RNA)常用方法：常用方法：膜上杂交：用醋酸纤维膜和尼龙膜等作为膜上杂交：用醋酸纤维膜和尼龙膜等作为载体，将靶基因转移到膜上，然后用探针载体，将靶基因转移到膜上，然后用探针进行杂交，阳性结果显示为条纹或斑点。进行杂交，阳性结果显示为条纹或斑点。液相杂交：以生物素或丫啶翁酯标记液相杂交：以生物素或丫啶翁酯标记探针在溶液中用羟基磷灰石层析或吸附、探针在溶液中用羟基磷灰石层析或吸附、亲和吸附、磁珠吸附等方法进行杂交，亲和吸附、磁珠吸附等方法进行杂交，结果于计数器，光度计或用化学发光测结果于计数器，光度计或用化学发光测定。定。原位杂交：在具有明

3、确的结构基础上，原位杂交：在具有明确的结构基础上，如一个细菌，一条染色体，细胞或组如一个细菌，一条染色体，细胞或组织上进行核酸杂交，可以检测到特定织上进行核酸杂交，可以检测到特定基因的准确定位。基因的准确定位。原位杂交技术的出现是组织化学和免疫原位杂交技术的出现是组织化学和免疫组织化学的革命性突破。组织化学的革命性突破。一、一、原位杂交的分子生物学基础：原位杂交的分子生物学基础：（一）（一）核酸的分子结构：核酸的分子结构：C、H、O、N、P*核酸核酸水解水解多聚核苷酸多聚核苷酸水解水解核苷、磷酸核苷、磷酸水解水解戊糖、含氮碱（碱基）、磷酸。戊糖、含氮碱（碱基）、磷酸。（二）核酸的一级机构：（二

4、）核酸的一级机构：碱基共同成分：碱基共同成分：腺嘌呤腺嘌呤(A)，鸟嘌呤鸟嘌呤(G)，胞嘧啶胞嘧啶(C)；区别：区别：DNA含有胸腺嘧啶含有胸腺嘧啶(T)；RNA含有含有尿嘧啶尿嘧啶(U)。（三三）核酸的高级结构：根据碱基配对规）核酸的高级结构：根据碱基配对规律律 DNA：多核苷酸链可形成双螺旋三、四股多核苷酸链可形成双螺旋三、四股螺旋；但有高温变性，低温复性的特点。螺旋；但有高温变性，低温复性的特点。RNA：多核苷酸链一般以单链存在，仅有多核苷酸链一般以单链存在，仅有时局部形成小双螺旋结构。时局部形成小双螺旋结构。二、二、原位杂交的发展史：原位杂交的发展史：1、1969年美国耶鲁大学年美国耶

5、鲁大学Gall和和Pardue首创用爪蟾核糖体基因探针与卵母细首创用爪蟾核糖体基因探针与卵母细胞杂交，杂交点定位于核仁。同年，胞杂交，杂交点定位于核仁。同年，Buongiorno-Nardelli等用同位素标记等用同位素标记核酸探针对细胞和组织进行定位。核酸探针对细胞和组织进行定位。2、1970年年Orth用用3H标记兔乳头状瘤病毒标记兔乳头状瘤病毒cRNA探针在冰冻切片进行杂交，首次用探针在冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出细胞中的病毒原位杂交技术检出细胞中的病毒DNA。3、1981年年Bauman应用荧光素标记应用荧光素标记cRNA探针，在荧光显微镜观察成功。探针，在荧光显微镜观察成

6、功。4、1983年年Brigat首建生物素标记的探针首建生物素标记的探针在组织切片上检出病毒在组织切片上检出病毒DNA.5、1987年年Biochemisca推出地高辛标记推出地高辛标记的试剂及药盒。的试剂及药盒。三、核酸探针的分类：三、核酸探针的分类：按标记方法分：按标记方法分：1、放射性探针：用放射性同位素、放射性探针：用放射性同位素32P、35S、3H标记，通过放射自显影方法显示。标记，通过放射自显影方法显示。特点：灵敏度高，辐射危害，耗时久，特点：灵敏度高，辐射危害，耗时久，半衰期限制。半衰期限制。2、非放射性探针：用、非放射性探针：用FITC,Biotin,DIG,HRP,AP标记，

7、用相应的检测系统标记，用相应的检测系统显示。显示。特点：灵敏度也高，安全，快速，广特点：灵敏度也高，安全，快速，广泛应用。泛应用。按探针的性质分：按探针的性质分：1、DNA探针：探针：双链：采用双链：采用PCR方法，从基因库钓取或方法，从基因库钓取或人工合成。人工合成。单链：将单链：将DNA片段装载到质粒或菌体片段装载到质粒或菌体中，以此为模板用中，以此为模板用Taq酶合成互补单酶合成互补单DNA探针或以探针或以RNA为模板，用反转录酶合成单为模板，用反转录酶合成单链链cDNA探针。探针。特点：双链长度较长（数百特点：双链长度较长（数百数千个硷数千个硷基），信号强，基），信号强，但渗透性差。单

8、链较好。但渗透性差。单链较好。2、RNA探针：一般为单链；采用体探针：一般为单链；采用体外转录技术（单向或双向），用新型载体外转录技术（单向或双向），用新型载体pSP和和pGEM，在在SP6RNA或或T7RNA聚聚合酶作用下进行合酶作用下进行RNA转录而成。转录而成。特点：长度随意，稳定，信号更强。特点：长度随意，稳定，信号更强。3、寡核苷酸探针：已知基因序列，由核、寡核苷酸探针：已知基因序列，由核酸合成仪合成。酸合成仪合成。特点：链短，杂交速度快，特异性强，特点：链短，杂交速度快，特异性强，价廉质稳。价廉质稳。四、原位杂交技术的应用：四、原位杂交技术的应用：1、基因芯片（基因组图）；基因芯片

9、（基因组图）；2、基因表达定位；基因表达定位；3、转基因检测。转基因检测。4、核、核DNA和和RNA的的mRNA的排列和运的排列和运输，复制和细胞分类输，复制和细胞分类5、细胞遗传学、产前诊断、肿瘤诊断、细胞遗传学、产前诊断、肿瘤诊断6、病毒学和病原学、传染性疾病的诊断、病毒学和病原学、传染性疾病的诊断7、生物学剂量的测定、生物学剂量的测定五、原位杂交技术的基本方法：五、原位杂交技术的基本方法：包括：包括：1、杂交前准备：固定、取材、杂交前准备：固定、取材、玻片和组玻片和组织处理，增强核酸探针的穿透性，减低织处理，增强核酸探针的穿透性，减低背景染色等。背景染色等。2、杂交：、杂交：3、杂交后处

10、理：、杂交后处理：4、显示：放射自显影，组化、显示：放射自显影，组化或免疫组化或免疫组化显色。显色。（一）固定：（一）固定：DNA较稳定，较稳定，mRNA次之，次之，RNA最易被酶降解。最易被酶降解。固定液：固定液：(1)4%的多聚甲醛（加的多聚甲醛（加1/1000DEPC）(2)冰醋酸酒精冰醋酸酒精(3)Bouin固定剂固定剂(4)冰冻切片直接在冰冻切片直接在(1)液液10min（二）玻片处理：载玻片经热肥皂水刷（二）玻片处理：载玻片经热肥皂水刷洗洗-清洁液浸泡清洁液浸泡24h-95%酒精浸泡酒精浸泡24h-蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗-1500C以上烘箱过夜。以上烘箱过夜。玻片粘附剂：多聚赖氨酸，

11、玻片粘附剂：多聚赖氨酸，APES。盖玻片应做硅化处理。盖玻片应做硅化处理。（三）防止（三）防止RNA酶污染：酶污染：1、整个实验过程均需戴消毒手套。、整个实验过程均需戴消毒手套。2、实验用玻璃器皿在实验前一日置高、实验用玻璃器皿在实验前一日置高温温（2400C）烘烤，以破坏烘烤，以破坏RNA酶。酶。（四）、增强组织的通透性和核酸探针（四）、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：的穿透性：1、TritonX-1002、蛋白酶蛋白酶K（ProteinaseK1ug/ml）370C1520min3、胃蛋白酶（胃蛋白酶（Pepsin20100ug/ml）370C30min上述酶消化后用上述酶消化后用4%

12、多聚甲醛后固定。多聚甲醛后固定。（五）（五）减低背景染色减低背景染色1、乙酸酐和三乙醇胺浸洗，以减低静、乙酸酐和三乙醇胺浸洗，以减低静电效应。电效应。2、杂交后酶处理。、杂交后酶处理。3、杂交后洗涤。、杂交后洗涤。（六）（六）预杂交：用不含探针和硫酸葡预杂交：用不含探针和硫酸葡聚糖的液体封闭非特异性杂交点。聚糖的液体封闭非特异性杂交点。杂交：杂交：1、滴加杂交液：轻加，不产生气泡，或滴加杂交液：轻加，不产生气泡，或用用DAKO笔沿组织周围划圈。加硅化盖玻笔沿组织周围划圈。加硅化盖玻片（无菌蜡膜也可）。片（无菌蜡膜也可）。2、盖玻片周围加液体石蜡或用橡皮泥封、盖玻片周围加液体石蜡或用橡皮泥封固，

13、以防杂交液蒸发。固，以防杂交液蒸发。3、组织切片置于盛有、组织切片置于盛有2SSC溶液的湿盒溶液的湿盒中孵育。中孵育。（八）杂交后处理：（八）杂交后处理：1、用含低浓度、用含低浓度RNA酶（酶（20ug/ml）液将切液将切片的非碱基配对的片的非碱基配对的RNA除去。除去。2、盐溶液（、盐溶液（SSC）浓度由高到低，温度浓度由高到低，温度由低到高。由低到高。3、切片切忌干燥。、切片切忌干燥。（九）显示（使用检测系统）：九）显示（使用检测系统）：1、放射自显影（略）。放射自显影（略）。2、酶检测系统（与免疫组化同）。、酶检测系统（与免疫组化同）。（十）对照实验：根据实际情况定。（十）对照实验：根据

14、实际情况定。1、将切片用、将切片用RNA酶或酶或DNA酶进行预处酶进行预处理后杂交。理后杂交。2、吸收试验：用、吸收试验：用cDNA或或cRNA探针探针进行预杂交。进行预杂交。1、置换试验：用与载体非特异的序列和、置换试验：用与载体非特异的序列和不相关探针杂交。不相关探针杂交。2、空白试验：用未标记探针或不加探针空白试验：用未标记探针或不加探针的杂交液进行杂交。的杂交液进行杂交。3、用已知确定为阳性或阴性组织进行用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。杂交对照。六、原位杂交实际操作举例：六、原位杂交实际操作举例：DNA与与mRNA原位杂交步骤原位杂交步骤1、石蜡切片经常规脱蜡到水。石蜡切片经常

15、规脱蜡到水。2、3%H2O2室温处理室温处理10分钟（以灭活内源分钟（以灭活内源性过氧化物酶）蒸馏水洗。性过氧化物酶）蒸馏水洗。3、暴露、暴露DNA/mRNA核酸片段：核酸片段：(1)DNA:蛋白酶蛋白酶K（10ug/ml)室温消化室温消化10分钟；分钟；（2）RNA:胃蛋白酶胃蛋白酶370C消化消化30分钟。分钟。4、0.5MPBS洗洗3次次5分钟，蒸馏水洗分钟，蒸馏水洗1次。次。DNA杂交：杂交：1、切片置于、切片置于2SSC中，微波炉加热中，微波炉加热9510010分钟；迅速插入冰水分钟；迅速插入冰水2分钟；分钟；2、DNA探针于探针于90水中水中10分钟分钟,迅速插迅速插入碎冰入碎冰3

16、分钟；分钟；5、杂交：切片在空气干燥后，按每张切、杂交：切片在空气干燥后，按每张切片加片加20l含地高辛标记的含地高辛标记的DNA/RNA探探针原位杂交液，将原位杂交专用盖玻片针原位杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱37400C过夜。过夜。6、杂交后洗涤：揭掉盖玻片，、杂交后洗涤：揭掉盖玻片，30-370C左右水温的左右水温的2SSC洗涤洗涤5分钟分钟3次。次。7、滴加杂交探针稳定液、滴加杂交探针稳定液37-400C反应反应4-6小时（此步可省略）。小时（此步可省略）。8、0.2SSC洗涤洗涤5分钟分钟3次。次。9、滴加封闭液：室温

17、、滴加封闭液：室温20分钟，不洗。分钟，不洗。10、滴加兔抗地高辛：、滴加兔抗地高辛：370C，60分钟。分钟。11、0.5MPBS洗洗5分钟分钟3次。次。12、滴加生物素化羊抗兔、滴加生物素化羊抗兔IgG，370C，30分钟。分钟。13、0.5MPBS洗洗5分钟分钟3次。次。14、滴加、滴加S-P试剂试剂:370C，30分钟。分钟。15、0.5MPBS洗洗5分钟分钟4次。次。16、DAB显色：显色：20-30分钟，充分水分钟，充分水洗。洗。17、酒精脱水，二甲苯透明，封片。、酒精脱水，二甲苯透明，封片。七、七、结果判断：结果判断：1、DNA原位杂交的阳性信号一般存原位杂交的阳性信号一般存在于

18、细胞核内。在于细胞核内。2、RNA原位杂交的阳性信号位于胞原位杂交的阳性信号位于胞浆内。浆内。生殖细胞瘤16号染色体 ISHHER2荧光原位杂交皮肤鳞状上皮细胞核HPV DNA（+）ISH宫颈粘膜 上皮HPV16（+）ISH宫颈粘膜上皮HPV16（+）ISH宫颈鳞癌HPV18(+)，ISH鼻咽癌 EBER(+),ISH肾小管上皮细胞核HBVDNA（+），ISH食管粘膜基底层细胞质 Egr-1 mRNA（+），ISH食管鳞癌细胞质 Egr-1 mRNA（+），ISH食管鳞癌细胞质 CyclinD1mRNA（+），ISH胃腺癌细胞质端粒酶hTR(+),ISH肝细胞癌 CD44V6 mRNA（+），

19、ISH肝细胞癌 整合素 a5 mRNA（+），ISH乳腺癌细胞质PR mRNA(+),ISH 脑星形细胞瘤 血小板生长因子 mRNA（+），ISH3、阳性信号的评定（半定量）：阳性信号的评定（半定量）：（1）阳性细胞数：阳性细胞）阳性细胞数：阳性细胞10%、30%、70%和和70%分别为分别为1、2、3、4分。分。（2）阳性着色强度：按弱、中、强三）阳性着色强度：按弱、中、强三级分别为级分别为1、2、3分。分。4、用计算机辅助的图像分析、显微分用计算机辅助的图像分析、显微分光度计或图像分析仪对不同类型核酸显色光度计或图像分析仪对不同类型核酸显色数量和强度进行检测。数量和强度进行检测。七、原位杂

20、交结合免疫组织化学双标记法：七、原位杂交结合免疫组织化学双标记法：原位分子杂交检测原位分子杂交检测DNA或或RNA，能进能进行基因定位或在转录水平上研究基因表达；行基因定位或在转录水平上研究基因表达；免疫组织化学检测细胞和组织内蛋白抗原免疫组织化学检测细胞和组织内蛋白抗原成分，在翻译水平上研究基因表达。二者成分，在翻译水平上研究基因表达。二者结合起来，形成一个新的分子检测系统，结合起来，形成一个新的分子检测系统，对于深入研究基因扩增、表达的调控与疾对于深入研究基因扩增、表达的调控与疾病的发生机理有广泛的应用前景。病的发生机理有广泛的应用前景。注意事项：注意事项：1、先做原位杂交（因、先做原位杂

21、交（因mRNA易被降易被降解），后做免疫组化。解），后做免疫组化。2、做原位杂交时应适当减低漂洗温度，、做原位杂交时应适当减低漂洗温度，以减少生物活性肽或蛋白的丢失。以减少生物活性肽或蛋白的丢失。3、原位杂交完成后不显色，在加碱、原位杂交完成后不显色，在加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体时混入免性磷酸酶标记的抗地高辛抗体时混入免疫组化的第一抗体。疫组化的第一抗体。4、用上述方法必须是双酶双标，即、用上述方法必须是双酶双标，即分别用硷性磷酸酶和辣根过氧化物酶。分别用硷性磷酸酶和辣根过氧化物酶。5、用不同的显色液，一般先用、用不同的显色液，一般先用DAB,后用后用CIP/NBT显色，分别显成棕黄色和紫

22、蓝色。显色，分别显成棕黄色和紫蓝色。6、阳性细胞可为棕或蓝单色或为蓝棕混、阳性细胞可为棕或蓝单色或为蓝棕混合色。合色。肾小管细胞核HBVDNA，细胞质 HBsAg 双（+），ISH-IHC肝细胞HBVDNA，HBsAg 双（+），ISH-IHC原位杂交是一个很复杂的操作过程，原位杂交是一个很复杂的操作过程，许多条件不好掌握。尤其对初作此项工作许多条件不好掌握。尤其对初作此项工作的人往往面对失败而束手无策；但目前国的人往往面对失败而束手无策；但目前国际、国内许多公司已推出一系列成套的原际、国内许多公司已推出一系列成套的原位杂交检测试剂盒，可方便使用。位杂交检测试剂盒，可方便使用。试剂盒内包括：蛋

23、白酶试剂盒内包括：蛋白酶K，含标记含标记探针的杂交液，封闭液及检测系统等主探针的杂交液，封闭液及检测系统等主要试剂；由于每种试剂都经过最优化检要试剂；由于每种试剂都经过最优化检测后配制，测后配制，所以成功率高，操作也简便，所以成功率高，操作也简便，使原位杂交在一般实验室进行成为可能。使原位杂交在一般实验室进行成为可能。The EndThe End细胞凋亡检测技术细胞凋亡检测技术一一、前言：凋亡（前言：凋亡（Apoptosis）程序性细胞死亡程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）细胞自身的一种主动的生理性死亡过程，细胞自身的一种主动的生理性死亡过程，一种不同于坏死的死亡

24、方式；是由基因一种不同于坏死的死亡方式；是由基因控制的细胞自我消亡过程。控制的细胞自我消亡过程。光学显微镜光学显微镜HE染色观察凋亡细胞：染色观察凋亡细胞：核染色质浓缩、碎片形成（为时已晚）。核染色质浓缩、碎片形成（为时已晚）。原位末端标记凋亡细胞：可有或无上述原位末端标记凋亡细胞：可有或无上述特征（早期观察）。特征（早期观察）。*细胞凋亡时内源性核酸内切酶被激细胞凋亡时内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出被切割，出现单链或双链缺口，并产生与现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数断点数目相同的目相同的3OH末端；利用末端脱氧核末端；利用末端脱氧核糖核

25、酸转移酶将地高辛标记的糖核酸转移酶将地高辛标记的dUTP结合结合在在3OH末端，再通过酶联反应，最后末端，再通过酶联反应，最后用显色剂予以显色。用显色剂予以显色。二、凋亡检测技术：二、凋亡检测技术：1、原位细胞凋亡；、原位细胞凋亡；2、凝胶电泳；、凝胶电泳；3、流式细胞术；、流式细胞术；4、激光扫描。、激光扫描。三、凋亡细胞的形态学：三、凋亡细胞的形态学：普通光学显微镜下形态：普通光学显微镜下形态：1、组织处理：一般无特殊。、组织处理：一般无特殊。（1）培养细胞应低速离心）培养细胞应低速离心（250r/min）5分钟，避免破碎。分钟，避免破碎。（2）防脱片：）防脱片：1%牛血清白蛋白、卵牛血清

26、白蛋白、卵蛋白、处理玻片。蛋白、处理玻片。2、染色方法：、染色方法：（1）普通）普通HE染色；染色；（2）Giemsa染色；染色；（3）Mayer苏木素。苏木素。3、细胞形态：、细胞形态：（1）凋亡细胞：体积缩小，胞浆浓缩、）凋亡细胞：体积缩小，胞浆浓缩、红染，核固缩深染或碎裂。红染，核固缩深染或碎裂。（2）凋亡小体（嗜酸性小体）：被巨噬细）凋亡小体（嗜酸性小体）：被巨噬细胞或上皮细胞吞噬或游离的凋亡细胞。圆形胞或上皮细胞吞噬或游离的凋亡细胞。圆形或卵圆形、大小不等，胞浆浓缩，强嗜酸性，或卵圆形、大小不等，胞浆浓缩，强嗜酸性，可有或无固缩深染的核碎片。可有或无固缩深染的核碎片。食食管管鳞鳞癌癌

27、细细胞胞系系TUNEL染染色色食管鳞癌细胞系石蜡切片食管鳞癌细胞系石蜡切片HE染色染色（二）荧光显微镜下形态：荧光显微镜下凋亡（二）荧光显微镜下形态：荧光显微镜下凋亡细胞呈黄色。细胞呈黄色。1、荧光染料：荧光染料：PI(propidiumiodide)510ug/ml DAPI（4，6diamidino-2-phenylindole）12/ug/ml 7-AAD(7-aminoactinomycinD)1020/ug/mlHoechst33342（12.3mg+双蒸双蒸10ml）/PI双染色。双染色。2、染色时间：半小时、染色时间：半小时1小时。小时。*PI染色因染色因PI同时与同时与RNA结

28、合，应先结合，应先用用RNA酶消化（酶消化（3715分钟）分钟）白血病细胞 HL-60 APO-BRDU鼻咽癌细胞鼻咽癌细胞Hoechst33342/PI双染荧光显微镜双染荧光显微镜400（三）凋亡细胞的电镜观察：（三）凋亡细胞的电镜观察：1、组织处理：组织、细胞固定、包埋、组织处理：组织、细胞固定、包埋、染色与一般电镜标本相同。染色与一般电镜标本相同。（1）透射电镜：与光镜基本相同，仅是）透射电镜：与光镜基本相同，仅是放大倍数不同而已，表现如下：放大倍数不同而已，表现如下：凋亡的细胞皱缩，胞膜完整凋亡的细胞皱缩，胞膜完整,胞浆致胞浆致密，细胞器密集可有不同程度的退变（线密，细胞器密集可有不同

29、程度的退变（线粒体肿胀等）。粒体肿胀等）。核：染色质致密，凝集成块状，边集核：染色质致密，凝集成块状，边集于核膜处于核膜处胞核裂解。胞核裂解。胞质多发性芽突，芽突脱落胞质多发性芽突，芽突脱落凋凋亡小体（胞膜包绕，其中含有不同程度亡小体（胞膜包绕，其中含有不同程度退变的细胞器和脂滴、核碎片可有可无）退变的细胞器和脂滴、核碎片可有可无）。（2）扫描电镜：细胞呈波浪状或细胞）扫描电镜：细胞呈波浪状或细胞表面结构改变，如伪足，微绒毛消失等。表面结构改变，如伪足，微绒毛消失等。（四）凋亡细胞的原位末端转移酶标记：（四）凋亡细胞的原位末端转移酶标记：（TdT-mediateddUTPnickendlabe

30、ling，TUNELmethod）原理：细胞凋亡原理：细胞凋亡细胞内源性核酸内切细胞内源性核酸内切酶被激活酶被激活核染色质核染色质DNA双链断裂双链断裂露露出出3-OH末端末端DNA片段片段TDT酶酶与生物素与生物素或地高辛标记的核苷酸结合或地高辛标记的核苷酸结合荧光素荧光素/酶链酶链标记卵白素标记卵白素/抗地高辛抗体结合抗地高辛抗体结合凋亡细胞凋亡细胞原位显示。（检测凋亡细胞的特异性手段）。原位显示。（检测凋亡细胞的特异性手段）。1、组织处理：、组织处理：（1）新鲜标本：人体组织离体后迅速）新鲜标本：人体组织离体后迅速固定，动物实验可用内灌注后处死。固定，动物实验可用内灌注后处死。（2）固定

31、液：）固定液：10%中性福尔马林、中性福尔马林、4%多聚甲醛、多聚甲醛、80%乙醇。乙醇。（3）固定时间：）固定时间：活组织不超过活组织不超过24小时，最好在小时，最好在4小时以内。小时以内。冰冻切片冰冻切片4%多聚甲醛多聚甲醛4固定固定30分钟或分钟或80%乙醇固定乙醇固定2小时小时（4）保存：石蜡块）保存：石蜡块20保存，时间保存，时间不超过半年。冰冻切片不超过半年。冰冻切片20保存，时间保存，时间不超过一月。不超过一月。2标记步骤：标记步骤：试剂盒内容：试剂盒内容：标记缓冲液（标记缓冲液（LabelingBuffer）1ml蛋白酶蛋白酶K(ProteinaseK)100ul末端脱氧核糖核

32、酸转移酶（末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT,20）20ulDIG-dUTP(20)20ul封闭液（封闭液（BlockingReagent）2ml生物素化抗地高辛抗体（生物素化抗地高辛抗体（100）20ul/碱性磷酸酶抗地高辛抗体碱性磷酸酶抗地高辛抗体S-P试剂（试剂（100）20ul自备：显色液：自备：显色液：DAB或或BCIP/NBT。Tunel法实验操作步骤法实验操作步骤1、二甲苯脱蜡，、二甲苯脱蜡，10分钟分钟3次；次；2、经梯度酒精至蒸馏水；经梯度酒精至蒸馏水；3、0.85%NaCl、PBS各洗各洗5分钟；分钟；4、4%多聚甲醛湿盒内前固定多聚甲醛湿盒内前固定15分钟；分钟；5、1PBS

33、(PH7.4)洗洗5分钟分钟3次次6、蛋白酶蛋白酶K消化，室温下消化，室温下12min7、PBS洗洗5分钟分钟1次次8、4%多聚甲醛湿盒内后固定多聚甲醛湿盒内后固定5分钟分钟9、PBS洗洗5分钟分钟3次次10、标记缓冲液室温下标记缓冲液室温下10分钟分钟11、TdT和和Bio-dUTP混合液混合液370C孵育孵育70分钟分钟12、2SSC洗洗15分钟分钟13、PBS洗洗5分钟分钟3次次14、0.3%H2O25分钟分钟15、PBS洗洗5分钟分钟3次次16、S-P室温室温30分钟分钟17、PBS洗洗5分钟分钟3次次18、DAB显色显色30分钟分钟19、苏木素复染、酒精脱水、封片。、苏木素复染、酒精

34、脱水、封片。Tunel染色法：染色法：阳性部位定位于细胞核。阳性部位定位于细胞核。甲状腺癌细胞核（+），TUNEL肝组织 TUNEL，AP反应食管鳞癌角化珠凋亡细胞，TUNEL法。食管鳞癌角化珠凋亡细胞，TUNEL法。鼻咽鳞癌细胞系鼻咽鳞癌细胞系TUNEL染色染色脑星形细胞瘤 细胞核（+）TUNEL干燥综合征泪腺核（+），TUNELTunel法染色注意事项：法染色注意事项：1、切片脱蜡务必干净；、切片脱蜡务必干净；2、蛋白酶、蛋白酶K浓度及时间（新旧蜡块不同）浓度及时间（新旧蜡块不同）浓度浓度20g/ml，时间时间5-15分钟；分钟；3、标记后洗脱液的浓度应注意、标记后洗脱液的浓度应注意(2SSC)4、TdT酶易失效，应在酶易失效，应在20保存；保存；5、TdT酶和酶和DIG-dUTP须临时混合；须临时混合；6、显色时间镜下控制可达、显色时间镜下控制可达30分钟以上。分钟以上。（五）、凋亡检测技术的应用：（五）、凋亡检测技术的应用：1、某些疾病发生机理的研究；、某些疾病发生机理的研究；2、肿瘤发生、发展和转归的研究；、肿瘤发生、发展和转归的研究；3、药物疗效的检测。、药物疗效的检测。The End The End