化验技术协会第八期企业知识管理培训资料bqop.docx

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1、*化验技术协会第八期培训资料（微生物检定工）*无菌检查法 无菌检查是检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。事实上，若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。 无菌检查法有薄膜过滤法、直接接种法两种方式。细菌培养温度32.52.5，真菌培养温度25.52.5。 1 无菌检查的环境 无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室(区)环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室(区)的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。无菌检

2、查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。面积一般不超过lOm2，不小于5m2,高度不超过2.4m。由12个缓冲间、操作间组成(操作间和缓冲间的门不应直对)，操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养

3、箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。 无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制1826，相对湿度4565。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室(区)与室外大气的静压差大于lOPa。无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯(22.5Wm3)，应定期检查辐射强度，要求在操作面

4、上达40Wcm-2。不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。 无菌室应每周和每次操作前用0.1新洁尔灭或2甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。 无菌室的洁净度检查 无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断无菌室是否达到规定的洁净度，常有沉降菌和浮游菌测定方法。 沉降菌检测方法及标准 以无菌方式将3个营养琼脂平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将碟盖盖好，置3252.5培养48小时，

5、取出检查，3个平板上生长的菌落数平均不超过1个。 浮游菌检测方法及标准 用专门的采样器，宜采用撞击法机理的采样器，一般采用狭缝式或离心式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定期校验，采样器和培养皿进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，使用的培养基为营养琼脂培养基或药典认可的其它培养基。使用时，先开动真空泵抽气，时间不少于5分钟，调节流量、转盘、转速。关闭真空泵，放入培养皿，盖上采样器盖子后调节缝隙高度。置采样口于采样点后，依次开启采样器、真空泵，转动定时器，根据采样量设定采样时间。全部采样结束后，将培养皿置32.52.5培养48小时，取出检查，浮游菌落数平均不得过5个m

6、3。 每批培养基应选定3只培养皿做对照培养。 无菌操作台面或超净工作台还应定期请有关部门检测其悬浮粒子，应达到lOO级(一般用尘埃粒子计数仪)检测尘埃粒径0.5m的粒数不得超过3.5个升，5m的粒数为0,空气流速应0.35ms，可根据无菌状况必要时置换过滤器。 2 仪器及用具 2.1 无菌室内应准备好盛有消毒用5甲酚或其他适宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇灯、火柴、镊子、75乙醇棉、碘伏棉等。2.2 恒温培养箱及生化培养箱。2.3 离心机、生物显微镜、真空架、高压蒸汽灭菌器、标准pH比色器(0.02酚磺酞指示液和溴麝香草酚蓝指示液)、恒温烤箱、开放或全封闭过滤系统。2.4 玻璃器皿 试管、量筒、三角瓶

7、、移液管、刻度吸管(1、5、10ml)、注射器(2、5、lOml)、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。如使用过程中与细菌接触(已污染)，应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，灭菌。移液管、刻度吸管在管内上端，塞少许原棉，以手感不松不紧为宜，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，封严，灭菌待用；试管、离心管、三角瓶等在管(瓶)口塞上海棉胶(或硅胶)专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口(包括塞子)包扎严，灭菌待用；将注射器、针头(9号、11号、12号)配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布(或布)内，包扎严

8、密，置带盖容器(瓷盘或铝制饭盒)内，盖严，用牛皮纸包扎后，灭菌待用。长柄取样匙，放于不锈钢长筒内，盖严，干热灭菌待用。手术镊、手术剪洗净、擦干。用双层纱布将1把剪刀与1把镊子间隔包扎在一起，放于带盖的容器（瓷盒或铝制饭盒)内，盖严，用牛皮纸包扎，灭菌(参照附录XV灭菌法)待用。高压蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置冷处，避免因急速冷却，使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易染菌，取出后应置恒温培养箱(或干燥箱)中烘干，待用。2.5 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌待用或用一次性的无菌物品代替。 2.6 除菌滤器及滤膜 有多种开放式及封闭式滤器用于过滤除菌。微孔滤膜直径50mm、孔

9、径约0.45m。新购入封闭式滤器或滤膜，需进行孔径大小的测试，一般有三种方法，其中一种方法即可。 气泡法 先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装置或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋固定圈旋紧，在多扎板上加35mm深的水(注意排除气泡)关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶阀，使压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力不应小于2.2kg/cm2(0.2MPa)。水流量法 将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmHg(93kPa)下，抽滤已滤清的水约500ml，计算出每lmin的滤速。200

10、5年版中国药典对滤膜的滤速未明确规定，而USP规定在700mmHg(93kPa)压力下，滤膜直径47mm；流速5575mlmin。细菌过滤法 常用的细菌为粘质沙雷氏菌，将该菌的新鲜营养琼脂斜面培养物，接种于营养肉汤培养基中，32.52.5，培养1820小时，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至10-3 (约相当于7105cfum1)，取此菌液1ml加至50ml 0.9无菌氯化钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，取该滤液5ml接种于营养肉汤培养基40ml中，32.52.5培养24小时,应无菌生长。不符合规定的滤膜不得使用。 3 菌种及菌液制备 菌种的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0

11、代；冷冻干燥的原始菌种开启后转种，为第一代)。原始菌种购到后，应由专人负责，接收菌种时应检查安瓿的数量和菌种的名称及每一支安瓿的完整性。并在相应的菌种接收登记表上记录所有关于菌种的信息。将安瓿存于-20，使用时首先需要复活冻干菌种(按菌种保藏中心提供相关资料操作)，一般包括以下步骤：冷冻菌种的复活 清洁安瓿(可用75的酒精或碘伏)后，用砂轮在安瓿上部三分之一处划痕，用干燥的无菌纱布包裹安瓿，将安瓿掰开，用一无菌吸管吸取适量0.50.8ml的液体培养基(生孢梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基；金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌用营养肉汤；白色念珠菌、黑曲霉菌用液体真菌培养基)滴加到安

12、瓿中，轻轻旋转安瓿并吹打，使冻干菌种和液体培养基充分混和并完全溶解，再将安瓿内的菌悬液全部吸出，转移至相应的培养基试管中，根据菌种类型采用适宜的培养条件(细菌培养温度32.52.5，1824小时；真菌培养温度25.52.5，35天)下培养，观察培养基是否浑浊，(如不浑浊，细菌应延长培养时间至7天以上，真菌应延长培养时间至14天以上，仍未浑浊，按相关规定灭菌处理。)浑浊说明菌种复活生长，在应用前，还应确认菌种的纯度和特性。菌种确认 用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一的纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色

13、特性及菌形。并作生化实验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定该菌种。对已通过确认鉴定后的菌种可以使用或传代保藏。菌种传代保藏方法很多，各单位可根据情况采用，但无论应用何种方法，都应对采用的方法进行验证，确保在相应保存条件下的菌种不会变异且性能稳定，同时也应兼顾到方法的经济和简便。常用的有甘油冷冻管保藏法、斜面低温保藏法等，此类方法简单易行。甘油冷冻管保藏法 将待保藏菌接种平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时间后(细菌2448小时的培养物，白色念珠菌72小时的培养物)，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调整菌液浓度，向已制备好的菌悬

14、液中加入等体积、浓度为20的无菌甘油，轻轻振摇小管，使内容物充分混和，分装于无菌小管，制好的甘油冷冻管最好在-30贮存。斜面低温保藏法 将工作用菌种的典型菌落接种在适宜的固体斜面培养基，按规定的温度和时间培养，待菌生长充分以后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，转移至4左右冰箱保存，如菌种保藏管的塞子是橡胶塞，并采用半固体高层培养基穿刺培养，则可以保存时间较长。铜绿假单胞菌不宜用本法保存。3.1 菌种(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcu aureus)CMCC(B)26003(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501(3)大肠埃希菌(Esche

15、richia coli)CMCC(B)44102(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104(5)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941(6)白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001(7)黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)980033.2 菌液制备制备的菌液，一般当日使用。取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，32.52.5培养1824小时；白

16、色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，25.52.5培养2448小时，上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌小于100菌落形成单位(cfu)的菌悬液。将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.52.5培养57天，使大量的孢子成熟。加入35ml 0.9无菌氯化钠溶液，用玻棒或白金饵轻轻振摇将孢子洗脱。然后，用管口带有能过滤菌丝的装置(如薄层无菌棉花或纱布的无菌毛细吸管)的吸管吸出胞子悬液至无菌试管内，用0.9无菌氯化钠溶液将其稀释至每毫升含小于100cfu的孢子悬液(可采用比浊法)。以上菌液在供试验的同时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠

17、埃希菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂，白色念球菌和黑曲霉用改良马丁培养基注皿(1m1)或平板涂布(0.1m1)，按规定条件培养后，计数。4 培养基4.1 一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，配制培养基时称量要迅速以免吸潮而影响称量的准确性，同时为避免增加培养基中的金属离子及其他微量化学元素而影响微生物的生长、鉴别、所用器具应为洁净玻璃器皿，所用溶解用水为纯水。4.2 培养基的pH值应符合规定，否则必须校正。调节pH值：测定pH值的标准温度为252，调节pH值可用无菌的lmolL(1N)氢氧化钠或10碳酸钠溶液、lmolL盐酸溶液或15%冰醋酸溶液。分装好的培养基及时密封后必须在配制

18、当天(2小时内最佳)进行灭菌处理。 4.3 新鲜配制的培养基，应按中国药典规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，化学药品均需用CP试剂规格。4.3.1 除葡萄糖和指示液外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉、可调电磁炉或其它适宜的加热设备中，微温溶解。用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH，使其比规定的pH值略高0.40.6，煮沸，用棉(纸)浆减压抽滤或以脱脂棉，滤纸等滤材过滤，使培养基澄清。4.3.2 加入葡萄糖和指示液，摇匀，补足水量，调节pH值(比规定的pH值略高0.20.4)，使灭菌后为7.10.2，分装，装量不宜超过容器的23，以免灭菌时溢出。4.3.3 硫乙醇酸盐流体培养基I，分装

19、至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基的氧化层(粉红色)不超过培养基深度的12，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的颜色不得超过培养基深度的l5，否则，须经100水浴或流通蒸汽加热至粉红色消失(不超过20分钟)，迅速冷却。培养基只限加热一次，并防止被污染。 4.3.4 灭菌应采用验证合格的灭菌程序进行。培养基应只能进行一次蒸汽灭菌处理。固体培养基使用前的融化，不宜使用蒸汽灭菌柜融化琼脂培养基，宜选用沸水浴融化培养基。 4.4 未开封脱水培养基应避光储存于25以下阴凉干燥处，已开封的脱水培养基应盖紧，避光储存于25以下阴凉干燥处。制备好的培养基应保存在225避光的环境，有条

20、件置冰箱48冷藏储存较好。培养基若保存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密闭容器中，可在一年内使用。 4.5 培养基的装量4.5.1 对于采用直接接种法检查的液体样品，培养基的装量与供试品的装量相关，供试品的装量小于20ml的样品，培养基装量15ml；供试品的装量大于或等于20ml小于50ml的样品，培养基装量40ml；供试品的装量大于或等于50ml小于100ml的样品，培养基装量80ml；4.5.2 对于采用直接接种法检查的固体样品(含药品及外科用辅料棉花及纱布)，培养基的装量均为100ml；对于缝合线、一次性医用材料及医疗器具，如果医疗器具体积过大，培养基的装量可在2000ml以上，

21、以将其完全浸没为准。4.5.3 对于采用薄膜过滤法检查的样品，若用封闭式薄膜滤器操作的，培养基装量100ml；若用开放式薄膜滤器操作的，培养基装量50ml。 4.6 培养基的适用性检查培养基的检查包括无菌检查和灵敏度检查；符合规定者方可用于供试品的无菌检查。培养基的无菌检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行，但是所用培养基不符合无菌要求，供试品的无菌检查结果应视为无效。培养基的灵敏度检查应对购进的每个批号的脱水培养基进行灵敏度检查，检查合格后方可使用，但当培养基的配制方法和灭菌程序发生变更时，应再次对培养基的灵敏度进行检查。4.6.1 培养基无菌检查的操作及结果判定每批培养基随

22、机取不少于5支(瓶)，按规定温度培养14天，应无菌生长。4.6.2 培养基灵敏度检查的操作及结果判定取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，每支接种菌量为lml(含菌小于100cfu)，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2支，每支接种菌量为lml(含菌小于100cfu)，另1支不接种作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。对于配制后的选择性培养基的灵敏度检查试验同上。5

23、方法验证试验为保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。若供试品的生产工艺，原、辅料组分或检验条件发生改变时，检查方法应进行重新验证。针对药品的无菌检查试验，在确定产品的无菌检查试验方法时或建立新的检查方法时，或当试验条件(包括培养条件)发生变更时，都必须要对新的或变更后的检验方法加以验证，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。确保在实际检验条件下，该供试品的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列

24、要求进行操作试验。供试品对每一试验菌的抑菌活性应逐一进行验证。验证用菌种、菌液制备、各试验菌所对应的培养基及培养温度、参见3.1及3.2部分。5.1 薄膜过滤法验证试验将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入试验菌少于100CFU。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基直接加至滤筒内。另取一滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照，将含培养基的容器按规定温度培养35天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。5.2 直接接种法验证试验取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌的菌液各两管；取适宜装量的改良马丁培

25、养基4管，分别加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各两管。每管加菌量小于100cfu。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，各试验管按相应规定的温度培养35天。5.3 判断与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，并且与阳性对照容器内的培养结果相似，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用消除，供试品可按该法进行无菌检查。若含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，若采用的是直接接种法，可根据实际情况增加培养基的用量、在冲洗液中或培养基中使用中和剂(如-内酰胺酶、对氨基苯甲酸、聚山梨脂80)、或改为薄膜过滤法。若采用

26、的是薄膜过滤法，可采用增加冲洗液的用量、改变冲洗液的种类、更换滤膜品种等方法消除供试品的抑菌作用。并重新进行验证试验。 已进行过无菌检查法方法验证试验的供试品，按此法进行无菌检查。 6 供试品的无菌检查 6.1 检验数量及检验量检验数量是指一次试验所用供试品最小包装的数量。除另有规定外，出厂产品应尽量抽取批生产开始和结束或生产过程出现异常情况下的产品进行检验；一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支(或瓶)作阳性对照用。检验量是指一次试验所用的供试品总量(g或ml)。采用直接接种法时，若每支(瓶)供试品的装量按规定足够

27、接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。 6.2 培养基用量 除另有规定外，供试品无菌检查时，每支培养基的实际装量及所占容器高度的比例应与“验证试验”所用的培养基相同。 6.3 阳性对照 供试品无菌检查应进行阳性对照试验。阳性对照菌的选择原则：应根据验证试验结果选择相应对照菌，阳性对照管的加菌量为小于100个cfu。阳性对照管培养4872小时，应生长良好。 6.4 阴性对照 凡无菌检查，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 6.5无菌

28、检查操作 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。 6.5.1 供试品在移入缓冲间前应除去外包装、消毒外表面并编号，培养基管(瓶)用0.1%新洁尔灭或酒精棉擦拭瓶(管)外壁，然后连同其他用具(包括无菌衣、帽、口罩等)移入缓冲间，开启操作间紫外灯和空气过滤装置并使其工作1小时以上。 6.5.2 操作人员用肥皂、水清洗双手，关闭紫外光灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用75乙醇棉球擦手，穿戴衣、帽、口罩、手套。将所需物品剥去牛皮纸，移入无菌间，每次试验中所用物品必须计划好，并有备用物。 6.5.3 供试品外部消毒 6.5.3.1 将消毒过的粉针剂、油剂等铝盖压封的橡皮塞

29、小瓶，先用75乙醇或碘伏棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用灭菌镊子剔去铝盖上的铝质小圆片，过火焰数次。6.5.3.2 将消毒过的安瓿针剂先用碘酒棉球或碘伏棉球将安瓿外部擦拭灭菌，待干，用砂轮或灭菌锉轻割安瓿颈部（便于折开安瓿），再用75%乙醇棉球将磺酒擦净，待干。 6.5.3.3 其他供试品容器表面或外包装，可参照上述用适当消毒液擦拭或浸没后以无菌的方式取内容物。 6.5.4 供试品制备用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，供试品瓶盖和注射器针头均应迅速通过火焰数次；当供试品为粉针剂，瓶盖为橡胶塞时，用注射器吸取规定的溶剂，在已消毒好的橡胶塞中心位置刺入小瓶加入溶剂，溶解，混匀后吸出

30、溶液，或选用其它适宜的方法。如为注射液、供角膜创伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液可直接用注射器吸取药液，或选用其它适宜的方法。按规定或需灭活的供试品可用灭活剂溶解，将瓶内供试液抽出稀释至规定的浓度。需加入空气加压后便于抽出的供试品，应用注射器对着火焰抽取空气加入，抽取瓶中液体时，应将供试品倒置并使针头在液面下。供试品如为直接分装成注射用无菌粉末的原料药（大包装粉针剂），取样时为缩短暴露时间，应由两人操作。将放置于缓冲间的包装瓶用0.1%新洁尔灭抹净外壁，且经紫外线照射1小时后移入操作间（台），除去铝盖，用75%乙醇棉或碘伏棉球擦拭瓶口橡胶塞外壁和瓶口缝隙，待干，戴好医用消毒手套，在火焰旁小心揭开瓶

31、塞，用专用取样器取出规定量的样品，置灭菌试管中，密塞待用，立即盖好大包装瓶塞，用橡皮胶布及时封口，再用封箱纸包扎瓶口。如果容器内有一定的真空，可用适当的无菌器材（如一端带有除菌过滤器的针头），向供试品容器内导入无菌空气，再按无菌操作开启容器取出内容物。供试品处理时所用的溶剂、乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应验证是有效的，并对微生物生长无影响。除另有规定外，供试品处理及接种，按下列方法进行。6.5.5 薄膜过滤法无菌检查用的滤膜孔径为不大于0.45m，直径约为50mm。应根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，如抑菌性供试品采用低吸附性的滤膜，油性供试品选用疏水性滤膜。水溶性供试液过滤前先将少量的

32、冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。同时每片滤膜的总过滤量不宜太大，以避免滤膜上的微生物受损伤。薄膜过滤法采用封闭式薄膜过滤器或开放式薄膜过滤器，可优先选用封闭式薄膜过滤器。如采用封闭式过滤器时，将一次性集菌培养器（依供试品种类不同选择适宜的集菌培养器如抗生素类采用抗生素专用集菌培养器）放于电控集菌仪的排液槽上，培养器的塑胶软导管放于电控集菌仪的蠕动泵的管槽内，其进液导管的双芯针头，插入供试液或冲洗液等容器的塞上。6.5.5.1 操作打开待检样品的铝盖，复溶。吸取适量药液加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液至具塞的瓶中

33、，混匀。如采用封闭式过滤器，取出培养器先检查包装是否完好无损，将培养器逐个插放在不锈钢座上，将培养器的弹性软管装入集菌仪泵头，注意定位准确，软管走势顺畅。将培养器导管上的针头插至供试液容器塞上，开动电控集菌仪电源，将样品瓶倒置固定于支架上，使药液均匀通过集菌培养器，待药液排尽，关闭电源，将针头取下，插至装有适宜冲洗液的瓶塞内，冲洗集菌培养器的滤膜，照上述操作要求，冲洗次数及冲洗量与验证试验保持一致。滤干，关闭电源。将集菌培养器的排气孔上胶帽取下，集菌培养器底部的排液管口拧上，将冲洗瓶取下换上相应的培养基瓶，启动电源，将培养基泵入指定的培养器内，关闭电源。用小夹夹闭与培养器连接部的软管，在软管剪

34、切线的位置剪断软管，将软管开口端套在空气过滤器开口上。 每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂及冲洗液同法操作，作为阴性对照。将已操作完毕的含培养基的集菌培养器移出无菌室，取其中一管作为阳性对照，依阳性对照菌选择原则加入相应的对照菌液。按规定温度与时间培养。大容量非抗菌作用的供试品，薄膜过滤后，无须冲洗。6.5.5.2 注意事项对具有抗菌活性的固体制剂或液体制剂，在过滤膜前，要根据供试品的抗菌活性的强弱选用适宜、适量的溶剂溶解及稀释；淋(冲)洗样品时流速不易过快。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤

35、膜，其总的冲洗量不宜过大，冲洗量及冲洗方法参照方法验证试验。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物生长及存活无影响。6.5.6 直接接种法6.5.6.1 操作 用适当灭菌用具，取上述制备妥的供试品在近火焰区以右手握拳，以小指为主拨开培养基管的塞子，管口通过火焰，移至火焰下侧，沿着培养基管壁分别接种于硫乙醇酸盐流体培养基11管，(其中1管于操作结束后移至接种室接种金黄色葡萄球菌对照菌液1m1)，改良马丁培养基10管，轻轻摇动使匀，培养14日。每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂，同

36、法操作，作为阴性对照。6.5.7 培养及观察 培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长、填写检查记录表。如加入供试品后，或在培养过程中培养基出现浑浊，培养14日后，不能从外观上判断无微生物生长，可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上，继续培养，细菌培养48小时，真菌培养72小时，观察是否再现浑浊或斜面上有无菌生长；或用接种环取培养液涂片，染色，镜检，进行判断。6.5.8 结果判定若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判断供试品符合规定；若供试品管中任何1管显混浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：(1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。(2)回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。(3)阴性对照管有菌生长。 (4)供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有生长，判供试品不符合规定。89