疫分析方法的研究进展.ppt

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1、 免疫是机体识别和排除进人体内的抗原性异物的保护性应答反应。免疫分析法是生物酶技术、荧光光谱技术、辐射技术、免疫分析技术应用于分析领域的一门新技术，是基于抗原和抗体之间的特异性识别和结合反应为基础的一种微量分析方法。免疫分析法起始于本世纪50 年代,首先应用于体液大分子物质的分析,1960 美国学者Yalow 和Berso n 等将放射性同位素示技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆胰岛素浓度,开创了放射免疫分析方法的先河。同年,Oliv er 将地高辛同牛血清白蛋白结合,使之成为人工抗原,免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体,从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。免疫分析法通过对半抗原或

2、抗体进行标记，利用标记物的生物或物理或化学放大作用来进行工作，它集测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一体。优点：操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、价廉、样品所需量少 免疫分析方法非标记免疫分析技术 标记免疫分析技术免疫扩散免疫电泳标记免疫分析技术标记免疫分析技术标记免疫分析技术胶体金免疫技术发光免疫技术铁蛋白免疫技术荧光免疫技术放射免疫分析酶免疫分析免疫分析方法免疫电泳免疫分析方法胶体金免疫技术发光免疫技术铁蛋白免疫技术荧光免疫技术放射免疫分析酶免疫分析免疫电泳免疫分析方法胶体金免疫技术发光免疫技术铁蛋白免疫技术荧光免疫技术放射免疫分析酶免疫分析免疫电泳免疫分析方法胶体金免疫技术发光免疫技

3、术铁蛋白免疫技术荧光免疫技术放射免疫分析酶免疫分析免疫电泳免疫分析方法胶体金免疫技术发光免疫技术(CLIA)铁蛋白免疫技术荧光免疫技术(FIA)放射免疫分析（RIA）酶免疫分析（EIA）免疫电泳免疫分析方法免疫分析标记技术免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性反应为基础,研究标记以各种标记物(定量信号)来对某种物质进行定性或定量检测的研究。至2007年，应用于免疫分析检测中的各种标记技术:放射物标记、酶标记、发光标记、荧光标记、金标记和超顺磁粒子标记等 放射免疫分析放射免疫分析是以放射性同位素为示踪物,与免疫反应相结合的一种分析方法,提供的检测信号是不断发出的放射线。常用来标记的放射性同位素

4、有3H、14C、25 N、121I、125I等。优点：准确灵敏、特异性强,仪器试剂价格低廉、技术成熟。缺点：药盒的使用寿命短,批间、批内变异较大，难进行自动化分析。酶免疫分析方法酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示踪物,由高活性的酶催化底物显色或发光,达到定量分析的目的。到目前为止,酶标记法所用的酶大多是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。酶通过与自己的特殊作用底物反应,而产生典型的有色沉淀物。优点：避免对人体的放射性伤害,环境的污染 酶标记物较稳定,半衰期可超过1年.酶免疫反应通常不需要温育，不需将与抗体结合的标记药物同游离的标记药物分开,.

5、产生的信号用普通的可见一紫外分光光度计就可测定,不需昂贵的仪器没备。缺点：标记酶不像同位素标记物,荧光标记物那样能直接产生信号,而必须要何其它试剂,如酶底物,辅酶的参与,才能完成酶反应,引起吸收光谱等变化后方可进行测定.荧光免疫分析法荧光免疫分析法是以荧光物质标记抗原或抗体,形成的标记物发生免疫反应后,引起荧光强度发生变化,从而达到定量分析的目的。目前为止认为比较满意标记物的有:异硫氰酸荧光素(FITC)、二氯三嗪氨基荧光素(DTAP)、四乙基罗丹明(RB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TMR ITC)。化学发光免疫分析法化学发光免疫分析是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合

6、,借以检测抗原或抗体的分析技术。它兼有发光分析的高灵敏度和免疫反应的特异性。优点：灵明度高，线性范围宽，光信号持续时间长，分析方法简便快速，结果稳定、误差小，安全性好，使用周期长。方法方法优优 点点缺缺 点点放射免疫放射免疫试剂试剂成本低，灵敏度成本低，灵敏度较较高高操作复操作复杂杂，放射性，放射性污污染，染，有效期短有效期短酶酶联联免疫免疫 试剂试剂成本低，操作成本低，操作简单简单灵敏度低，适用于定性和灵敏度低，适用于定性和半定量半定量测测定定化学化学发发光光操作操作简单简单，成本，成本较较低，低，灵敏度灵敏度较较高，高，试剂较试剂较稳稳定定工作曲工作曲线线随随时间时间漂移漂移时间时间分辨分

7、辨灵敏度灵敏度较较高，高，试剂较稳试剂较稳定定操作复操作复杂杂，发发光光时间时间短，短，试剂试剂成本高，成本高，仪仪器器维护维护费费用用较较高高电电化学化学发发光光灵敏度灵敏度较较高，高，试剂较稳试剂较稳定定操作复操作复杂杂，试剂试剂成本高，成本高，仪仪器器维护费维护费用用较较高，有高，有本底干本底干扰扰 化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发光分析2个系统。免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化学发光物质在碱性介质中经氧化剂的氧化时释放大量自由能,产生激发态

8、的中间体，该激发态的中间体由最低振动能级回到稳定的基态，各个振动能级时产生辐射，同时产生能量，多余的能量即为发射光子，从而产生发光现象。发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测、分析接收光量子的产量，根据化学发光标记物与发光强度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的含量。常见的发光体系鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类：吖啶类化合物：（金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物 电化学发光体 生物发光体系北美荧火虫体内的荧光素/荧光素酶是著名的生物化学发光体系,它由虫荧光素酶、虫荧光素D-(-)-2-6-羧基-2苯并噻唑-2-噻唑啉-4-羧酸、ATP、Mg2+及O2所组成。虫荧光素酶在催化时,首先与虫荧光素

9、酰腺苷酸(由Mg2+-ATP与虫荧光素复合而成)生成复合物,然后该复合物放出质子,酶变构导致虫荧光素氧化脱羧并发射光子。另一生物发光体系是水母发光蛋白,它不需要加入荧光素酶,只需加入Ca2+或Se2+便能通过分子内反应而发出max为470 nm的蓝光。生物发光体系的特点是发光效率、灵敏度、选择性均非常高。其他无机氧化剂的化学发光体系近年来，一些科学家就一些无机氧化剂直接氧化一些物质产生化学发光的化学发光新体系,如高锰酸钾、铈()、过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸盐和铁氰化钾等在药物分析方面的应用展开了研究，并取得了一定的成果。总结与展望总之,免疫学分析技术的发展也就是标记学的发展。目前,多种免疫分析标记方法并存,相互竞争,相互补充,如将EIA 与荧光技术或化学发光技术结合,形成荧光酶免疫分析(FEIA)及化学发光酶免疫分析(CLEIA),从而大大提高灵敏度,增大检测范围。但不管怎样,目前还没有一种免疫分析标记技术是完美无缺的。因此,各种标记技术还需要不断发展和完善,并且人们还在不断研究,以开发出更新、更理想的免疫分析标记技术。