用基因芯片检测单核苷酸多态性反应原理hldn.docx

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1、用基因芯芯片检测测单核苷苷酸多态态性反应应原理*中国生物物工程杂杂志Chiina Biootecchnoologgy, 20005, 25(11):52256张小燕11*左明雪1张占军2王忠3李瑶4(1北京京师范大大学生命命科学院院北京100087552北京京中医药药大学临临床医学学院北京京10000866)(3中国国中医研研究院西西苑医院院北京100009114复旦旦大学生生命科学学院上海海20000322）摘要基因因芯片技技术因其其高通量量、高效效率的特特点被用用于第三三代遗传传标记单单核苷酸酸多态性性位点的的筛选。近近几年SNP芯片研研究在反反应原理理方面取取得了重重大进展展，其中中包括

2、基基于核酸酸杂交反反应的芯芯片、基基于单碱碱基延伸伸反应的的芯片、基基于等位位基因特特异性引引物延伸伸反应的的芯片、基基于“一步法”反应的的芯片、基基于引物物连接反反应的芯芯片、基基于限制制性内切切酶反应应的芯片片、基于于蛋白DNA结合反反应的芯芯片，及及基于荧荧光分子子DNA结合反反应的芯芯片。比比较了上上述各种种芯片技技术方法法的优劣劣，为进进一步科科研工作作的开展展提供了了参照，并并综述了了SNP芯片在在疾病基基因组学学、药物物遗传学学和个体体识别等等科研领领域的应应用，且且对其今今后的发发展方向向进行了了阐述。关键词基基因芯片片单核苷苷酸多态态性疾病病基因组组学收稿日期期：200050

3、125修回日日期：200050901*国家自自然科学学基金资资助项目目（9022090015）*电子子信箱：doddderrdoddderryaahooo.coom.ccn随着20001年人类类基因组组研究的的完成,涌现出出大量可可利用且且亟待分分析筛选选的基因因组数据据,这就要要求有大大规模、迅迅速的检检测方法法与技术术来完成成大量候候选基因因中的遗遗传标记记的筛选选。单核核苷酸多多态性（sinnglee nuucleeotiide pollymoorphhismm, SSNP）与基基因芯片片（miccroaarraay）相结合合的战略略正是应应这一需需求脱颖颖而出,成为生命命科学界界关注的

4、的新焦点点。1SNPP芯片技技术简介介单核苷苷酸多态态性是由由基因组组核苷酸酸水平上上的变异异引起的的DNA序列多多态性,包括单单个碱基基的转换换、颠换换以及单单个碱基基的缺失失和插入入。其中中最少的的一种等等位基因因在群体体中的频频率不小小于1%。作为为第三代代遗传标标记的SNP在人类类基因组组中约每每1 0000个碱基基就出现现一个，并并具有如如下特点点：(1)数量多,分布广广泛；(2)遗传稳稳定；(3)易于基基因分型型；(4)适于快快速、高高通量检检出。SNP自身的的特性决决定了它它比其他他两类遗遗传标记记更适合合于对复复杂性状状的遗传传解析以以及基于于群体基基因识别别等方面面的研究究,

5、促使人人们不断断地寻找找新的SNP标记和和革新SNP检测技技术。目前已有有多种方方法可用用于SNP检测,传统的SNP检测方方法是采采用一些些已有的的成熟技技术,如DNA测序、限限制性酶酶切片段段长度多多态性(reestrricttionn frragmmentt leengtth ppolyymorrphiism, RFFLP)、单链链构象多多态性(siinglle sstraand connforrmattionnal pollymoorphhismm ,SSSCPP)、变性性高效液液相色谱谱(deenatturiing higgh pperfformmancce lliquuid chrr

6、omaatoggrapphy, DHHPLCC)等。这这些技术术虽在某某种程度度上能完完成对SNP的检测,但距快快速、高高效、自自动化的的目标还还相差甚甚远。DNA芯片技术术是近年年来新开开发的一一种DNA序列变变异检测测工具。其其原理是是利用目目标DNA与支持持物上所所固定的的密集的的寡核苷苷酸探针针阵列进进行等位位基因特特异性反反应,根据反反应后信信号的有有无和强强弱确定定SNP位点。近近年来随随着复杂杂性疾病病研究的的深入，以以及可利利用的基基因组数数据的增增加,基于各各种原理理的SNP芯片被被开发出出来，以以适应不不同目的的、规模模和条件件的基因因分型。2SNPP芯片反反应原理理的研究

7、究进展2.1基于核核酸杂交交反应原原理的SNPP芯片等位基因因特异性性寡核苷苷酸杂交交反应(alllelle-sspeccifiic ooliggonuucleeotiide hybbriddizaatioon, ASOO)是利用用固定在在芯片上上的寡核核苷酸与与标记DNA靶标的的序列特特异性杂杂交，其其分辨原原理基于于单碱基基错配对对DNA双螺旋旋结构稳稳定性的的影响，因因此分辨辨率依赖赖于反应应中SNP位点前前后的寡寡核苷酸酸序列和和杂交反反应条件件。该反反应很早早已经被被广泛使使用，其其优点是是原理简简单、操操作方便便，缺点点是由于于非特异异性杂交交导致分分辨率不不高，易易产生假假阳性1

8、。20055, 225(111)张小燕等：用用基因芯芯片检测测单核苷苷酸多态态性反应应原理中国生物物工程杂杂志 Chhinaa Biioteechnnoloogy Voll.255 Noo.111 200052.2基基于单碱碱基延伸伸反应原原理的SNP芯片单碱基延延伸反应应(siinglle bbasee exxtennsioon，SBEE)，又名名微测序序法(miinissequuenccingg),其原理理如图1所示，根根据待检检测样品品的SNP位点5端序列列设计引引物（不不包括SNP位点）并并将其直直接固定定在芯片片上，以以待测样样品的PCR产物作作为模板板，加以以用各色色荧光或或者其他

9、他标记物物标记的的4种ddNNTP，在适适当的条条件下，在DNA多聚酶的催化下与PCR产物配对的引物直接在芯片上进行固相单碱基延伸反应，根据样本序列中特异的碱基（SNP）加入特异的ddNTP，检测荧光的种类便知SNP信息2。DNA多聚酶的特异性使该方法的敏感度和分辨率均较高，但其缺点是必须使用多色荧光系统以及相应的检测系统，而且多种染料的激发光和发射荧光的光谱往往会有较大部分的重叠，从而干扰对荧光强度的测量精度3。图1单碱基延伸反应（SBE）检测SNP基因型(a):寡核苷苷酸引物物固定于于芯片上上； (bb):待待测PCR产物与与引物碱碱基配对对；(c): DDNA聚合酶酶作用下下的单碱碱基延

10、伸伸反应；(d):荧光光种类的的检测Fig. 1SSNP gennotyypinng bby ssinggle basse eexteensiion(SBEE)(a)：Oliigonnuclleottidee prrimeers werre iimmoobillizeed oon mmicrroarrrayy; (b):PCRR prroduuctss annd pprimmerss paaireed bbasees; (c): SSinggle basse eexteensiion cattalyyzedd byyDNA pollymoorphhismm; (d): Deetecctioon

11、 oof ffluooresscennce 20022年，Hirrschhhorrn等4创建建的SBEE-TAAGS法，原原理如图图2所示，在在芯片上上进行单单碱基延延伸反应应时，使使用了具具有双重重功能的的引物，即即除了等等位基因因特异性性的序列列，还另另有一段段具有特特定序列列的标签签(taag)。由于于对应于于每一个个位点都都有一个个不同的的标签，基基因型的的检测反反应能够够以一个个多重形形式进行行，通过过引物上上的标签签和固定定在芯片片上的互互补的标标签相结结合，不不同位点点的目标标产物能能够在芯芯片上相相分离。这这种方法法的优点点是简单单、便宜宜，而且且精确度度较SBE高，用用此方法

12、法对芯片片上的100个SNP位点、5 0000多个基基因型进进行了试试验，结结果证明明正确率率是99%5。图2SBBETAGGS检测SNNP基因型型Fig. 2SSNP gennotyypinng bby SSBETAGGS(a): SBBE-TTAGSS duual priimerrs; (b): SSBETAGGS rreacctioon2.3基基于等位位基因特特异性引引物延伸伸反应原原理的SNP芯片等位基因因特异性性引物延延伸(alllelle-sspeccifiic pprimmer eloongaatioon)也是依依赖于DNA聚合酶酶的对错错配碱基基的敏感感性进行行的6。它它的原理

13、理与SBE大致相相同，但但是引物物的3端为SNP位点，且且用以扩扩增的是是dNTTP而非ddNNTP，因此引引物末端端延长的的并非单单个碱基基，而是是与靶标标互补的的核苷酸酸序列7。与SBE相比，该该方法只只需要单单色荧光光系统，而而且荧光光信号较较强。其其缺点是是特异性性不强，假假阳性率率较SBE高8。为了克服服这一缺缺点，Omeaara等9将三三磷酸腺腺苷双磷磷酸酶引引入到等等位基因因特异性性延伸反反应中以以控制反反应特异异性。在在该酶介介导的等等位基因因特异性性延伸反反应中利利用了错错配引物物和完全全匹配引引物延伸伸反应中中的动力力学差异异，完全全匹配引引物的反反应速度度较快，能能够在酶

14、酶切之前前完成引引物链的的延伸，而而错配引引物速度度很慢，引引物延伸伸速度小小于降解解速度，最最后被完完全消化化。该方方法克服服了假阳阳性高的的缺点,适合于于精确有有效的大大规模基基因分型型。反转录酶酶在DNAA-RNNA双螺旋旋中区别别终端错错配的能能力也被被用于提提高芯片片上单核核苷酸多多态性分分型的精精确性。其其分辨原原理基于于由反转转录酶介介导的等等位基因因特异性性引物沿沿着RNA靶标延延伸反应应的特异异性。该该方法能能真实反反映出转转录后的的基因序序列中的的单个位位点的等等位基因因的情况况，对于于研究基基因转录录过程有有一定的的帮助10。但但是由于于其假阳阳性较高高和反应应条件较较苛

15、刻，所所以目前前研究较较少。2.4基基于“一步法”反应原原理的SNP芯片虽然芯片片筛选的的最大特特点是高高通量，但但无论是是单碱基基延伸反反应还是是等位基基因特异异性引物物延伸反反应均需需要靶标标的扩增增、制备备和纯化化等步骤骤，从而而使大规规模的基基因分型型工作费费时耗力力。Hubeer等11建立立了将基基因组DNA直接用用于基因因分型“一步法”芯片系系统，所所谓“一步法”，即将将用于制制备分型型靶标的的多重扩扩增反应应和用于于基因分分型的等等位基因因特异性性延伸反反应在芯芯片平台台上相结结合，使使两者直直接在芯芯片上的的单个反反应步骤骤中完成成。这种种在芯片片平台上上进行的的多重PCR固相

16、扩扩增反应应为SNP检测提提供了一一个有力力的工具具，避免免了芯片片外繁琐琐的液相相PCR制备靶靶标的步步骤，大大大提高高了芯片片检测的的效率，该该方法在在诊断和和大规模模的基因因分型中中具有很很好的应应用前景景12。2.5基基于引物物连接反反应原理理的SNP芯片该方法与与杂交延延伸相似似，不同同之处在在于，它它利用T4噬菌体DNA连接酶酶连接DNA切口，以以及粘性性末端在在探针末末端连接接上特殊殊设计的的且与样样品DNA中SNP位点下下游片段段完全互互补的荧荧光标记记探针13。在在该方法法中，等等位基因因的可变变碱基设设计在探探针3末端，与与靶序列列的可变变形式对对应。与与样品DNA完全匹匹

17、配的探探针能够够在连接接酶的催催化下与与荧光探探针连接接而不被被洗脱，从从而检测测到荧光光信号。常常用的酶酶还有热热稳定性性DNA连接酶酶，因为为它能高高特异性性地检测测DNA碱基改改变，并并在较大大的温度度范围内内都有活活性14。2.6基基于限制制性内切切酶反应应原理的的SNP芯片Yoshhinoo等15构建建的单细细菌磁粒粒子（BMPS）微阵阵列系统统利用了了限制性性酶切的的原理检检测了人人的12号染色色体上的的ALDDH2基因的的寡核苷苷酸多态态性位点点。其步步骤是直直接将末末端标记记的PCR产物固固定在BMPPS上，限限制性酶酶切后检检测荧光光强度值值。如果果被检测测基因是是一种可可以

18、被酶酶切的基基因型，那那么荧光光标记末末端被切切下洗脱脱，检测测不到荧荧光或者者荧光较较弱，反反之则较较强。该该法原理理和操作作简单，酶酶切特异异性强，但但是由于于酶切可可能不完完全，所所以假阳阳性率较较高。2.7基基于蛋白白DNA结合反反应原理理的SNP芯片该方法的的原理是是在开放放模式的的DNA芯片上上进行非非特异性性核酸杂杂交,再用荧光光标记的的错配结结合蛋白白（Mutts）与错错配碱基基结合，根根据荧光光的强弱弱来判定定碱基的的错配与与否，以以此判定定SNP位点16。目目前所用用的大多多数基于于芯片的的SNP检测方方法只能能适用于于已知突突变的检检测，但是Mutts法对这这些技术术进行

19、了了补充，由由于该方方法基于于错配原原理而且且对于突突变位点点在探针针中的位位置和探探针长度度的要求求不像其其他芯片片那样苛苛刻，因因而适合合于新的的SNP位点的的发现。但但该方法法的缺点点是：(1)由于检检测基础础是错配配杂交，因因此应尽尽量采用用杂交效效率比较较高的主主动杂交交芯片，如如微电子子芯片，这这就大大大限制了了其应用用范围；(2)各种类型的的错配碱碱基对与与错配结结合蛋白白的结合合能力不不同而引引起了假假阳性率率的提高高，使得得用于判判定SNP基因型型的准则则难以确确定。2.8基基于荧光光分子DNA结合反反应原理理的SNP芯片除了DNNA和蛋白白相互作作用外，Gotto等17用荧

20、荧光分子子丫啶酯酯对错配配DNA进行检检测以分分析点突突变的SNP芯片方方案，又又称为杂杂交保护护机制（HPA）。在在芯片上上固定有有在SNP位点处处标记了了丫啶酯酯的探针针，与单单链靶标标杂交成成双链DNA，洗脱脱后碱基基错配处处的双链链DNA解链环环化，释释放出荧荧光分子子，而完完全匹配配的探针针处则不不发生这这种情况况，因此此只有完完全匹配配的探针针才能检检测到荧荧光。该该方法较较蛋白DNA结合反反应的芯芯片简单单，只需需单一荧荧光标记记，不需需主动杂杂交，但但是假阳阳性率得得不到保保证，而而且不适适用于新新的SNP位点的的发现。综上所述述，不同同方法有有其适用用范围和和优缺点点，研究究

21、者应根根据不同同的目的的选取合合适的方方法，以以达到最最大的检检出效率率和准确确性。3SNPP芯片的的应用和和前景3.1在疾病病基因组组研究中中的应用用遗传性疾疾病的基基因诊断断是采用用分子生生物学的的方法在在DNA和RNA水平上上对某一一疾病的的相关基基因进行行分析，从从而对特特定的疾疾病进行行诊断。SNP芯片的的出现在在某种程程度上说说，恰恰恰是为基基因诊断断的广泛泛应用提提供了很很好的工工具和平平台，在在芯片上上根据相相关致病病基因特特定的基基因组序序列，针针对各种种突变设设计相应应的核苷苷酸探针针进行检检测。随随着人类类基因组组计划和和后基因因组计划划的开展展越来越越多的与与遗传病病相

22、关的的基因被被揭示出出来，基基因突变变检测技技术已得得到了快快速发展展，成为为诊断多多种遗传传病的常常规手段段18。3.2在在药物遗遗传学研研究中的的应用药物遗传传学是药药物基因因组学研研究内容容之一，其其侧重点点是研究究药物反反应多态态性的遗遗传基础础以及将将研究成成果用于于药物开开发和个个性化治治疗。药药物遗传传学的研研究模式式通常是是通过基基因组测测序发现现基因多多态性，如SNP,然后进行药理和毒理学研究，检测其对临床药物反应多态性的影响。在研究中利用SNP芯片技术进行基因功能及其多态性研究，以确认与药物效应、药物吸收、代谢、排泄等相关的基因，并查明这些基因的多态性，这样就加速了药物基因

23、组学的发展；另一方面，芯片技术利用药物基因组学的研究成果，根据基因型将人分群，以实现药物基因组学研究的目的和价值。因此芯片技术对药物基因组学研究影响重大19。3.3在在个体识识别中的的应用人们的遗遗传背景景有99.9%是相同同的，但但是每个个人却在在各个方方面表现现得千差差万别，从从本质上上说，这这些都是是由于剩剩余的0.11%的差别别造成的的，这些些差别即即多态性性。SNP芯片目目前已被被用于这这些多态态性的鉴鉴别，以以期制作作个人鉴鉴别的“基因身身份证”。这些芯芯片的设设计思路路是，先先根据SNP位点的的分布特特点和频频率选择择一定数数量的位位点，通通过计算算这些位位点的个个体识别别率区分

24、分出世界界上的任任何一个个人,然后根根据这些些位点各各自独特特的核苷苷酸序列列，设计计寡核苷苷酸探针针，通过过一定的的流程制制成SNP芯片。当当一个人人的基因因组DNA经过抽抽提、PCR标记和和杂交以以后会得得出各个个位点的的结果，这这些数据据就代表表了一个个人的身身份。一一串符号号就是某某个人的的基因身身份证19。总之，SSNP芯片已已经，并并将继续续被用于于生命科科学研究究及实践践，其高高效、高高通量的的优点必必将使它它在医学学、微生生物学、中中药学、遗遗传学、司司法等领领域得到到广泛应应用，在在人类探探索自身身生命奥奥秘的进进程中发发挥举足足轻重的的作用。参考文献献1 Ji M, Hou

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41、ggy hhas beeen uusedd too seelecct tthe thiird genneraatioon ggeneeticc maarkeersinngleenuccleootidde ppolyymorrphiism forr itts hhighhthrrougghouut aand higgheffficiienccy ccharractter. SNNP mmicrroarrrayy teechnnoloogy hass obbtaiinedd grreatt deevellopmmentt inn thhe ffielld oof tthe reaactiion p

42、riinciiplee inn reecennt yyearrs, inccluddingg miicrooarrrayss baasedd reespeectiivelly oon ooliggonuucleeotiide hybbriddizaatioon rreacctioon, on sinnglee baase exttenssionn reeacttionn, oon aalleelespeeciffic priimerr ellonggatiion reaactiion, onn“onee sttep metthodd”reaactiion, onn prrimeer lliga

43、atioon rreacctioon, on resstriictiion enddonuucleeasee reeacttionn, oon DDNAprooteiin iinteeracctioon aand on DNAAfluuoreesceencee innterracttionn. Alll abbovee meethoods werre ccomppareed tto pprovvidee a reffereencee foor tthe futturee reeseaarchh, aand thee apppliicattionn off SNNP mmicrroarrrayy waas ssummmariizedd inn thhe ffiellds of disseasse ggenoomiccs, meddicaal ggeneeticcs aand inddiviiduaal iidenntifficaatioon. Thee peersppecttivee off thhis tecchnoologgy wwas alsso ddesccribbed.Key worrdsGGenee miicrooarrraySSingglenuccleootidde ppolyymorrphiismDDiseeasee geenommicss