高技术产业化专项项目资金申请报告21842.docx

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1、农业产业化龙头企业吉林市科大实用技术开发有限公司年产150000吨吨基因重重组纤维维素酶系系列产品品项目国家高技术术产业化化专项项目资金申申请报告告联 系 人人：郝 其 睿睿联系电话：13550099807798电子信箱：tiddewaave_nett1663.ccom吉林省吉林林轻工业业设计院院有限公公司2008年年11月月8日农业产业化化龙头企企业吉林市科大大实用技技术开发发有限公公司年产150000吨吨基因重重组纤维维素酶系系列产品品项目国家高技术术产业化化专项项目资金申申请报告告工程咨询证证书编号号工咨甲1003166100001项目名称：年产1150000吨基基因重组组纤维素素酶系列

2、列产品项项目企业名称：吉林市市科大实实用技术术开发有有限公司司法人代表：王文刚刚公司地址：吉林高高新技术术产业开开发区三三号路1151号号2008年年11月月8日目录项目资金申申请报告告5一 项目建建设的意意义和必必要性51 国内外外现状及及技术发发展趋势势662 基因重重组纤维维素项目目对相关关产业发发展的作作用与影影响73 该项目目对相关关产业的的影响74 市场分分析85 与国家家技术产产业化专专项总体体思路、原原则、目目标等关关联情况况10二 项目技技术基础础1001 项目成成果来源源及知识识产权情情况1002 已完成成的研究究开发工工作及中中试情况况和鉴定定年限113 技术或或工艺特特

3、点及现现有技术术或工艺艺比较所所具有的的优势124 该项目目重大关关键技术术的突破破对行业业技术进进步的重重要意义义和作用用119三 项目建建设方案案2001 建设规规模2002 建设的的主要内内容2003 采用的的工艺技技术路线线与技术术特点224 设备选选型2335 主要经经济技术术指标256 建设地地点2667 建设工工期及进进度安排排2298 建设期期管理30四 项目投投资3321 项目总总投资估估算依据据3332 投资估估算3333 投资使使用方案案3344 资金筹筹措方案案3345 项目资资本金构构成比例例3356 项目资资金落实实情况357 已完成成建设资资金的投投入3668 申

4、请国国债资金金理由、额额度及资资金使用用方案3669 贷款偿偿还计划划339五 环境保保护、资资源利用用、节能能与原材材料供应应及外部部配套条条件落实实情况3391 环境保保护3992 资源综综合利用用4413 节能措措施4114 劳动安安全、卫卫生与消消防4225 原材料料供应及及外部配配套条件件落实情情况455六 项目法法人基本本情况447七 项目财财务分析析、经济济分析及及主要指指标5001 经济分分析及主主要指标标5512 风险分分析5553 社会效效益5664 结论与与建议57八 项目招招标内容容588九 附件1、省农发发行50000万万元贷款款批复文文件；吉吉林银行行贷款合合同；交

5、交行贷款款合同；2、近三年年财务报报表（006年-08年年）；3、审计报报告、验验资报告告；4、科技成成果鉴定定证书、检检测报告告、省科科技厅重重大、重重点项目目合同、专专利专有有技术使使用许可可合同、关关于酶制制剂研发发项目的的合作协协议、技技术合同同；5、环境影影响报告告书的批批复6、建设工工程规划划许可证证；建筑筑工程施施工许可可证7、国有土土地使用用证；8、纤维素素酶项目目备案批批复；项项目可研研报告批批复9、生物产产业发展展“十一五五”规划10、关于于召开“十一五五”国家科科技支撑撑计划的的通知11、关于于公布农农业产业业化市级级重点龙龙头企业业名单的的通知12 、产产品购销销合同及

6、及包销承承诺书13、用户户使用报报告书14、工程程进度图图片十 真实性性声明农业产业化化龙头企企业吉林市科大大实用技技术开发发有限公公司年产150000吨吨基因重重组纤维维素酶系系列产品品项目项目资金申申请报告告基因重组纤纤维素酶酶系列产产品项目目是吉林林市政府府、吉林林高新技技术产业业开发区区重点招招商引资资项目。该该项目是是国家8863计计划项目目蛋白质质基因重重组技术术的延续续，项目目采用了了国际前前沿的生生物工程程基因重重组技术术，构建建了新的的工程菌菌株，该该菌株发发酵活力力及耐高高温等技技术性能能达到国国际领先先水平，在在我国首首次开发发了具有有自主知知识产权权的基因因重组纤纤维素

7、酶酶工程菌菌株，并并将首次次利用自自主开发发的酶制制剂工程程菌株进进行产业业化生产产。项目承担单单位吉林林市科大大实用技技术开发发有限公公司是以以酶制剂剂为主导导产品的的生物工工程高新新技术企企业，公公司与中中国科技技大学、江江南大学学、吉林林大学生生命科学学院酶工工程国家家重点实实验室、FFishher实实验室、吉吉林农业业大学食食品科学学与工程程实验室室等大学学和科研研院所形形成了紧紧密合作作，公司司研发团团队、工工艺技术术团队由由国内一一流水平平的专家家组成；公司管管理规范范，规章章制度健健全；项项目土建建、主体体设备制制造、内内部装置置安装已已经完成成，配套套设备采采购安装装及GMMP

8、装饰饰正在进进行，项项目建设设资金投投入已经经达到558000万元，占占项目建建设资金金投入总总额688.233%，申申请国债债资金要要件齐全全，项目目承担单单位具备备国债资资金项目目实施条条件和能能力。一、项目建建设的意意义和必必要性1、国内外外现状及及技术发发展趋势势20世纪770年代代以来，市市场这只只“看不见见的手”使传统统的工业业文明达达到了鼎鼎盛时期期。工业业化在创创造传统统工业文文明的同同时，也也对现代代经济社社会发展展的生态态基础造造成了根根本性的的破坏，资资源、环环境和生生态危机机日益严严重，其其直接原原因是118世纪纪以来造造成人与与自然尖尖锐对立立的非持持续的工工业生产产

9、技术，其其本质在在于单纯纯的市场场调节已已无力减减少技术术发展的的边际外外部费用用递增趋趋势。生物技术革革命将促促使有害害生态环环境的技技术向无无害化并并能保护护生态环环境的方方向发展展，从而而引起了了社会生生产技术术体系的的变化和和飞跃。生生物技术术创新及及其产业业化，将将为人类类社会创创造新的的、更高高水平的的文明开开辟了广广阔的空空间。运运用生物物工程技技术，将将使经济济发展投投入的资资源少，利利用率高高，产出出的产品品或服务务多，废废弃物少少，因此此，人类类将对生生物工程程技术产产品的需需求也将将不断增增加，生生物技术术在产业业结构调调整中的的作用也也将不断断提高，生生物工程程技术创创

10、新将日日益被重重视，生生物技术术产品的的市场将将越来越越广阔。生物酶制剂剂作为现现代工业业不可或或缺的催催化剂，主主要技术术一直为为西方发发达国家家所垄断断，尤其其是高活活力的纤纤维素酶酶，基因因重组工工程菌株株一直被被丹麦诺诺维信和和美国杰杰能科等等少数西西方发达达国家的的企业所所垄断，我我国迄今今为止尚尚无使用用基因重重组工程程菌株进进行产业业化生产产的企业业。构建建具有自自主知识识产权的的基因重重组纤维维素酶工工程菌株株，生产产高活力力、热稳稳定性好好的纤维维素酶是是目前我我国酶制制剂行业业的发展展方向，因因此，国国务院办办公厅颁颁发生生物产业业发展“十一五五”规划（国国办发200072

11、3号号）明确确强调支支持纤维维素酶和和半纤维维素酶基基因工程程菌株技技术开发发及产业业化应用用,也是是国家科科技部科科技支撑撑计划“生物技技术产品品中试与与规模化化生产配配套技术术与工艺艺的研究究与示范范”重点支支持项目目。2、基因重重组纤维维素酶项项目对相相关产业业发展的的作用与与影响2.1 提提升酶制制剂行业业整体水水平由于该项目目是我国国酶制剂剂行业第第一个采采用具有有自主知知识产权权的工程程菌株进进行产业业化生产产的项目目，因此此，对提提高我国国酶制剂剂行业和和国外企企业的竞竞争能力力，提升升行业整整体水平平具有积积极意义义。2.2 提提高用户户产品质质量、降降低生产产成本采用该项目目

12、产品，对对提高我我国纺织织行业、饲饲料行业业、中药药行业产产品质量量，降低低生产成成本，增增强产品品的市场场竞争能能力具有有重要作作用。3、该项目目对关联联产业的的影响3.1 促促进非粮粮燃料酒酒精尽快快实现产产业化,化解能能源危机机,保障障粮食安安全近年来，由由于能源源紧缺和和技术手手段的缺缺乏，我我国不得得不以粮粮食作为为原料生生产燃料料酒精，但但是由于于保障粮粮食安全全的需要要，发展展非粮燃燃料酒精精是现阶阶段解决决能源短短缺的必必由之路路。秸秆秆燃料酒酒精的产产业化生生产，必必须使用用纤维素素酶，因因此，该该项目的的产业化化是非粮粮燃料酒酒精产业业化生产产的关键键因素之之一，非非粮燃料

13、料酒精的的产业化化对缓解解能源危危机、保保障粮食食安全具具有重要要的战略略意义。3.2 推推动农业业产业结结构的调调整该项目生产产的主要要原材料料是秸秆秆，由于于原料在在产地必必须进行行初发酵酵，因此此，在农农村将产产生新的的初发酵酵行业，同同时，基基因重组组纤维素素酶面市市后，在在农村还还将产生生以纤维维素酶作作为催化化剂，生生产秸秆秆糖化饲饲料的发发酵企业业。因此此，该项项目对地地方农业业产业结结构调整整，加快快社会主主义新农农村建设设，拉动动农民致致富，加加快农村村小康社社会进程程具有积积极意义义。3.3 推推动地方方经济的的发展吉林市地处处边疆近近海省，自自然环境境优越，是是我国最最具

14、魅力力的城市市之一，是是福布斯斯排行榜榜评价最最适合发发展工业业的城市市，是吉吉林省玉玉米，水水稻的主主要产区区之一。但但是，吉吉林市经经济发展展不平衡衡，缺少少生物工工程高新新技术项项目。引引进生物物工程高高新技术术企业，扶扶持地方方农业产产业化龙龙头项目目是吉林林市经济济发展的的重大举举措之一一，因此此，该项项目成为为吉林市市政府和和吉林高高新技术术产业开开发区重重点招商商引资项项目。3.4 有有利于资资源再利利用、发发展循环环经济、提提高资源源经济价价值玉米及其它它粮食秸秸秆多年年以来一一直作为为废弃物物或燃料料，其经经济价值值几乎趋趋于零。基基因重组组纤维素素酶项目目采用的的主要原原料

15、是玉玉米秸秆秆。这一一资源是是可再生生资源，经经过粗加加工，每每吨玉米米秸秆价价格可以以达到66009000元，而而制成纤纤维素酶酶，以粗粗加工的的秸秆为为基数，每每吨秸秆秆产生的的价值可可提升十十倍左右右，提高高了资源源利用率率，提升升了资源源的经济济价值。4、市场分分析该项目产品品的主要要应用领领域为饲饲料、麻麻棉纺织织、制药、生物发发酵等行行业，该该项目产产品是上上述行业业产品生生产过程程中不可可或缺的的添加剂剂。据不完全统统计，国国内市场场纤维素素酶年需需求大约约12万万吨以上上，055年至006年该该类产品品年需求求增幅为为38；国际际市场年年需求大大约400万吨，主主要集中中在欧美

16、美地区，占占国际市市场总消消耗量的的70，而且且需求量量正在以以每年88的速速度增长长。此外外，除燃燃料酒精精行业外外，用户户直接使使用的是是复合酶酶，纤维维素酶在在复合酶酶中添加加比例一一般为880左左右，因因此，纤纤维素酶酶市场需需求量的的统计一一般以复复合酶用用量为依依据。复复合酶年年用量统统计如下下（详见见附件）：4.1 饲饲料行业业：我国国年产饲饲料1亿亿吨左右右，按每每吨饲料料添加00.5公公斤复合合酶计算算，年复复合酶用用量约为为5万吨吨左右，其其中纤维维素酶添添加量为为4万吨吨左右。4.2 麻麻棉纺织织行业：我国洗洗涤复合合酶年用用量2万万吨左右右，其中中纤维素素酶添加加量为1

17、1.6万万吨左右右。4.3 啤啤酒行业业：我国国年产啤啤酒35500万万吨左右右，需大大麦或小小麦1660万吨吨，按每每吨添加加1.55公斤计计算，啤啤酒复合合酶年用用量2.4万吨吨左右，其其中纤维维素酶添添加量为为2万吨吨左右。4.4 燃燃料酒精精行业：该行业业为纤维维素酶潜潜在的巨巨大市场场。目前前我国年年产燃料料酒精1160万万吨，预预计20020年年年产量量将达到到80009000万吨。纤纤维酶是是生产非非粮燃料料酒精必必须使用用的催化化剂，按按每6吨吨原料生生产1吨吨燃料酒酒精计算算，预计计20220年，秸秸秆等非非粮原料料年用量量最少448000万吨，纤纤维素酶酶投料比比按每吨吨原

18、料33计算，年年需求量量将达到到14万万吨左右右。4.5 产产品销售售 酶制剂生产产厂家一一般不直直接面对对终端用用户，只只面对销销售代理理商。因因此，我我公司现现阶段只只向相关关代理商商销售产产品并已已签订了了意向协协议，相相关情况况如下：国内销售：我公司司已经和和最大的的销售商商夏盛集集团签订订了意向向销售合合同，夏夏盛集团团还出具具了产品品包销承承诺书及及该公司司和用户户签订的的销售合合同及供供货计划划。产品出口：我公司司正在和和杰能科科公司、嘉嘉吉公司司进行接接洽，公公司经营营副总曾曾任杰能能科公司司技术负负责人，熟熟悉国外外市场，产产品出口口前景广广阔。5、与国家家高技术术产业化化专

19、项总总体思路路、原则则、目标标等关联联情况该项目属于于生物技技术类，是是国务院院办公厅厅生物物产业发发展“十一五五”规划（国国办发20007223号）微微生物技技术专项项重点支支持项目目；是国国家科技技部科技技支撑计计划“生物技技术产品品中试与与规模化化生产配配套技术术与工艺艺的研究究与示范范”重点支支持项目目；该项项目20007年年已经列列入吉林林省科技技发展计计划，分分别被评评为重大大和重点点项目并并获得省省长基金金支持；该项目目是地方方农业产产业化龙龙头项目目，是国国债资金金重点支支持的项项目。二、项目技技术基础础1、项目成成果来源源及知识识产权情情况1.1 科科大公司司与中国国科技大大

20、学易元元生物技技术有限限公司合合作，取取得了基基因重组组纤维素素酶原始始菌株构构建技术术和菌株株的使用用权（详详见附件件专利利的专有有技术使使用合同同）。1.2 由由科大公公司提供供原始菌菌株、菌菌株构建建技术及及工艺方方案，与与吉林农农业大学学合作，取取得了基基因重组组纤维素素酶第二二代工程程菌株及及菌株构构建技术术的所有有权（详详见附件件技术术合同）。2、已完成成的研究究开发工工作及中中试情况况和鉴定定年限2.1 本本项目已已完成基基因重组组纤维素素酶工程程菌株构构建，该该菌株现现保存于于吉林农农业大学学食品科科学与工工程学院院实验室室深冻冰冰箱中。2.2 220088年初已已经在吉吉林农

21、业业大学完完成了中中试，中中试结果果与实验验室试验验结果一一致（详详见吉林林农业大大学生化化实验室室检测测报告）。2.3 中中试及小小规模生生产样品品已交付付用户使使用，用用户已出出具使用用报告（详详见宁宁夏夏盛盛果汁果果酒酶有有限公司司传真函函）。2.4 科科大公司司技术专专家已经经针对基基因重组组纤维素素酶生产产工艺条条件开发发了连续续发酵等等生产工工艺。此此外，公公司技术术专家有有十年以以上纤维维素酶生生产经验验，已经经掌握了了成熟的的纤维素素酶生产产工艺，因因此，可可以实现现产业化化生产。2.5 公公司专家家已经设设计了纤纤维素酶酶系列产产品生产产线，主主体设备备及内部部构件和和管路连

22、连接已经经完成。配配套设备备及GMMP装饰饰工程完完工后即即可投入入生产。2.6 必必要的说说明。纤纤维素酶酶工程菌菌株的构构建采用用的是国国际前沿沿的生物物工程技技术及基基因打靶靶技术，但但是，酶酶制剂生生产工艺艺是公知知技术。此此外，生生产过程程的发酵酵条件优优于实验验室条件件，因此此，只要要中试设设定条件件与生产产工艺条条件一致致，那么么，所生生产出来来的产品品性能将将优于中中试。3、技术或或工艺特特点以及及与现有有技术或或工艺比比较所具具有的优优势3.1 技技术原理理3.1.11 纤维维素酶自然界中纤纤维素的的降解需需要内切切葡聚糖糖酶和外外切葡聚聚糖酶共共同作用用。纤维维素降解解过程

23、首首先被外外切纤维维素酶的的CBDD吸附到到不溶性性纤维素素表面，使使结晶结结构的纤纤维素长长分子链链开裂，聚聚集结构构解聚，长长链分子子末端部部分发生生游离从从而为纤纤维素水水解酶类类的作用用提高了了可及性性和反应应性，从从而使纤纤维素易易于水化化；之后后内切酶酶作用于于经外切切活化的的纤维素素，分解解其-1，44键，产产生纤维维二糖、三三糖等短短链低聚聚糖。在在内切葡葡聚糖酶酶、外切切葡聚糖糖酶和-1，44葡萄糖糖苷酶的的协同作作用下，纤纤维素的的-1，44糖苷键键逐步水水解，形形成纤维维寡糖和和葡萄糖糖。其催催化机理理与溶菌菌酶相似似，糖苷苷配基的的脱去涉涉及2个个保守羧羧基氨基基酸分别

24、别作为质质子供体体和亲核核试剂执执行酸碱碱催化的的双置换换反应；谷氨酸酸位于细细菌和真真菌CBBH，EEG及葡葡萄糖苷苷酶的活活性位点点。协同同作用其其作用顺顺序不是是绝对按按各酶的的功能也也不是简简单固定定的。CCBH和和EG都都能引起起纤维素素的分散散和脱纤纤化，因因此纤维维素的结结晶结构构被打乱乱导致变变形，使使纤维素素酶能深深入纤维维素分子子界面之之间，从从而使纤纤维素孔孔壁、腔腔壁和微微裂隙壁壁的压力力增大，水水分子的的介入又又使纤维维素分子子之间的的氢键被被破坏，产产生部分分可溶性性的纤维维的微结结晶，利利于进一一步降解解。3.1.22 基因因的同源源重组技技术基因的同源源重组技技

25、术（hhomoologgouss reecommbinnatiion），又又称基因因打靶（ggenee taargeetinng），指指外源DDNA与与受体细细胞染色色体DNNA上的的同源序序列之间间发生重重组并整整合在预预定位点点上，从从而改变变细胞遗遗传特性性的方法法。根据重组后后靶基因因的特征征可以分分为两种种类型：由于外源源序列的的引入或或部分取取代，靶靶基因原原有结构构被破坏坏，此即即为基因因破坏或或剔除； 靶基因的的全部序序列为新新的基因因所取代代。这一一新兴技技术已被被证明为为目前能能精确的的修饰基基因组的的最有效效方法，从从理论上上讲它将将使人类类能按设设计对极极其复杂杂的细胞

26、胞基因组组结构进进行定点点、定量量的改变变，从而而定向的的改变细细胞的遗遗传结构构和特征征。同源重组技技术的特特点为：同源重组组技术能能把外源源基因引引入染色色体DNNA的特特定片段段上，在在设计合合理的情情况下，同同源重组组技术可可对宿主主细胞染染色体基基因进行行精细的的改造；同源重组组后被击击中的基基因或新新引入的的基因随随染色体体DNAA的复制制而稳定定复制。3.2 技技术特点点或创新新点3.2.11 本项项目由于于在CBBH III上游游加入不不受葡萄萄糖抑制制的真核核启动子子PKII A，使使CBHH III不再受受到培养养基中葡葡萄糖影影响，获获得高效效表达，从从而促进进其他纤纤维

27、素酶酶基因的的协同表表达，较较大幅度度提高菌菌株在发发酵过程程中的产产纤维素素酶的能能力。3.2.22 几乎乎所有已已克隆的的纤维素素酶基因因都已在在大肠杆杆菌中得得到表达达。但是是这一体体系表达达率低，产产生的酶酶多数不不能分泌泌到胞外外。本项项目成果果使纤维维素酶在在原木霉霉宿主菌菌中获得得稳定高高效表达达，可以以用于大大规模培培养及工工业化生生产。3.2.33 本项项目对基基因工程程菌株的的培养及及产酶条条件进行行了摸索索，尝试试进行液液体培养养基深层层发酵，通通过分段段控制ppH值、温温度和溶溶解氧进进行发酵酵，发酵酵72小小时左右右酶活达达到最高高，为工工业化大大规模生生产纤维维素酶

28、提提供了参参考。3.3 技技术研制制报告纤维素酶属属诱导型型酶类其其多个酶酶组分的的表达调调控是一一个非常常复杂的的过程， 其中CCBH II具具有关键键的作用用。据报报道( Seiibotth eet aal.119977)，当当CBHH III基因缺缺失时，会会影响纤纤维素酶酶系其它它酶的表表达，而而缺失CCBH I，EEG IIII等等基因时时，只影影响自身身的表达达。另有有研究表表明CBBH III是木木霉纤维维素酶系系统中最最先表达达的酶，其其产物进进一步诱诱导纤维维素酶其其他酶如如CBHH I，EEG等酶酶基因的的表达。而而CBHH III基因的的表达又又受到葡葡萄糖的的抑制(St

29、eernbbergg & Manndell，19979)，因此此要提高高木霉的的纤维素素酶的产产酶能力力就可以以通过木木霉CBBH III基因因克隆，将将其构建建在不受受葡萄糖糖抑制的的真核启启动子下下游如PPKI，ccDNAA1等启启动子，使使CBHH III不再受受到培养养基中葡葡萄糖影影响而得得到高效效表达，从从而促进进其他纤纤维素酶酶基因的的协同表表达，较较大幅度度提高菌菌株在发发酵过程程中的产产纤维素素酶的能能力。由于木霉菌菌属于半半知菌，缺缺乏有性性阶段，对对其杂交交育种有有一定困困难。原原生质体体育种是是一种非非常有效效的方法法，木霉霉的转化化系统与与其他真真菌转化化系统相相似，

30、多多为使用用细菌来来源的质质粒构建建的载体体，在聚聚乙二醇醇（PEEG），山山梨醇和和氯化钙钙作用下下把目的的基因或或DNAA 片段段引入受受体原生生质体，经经过再生生和选择择获得转转化子。选选用一个个稳定的的选择标标记对建建立木霉霉转化系系统是非非常必要要的，木木霉转化化的选择择标记包包括营养养缺陷型型标记和和显性标标记两类类。前者者常用的的如PyyrG 或Pyyr-44，后者者常用的的有HmmR，bbenAA，和aamdss。本成果采用用先进的的分子生生物学技技术，构构建成功功高活力力纤维素素酶工程程菌体，超超过国内内目前使使用的生生产菌体体的产酶酶能力，达达到了国国际先进进水平。3.3.

31、11 供试试菌种 绿色色木霉GG1044中国科科学技术术大学生生命科学学学院基基因工程程实验室室保藏。3.3.22 启动动子选择择 PPKI A (0.44Kb)。3.3.33 载体体 ppUT (9.2Kbb) 中中国科学学技术大大学生命命科学学学院基因因工程实实验室构构建，包包含Been AA显性标标记。3.3.44培养基基及培养养条件 麦芽芽汁液体体培养基基pH 5.00，300，2220r/minn 培养养24hh。3.3.55 试剂剂 ppGEMM-T-eassy-vvecttor Kitt购自PPrommegaa 公司司，Taaq ppluss DNNA ppolyymerrase

32、e 购自自上海生生工公司司，限制制性内切切酶购自自Proomegga 公公司。3.3.66 真菌菌总DNNA 的的提取离心收集集菌体，加加入4000l DDNA 提取液液(500mmool/LL Trris-HCll，pHH9.00；122.5mmmoll/L EDTTA，ppH8.0)；充分振荡荡后加入入1000l 110%SSDS及及3000l氯化化苄振荡荡混匀，550保温11h，每每隔100minn振荡一一次；加入500l 33moll/L醋醋酸钠，离离心，收收集上清清，用异异丙醇沉沉淀得到到总DNNA。3.3.77 PCCR扩增增CBHH III序列根据已知知绿色木木霉cDDNA序序列

33、，设设计PCCR引物物，由上上海生工工公司合合成；PCR 扩增：用标准准PCRR反应体体系进行行PCRR反应。PCR循环环条件：预变性性94 3mmin，994 变性性50ss，511 复性性50ss，722 延伸伸1miin200s，335个循循环后再再延伸88minn。3.3.88 重组组质粒载载体pUUT-CCBH的的构建用Gell exxtraactiion试试剂盒从从胶中回回收PCCR产物物，得到到约1.6Kbb的CBBH III片段段，将其其用Kllenoow酶补补平后回回收纯化化。将pUTT质粒载载体在多多克隆位位点用EEcoRR I限限制性内内切酶消消化，产产生的33粘性突突出

34、末端端用Kllenoow酶补补平并将将其回收收纯化，将将上述两两个片段段以合适适的比例例建立反反应体系系，转化化大肠杆杆菌DHH5a，获获得重组组质粒载载体pUUT-CCBH。对对筛选到到的重组组质粒用用内切酶酶和PCCR进行行鉴定分分析，所所扩增的的片段含含有完整整的CBBH III序列列。3.3.99 重组组质粒载载体pUUT-CCE的构构建将pUT-CBHH质粒载载体在用用EcooR VV限制性性内切酶酶消化，产产生的33粘性突突出末端端用Kllenoow酶补补平并将将其回收收纯化，与与PKII A片片段以合合适的比比例建立立反应体体系，转转化大肠肠杆菌DDH5aa，获得得具有PPKI

35、A启动动子的重重组质粒粒载体ppUT-CE。3.3.110 ppUT-CE重重组质粒粒的转化化及重组组菌的筛筛选将构建的重重组质粒粒电转化化宿主菌菌G1004，利利用Been AA显性标标记进行行初筛；而后进进一步采采用液体体摇瓶培培养检测测发酵液液复筛，获获得一株株表达量量较高的的重组菌菌，命名名为G1104-CE。3.3.111 液液体培养养基深层层发酵在10 LL的通气气机械搅搅拌发酵酵罐中，接接种量为为10%，发酵酵过程采采取分段段控制ppH值、温温度和溶溶解氧的的工艺，发发酵722h左右右酶活力力最高，实实验室样样品酶活活力达到到：液体体32000u/ml。3.4 技技术的先先进性蛋

36、白质基因因同源重重组技术术是国家家8633计划项项目，8863计计划项目目在技术术上均为为国际领领先或先先进技术术。基因因重组纤纤维素酶酶菌株构构建是8863计计划蛋白白质基因因重组技技术的延延续。本本项目采采用的基基因打靶靶技术是是国际先先进技术术，纤维维素酶的的技术指指标中热热稳定性性高于国国外同类类产品水水平。3.5 产产品的技技术性能能、生产产成本、销销售价格格优势由于本项目目在菌株株改造上上采用了了世界先先进的基基因重组组技术，所所生产的的纤维素素酶在技技术及其其它方面面具有以以下优势势：3.5.11 产品品技术性性能优势势第一、高活活力。诺诺威信公公司的同同类产品品酶活为为2800

37、0uml,该公司司产品的的发酵液液活力可可达32200uumll；第二、热稳稳定性。美美国杰能能克公司司产品的的热稳定定性在555以下，该该公司产产品的热热稳定性性可达885。3.5.22 生产产成本优优势据了解，国国外厂家家2万活活力纤维维素酶生生产成本本在1220000元/吨吨以上，该该公司的的生产成成本可控控制在880000元吨吨以下。3.5.44 价格格优势国外同类产产品市场场售价为为4.66万元/吨，可可研及本本报告中中该公司司产品出出厂价为为液态酶酶1.44万元/吨，固固态酶11.5万万元/吨吨。4、该重大大关键技技术的突突破对行行业技术术进步的的重要意意义和作作用4.1 提提高酶

38、制制剂行业业整体水水平。该该项目是是我国第第一个采采用有自自主知识识产权的的基因重重组工程程菌株进进行产业业化生产产的项目目，对提提升我国国酶制剂剂行业总总体水平平，提高高我国酶酶制剂行行业和国国外企业业的竞争争能力具具有积极极的意义义。4.2 基基因重组组纤维素素酶菌株株构建技技术的成成熟将对对耐高温温糖化酶酶菌株构构建及其其它酶制制剂的基基因重组组具有借借鉴意义义。4.3 采采用具有有自主知知识产权权的工程程菌株进进行产业业化生产产将对我我国酶制制剂行业业的自主主创新具具有积极极的示范范作用。三、项目建建设方案案1、建设规规模根据吉林市市的资源源状况、自自然环境境和市场场调查情情况，结结合