发酵饲料生产工艺与应用培训资料12155.docx

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1、发酵饲料料生产工工艺与应应用灵璧县立立腾同创创农牧科科技有限限责任公司司二0一二二年十一一月目 录安徽省立立腾同创创农牧科科技有限限公司 简介安徽省立立腾同创创农牧科科技有限限公司 企业文文化安徽省立立腾同创创农牧科科技有限限公司的的十年发发展战略略安徽省立立腾同创创农牧科科技有限限公司的的第一个个发展五五年发展展计划第一章 发酵饲料料生产的的菌种及及发酵工工艺第二章 发酵饲料料生产技技术第一章 发酵饲饲料生产产的菌种种及发酵酵工艺第一节 概述一、 发酵饲料料的定义义发酵饲料料的定义义是：在人人为可控控制的条条件下，以以植物性性农副产产品为主主要原料料，通过过微生物物的代谢谢作用，降降解部分分

2、多糖、蛋蛋白质和和脂肪等等大分子子物质，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料原料。采用发酵酵技术生生产的动动物饲料料或饲料料原料，其其特性主主要是：（1）含含有大量量的活性性微生物物；（2）多多数以厌厌氧发酵酵方式进进行生产产；（3）未未经干燥燥的物料料含水量量通常在在30%以上；（4）物物料的酸酸性物质质明显增增加，营营养组成成更合理理；（5）生生产原料料以植物物性农副副产品为为主。也有发酵酵成品是是经过干干燥处理理的，比比较典型型的有发发酵豆粕粕和发酵酵棉粕。在在发酵过过程中有有大量的的活性乳乳酸菌和和酵母菌菌发生的的代谢作作用，经经过干燥

3、燥以后，乳乳酸菌基基本都失失活了，但但是它们们也属于于发酵饲饲料。二、 发酵饲料料的概述述发酵饲料料的生产产工艺基基本都是是以固态态发酵的的方式进进行的，生生产菌种种以乳酸酸菌、芽芽孢杆菌菌和酵母母菌为主主，绝大大多数采采用厌氧氧或兼性性厌氧发发酵。发发酵物料料的含水水量为330%50%，发酵酵时间和和温度受受环境影影响很大大，基本本不进行行人为控控制和调调节。在实际生生产中也也有采用用好氧发发酵方式式进行的的，生产产菌种以以霉菌和和假丝酵酵母为主主，生产产用的蛋蛋白原料料主要是是一些乳乳酸菌和和酵母菌菌难以降降解的杂杂粕和胶胶质蛋白白。但是是生产设设备复杂杂，物料料温度和和湿度变变化很大大，

4、控制制及其困困难。成成品主要要是作为为饲料蛋蛋白原料料的替代代物，能能降低饲饲料生产产成本，但但基本不不具备生生物学活活性和功功能。本节主要要论述厌厌氧固态态发酵工工艺，常常规的发发酵饲料料生产流流程如：原料消消毒冷却接接种培养干燥包装工业化规规模的微微生物发发酵过程程基本上上都是纯纯培养过过程，原原料需要要消毒，空空气需要要过滤等等。这些些操作都都是为了了确保在在发酵产产品生产产和储存存过程中中不受杂杂菌的侵侵袭和干干扰，但但也正是是这些常常规操作作使产品品的生产产成本居居高不下下，影响响了微生生物发酵酵产品在在动物饲饲养中的的大剂量量使用。大量试验验证明，在在不考虑虑动物饲饲养成本本的前提

5、提下，大大剂量（在在配合饲饲料中添添加5.0%以以上）使使用高活活菌含量量的微生生物发酵酵饲料可可以明显显改善动动物的生生产性能能，提高高动物的的健康水水平，甚甚至可以以进行无无抗生素素饲养。但是采用传统的生产工艺获得的高活菌产品其生产成本通常都在10元/kg以上，如果以10%的比例使用在配合饲料中，每吨配合饲料的成本至少需要增加800元，这个增加值对传统的畜禽养殖业来说是难以接受的。降低发酵饲料生产成本最直接的方式就是简化生产工艺，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是最耗能的操作过程，是导致生产成本增加的主要步骤，也是导致生产设备投资增加的主要原因。如能简化生产操作工艺步骤，同时又能保证产品质量的安

6、全稳定，就能使发酵饲料的生产和应用具备强大的市场竞争力。第二节 发酵饲料料的生产产菌种发酵饲料料的生产产菌种很很多，主主要有：乳酸菌菌、芽孢孢杆菌、酵酵母菌和和霉菌。一、 乳酸菌目前生产产中使用用的乳酸酸菌至少少有300多种。按按乳酸菌菌的代谢谢途径，大大致可归归纳为四四种类型型：同型型乳酸发发酵、专专性异型型乳酸发发酵、兼兼性乳酸酸发酵和和双歧杆杆菌异型型乳酸发发酵。（一） 同型乳酸酸发酵C6H112O62CHH3CH(OH)COOOH一分子葡葡萄糖分分解成两两分子乳乳酸，整整个过程程不产气气，发酵酵转化理理想，产产物最合合适，效效率最高高。典型型的生产产菌种主主要有：德氏乳乳酸杆菌菌、嗜酸

7、酸乳杆菌菌、唾液液乳杆菌菌、嗜热热乳杆菌菌、粪肠肠球菌、乳乳酸乳球球菌。（二） 专性异型型乳酸发发酵C6H112O6CH3CH(OH)COOOH+CCH3COOOH+CCO2一分子葡葡萄糖转转化成一一分子乳乳酸和一一分子乙乙酸，另另外还释释放一分分子二氧氧化碳。相相比同型型乳酸发发酵，这这种发酵酵的转化化效率要要低得多多，而且且还有产产气损失失。典型型的生产产菌种主主要有:发酵乳乳杆菌、高高加索酸酸奶杆菌菌、短乳乳杆菌、巴巴氏乳杆杆菌。（三） 兼性乳酸酸发酵兼性乳酸酸发酵能能同时进进行同型型乳酸发发酵和异异型乳酸酸发酵，这这两种代代谢进行行的程度度和比例例取决于于菌种的的性质和和外界培培养条件

8、件。典型型的生产产菌种有有：植物物乳杆菌菌、干酪酪乳杆菌菌、鼠李李糖杆菌菌、清酒酒乳杆菌菌。（四） 双歧杆菌菌异型乳乳酸发酵酵2C6HH12O62CHH3CH(OH)COOOH+33CH33COOOH比较典型型的生产产用菌种种是动物物双歧杆杆菌。双双歧杆菌菌的培养养要求很很严格，对对厌氧要要求极高高，目前前还很难难在实际际生产中中应用。乳酸菌分分布广、种种类多，有有杆状和和球形两两大类。有有单个、成成对和链链状排列列的，基基本上都都是厌氧氧菌或微微需氧菌菌。在饲饲料青储储、发酵酵开始时时就繁殖殖，到饲饲料因密密封缺氧氧后仍然然能繁殖殖，只是是增殖的的速度慢慢一些，而而乳酸的的生成速速度却快快一

9、些。乳酸菌能能分解饲饲料原料料中的糖糖，形成成乳酸。乳乳酸能提提高饲料料的营养养价值和和适口性性，同时时还能抑抑制大肠肠杆菌和和沙门氏氏菌等有有害微生生物的生生长代谢谢，使饲饲料产品品能长期期保存。在在饲料青青储和发发酵的过过程中，同同型和异异型乳酸酸发酵同同时存在在，产物物除乳酸酸外还有有少量乙乙醇和CCO2。二、 芽孢菌目前在生生产中应应用的芽芽孢菌有有近十种种，以杆杆菌为主主，主要要为以下下三种：地衣芽芽孢杆菌菌、枯草草芽孢杆杆菌和蜡蜡样芽孢孢杆菌。芽芽孢杆菌菌能耐受受高温，在在有氧和和无氧条条件下都都能存活活。在营营养缺乏乏、干旱旱等条件件下形成成芽孢，在在条件适适应时又又可以重重新萌

10、发发成营养养体。利利用芽孢孢杆菌发发酵饲料料的目的的主要是是为了消消耗培养养体系中中残留的的氧气，为为乳酸菌菌创造一一个厌氧氧环境。另另外，近近年来研研究还发发现，有有些芽孢孢杆菌能能产生杀杀灭大肠肠杆菌和和沙门氏氏菌等有有害微生生物的细细菌素（也也称抗菌菌肽），这这些抗菌菌肽有很很强的针针对性，只只对某些些类型的的微生物物细胞有有破坏作作用，对对酵母菌菌和乳酸酸菌没有有影响。三、 酵母菌酵母菌是是一类单单细胞真真菌，形形态多种种多样，主主要有球球形、卵卵形和丝丝状形（如如假丝酵酵母），以以出芽的的无性繁繁殖为主主，最适适宜生长长温度为为2535，pHH偏酸性性（4.066.0）。酵酵母菌基基

11、本上都都是兼性性厌氧菌菌，在有有氧的条条件下迅迅速增殖殖，在无无氧的情情况下进进行酒精精发酵（EEMP）。目前在生产中应用的有20多种，主要为以下三种：酿酒酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母。啤酒酵母和面包酵母是最常用的酿酒酵母。热带假丝酵母和产朊假丝酵母的生长速度很快，在适宜的温度和营养条件下，它们的世代倍增时间不超过3h，特别适合处理食品加工业产生的废水。酵母菌的的个体比比乳酸菌菌大得多多，直径径通常为为266m，体积积几乎是是乳酸菌菌的10000倍倍左右。工工业生产产中常用用的酵母母菌主要要有酿酒酒酵母和和假丝酵酵母，酿酿酒酵母母是生产产啤酒、白白酒等含含乙醇类类发酵物物的重要要菌种；假丝

12、酵酵母主要要用于好好氧发酵酵生产动动物饲料料或者废废水处理理。四、 霉 菌目前在生生产中应应用的霉霉菌有近近十种，主主要为：米曲霉霉、黑曲曲霉、白白地霉。一一般来说说利用霉霉菌发酵酵，基本本上都是是有氧发发酵，发发酵过程程会产生生大量的的代谢热热，生产产过程中中料曲的的温度控控制往往往是生产产成败的的关键。霉霉菌发酵酵目前采采用浅盘盘发酵，料料曲厚度度不超过过5cmm。如果果采用厚厚层发酵酵，需采采用强通通风装置置，生产产能耗很很大，从从这一点点上说，霉霉菌发酵酵不适于于生产饲饲料或者者饲料原原料。目前，实实际生产产中利用用霉菌主主要是利利用它能能合成纤纤维素酶酶、半纤纤维素酶酶和蛋白白酶的特

13、特性，利利用廉价价的粗蛋蛋白原料料作为发发酵底物物，生产产高活性性的蛋白白饲料或或者粗酶酶制剂。五、 选用生产产菌种的的基本原原则（一） 安全性（必必须同时时符合以以下两个个要求）（1） 菌体本身身不产生生有毒有有害物质质。（2） 不会危害害环境固固有的生生态平衡衡（主要要针对某某些基因因工程菌菌）。（二）有有效性（能能满足一一个要求求即可）（1） 菌种本身身具有很很好的生生长代谢谢活力，能能有效降降解大分分子好抗抗营养因因子，合合成小肽肽和有机机酸等小小分子物物质。（2） 能保护和和加强动动物微生生物区系系的正平平衡。这种功效效主要是是指能有有效维护护和提高高有益微微生物在在动物消消化道中中

14、的数量量优势，其其可通过过两种方方式达到到：一种种方式是是利用发发酵饲料料的生产产菌种本本身就是是从饲养养的目标标动物的的消化道道中分离离出来的的有益菌菌，通过过饲喂高高比例的的发酵饲饲料直接接提高有有益微生生物的数数量，形形成数量量优势；另一种种方式是是利用生生产菌种种或代谢谢产物可可以选择择性地抑抑制或者者杀灭有有害微生生物，形形成有益益菌的数数量优势势。实现现第二种种途径的的方式可可以多种种多样，比比较常用用的有：耗尽氧氧气，降降低体系系的氧化化还原电电位；降降低环境境的pHH值；代代谢物中中含有能能选择性性杀灭大大肠杆菌菌和沙门门氏菌等等有害微微生物的的抗菌物物质等。第三节 发酵饲料料

15、生产菌菌种之间间的相互互关系目前人类类可利用用的这些些发酵技技术基本本上都是是纯培养养技术，而而实际上上在自然然界中很很难找出出单一微微生物存存在的生生态环境境。据已已有的微微生物研研究报道道，地球球上存在在的微生生物超过过1000万种，而而人类所所分离的的纯种累累计不超超过100万种，做做过比较较系统研研究的不不超过11万种。根根据目前前已有的的研究成成果，大大体可以以把微生生物之间间的关系系分为以以下几种种：中性性共生、同同住、互互惠共生生、共生生、竞争争、拮抗抗和寄生生。一、 中性共生生这是指两两种或两两种以上上的微生生物同时时存在于于同一个个环境中中，但是是它们之之间没有有直接的的生态

16、关关系，各各自生活活互不干干扰。例如淡水水中生长长的衣藻藻和水生生细菌。二、 同 住这是指两两种微生生物同处处在一个个栖所内内，其中中一个获获益，另另一个不不受影响响。常见见的现象象是一种种微生物物产生一一种代谢谢物供另另一种微微生物作作为营养养物质，或或者产生生适合于于另外一一种微生生物生长长的环境境。发酵酵饲料生生产中比比较常见见的例子子有以下下几种：酵母菌菌能在高高浓度的的糖液（225%左左右）中中生长。当糖被酵母菌消耗以后，糖浓度的降低就有利于不耐受高渗透压的微生物（如乳酸菌）的生长。能分泌淀淀粉酶的的微生物物（芽孢孢菌）水水解淀粉粉产生寡寡糖和单单糖，为为另外一一些只能能利用还还原性

17、单单糖的微微生物生生长提供供营养。还有一种种比较特特殊的同同住微生生物，好好气性菌菌可消耗耗氧气，降降低环境境的氧化化还原电电位，使使之适合合于厌氧氧微生物物的生长长。这种种同住关关系只能能产生在在开始阶阶段，在在后期就就不是同同住关系系了。这这种现象象在发酵酵饲料到到生产过过程中经经常遇到到，也是是利用微微生物组组合发酵酵生产发发酵饲料料的重要要理论基基础。三、 互 惠 共 生生这是两种种微生物物互惠互互利的现现象，比比较典型型的菌种种是阿拉拉伯糖乳乳杆菌和和粪链球球菌的组组合。阿阿拉伯糖糖乳杆菌菌不能合合成苯丙丙氨酸，粪粪链球菌菌不能合合成叶酸酸。阿拉拉伯糖乳乳杆菌不不能在缺缺少苯丙丙氨酸

18、的的培养基基上生长长，粪链链球菌也也不能在在没有叶叶酸的培培养基上上生长。但但是把它它们组合合在一起起，却可可以共同同在没有有苯丙氨氨酸也没没有叶酸酸的培养养基上生生长，因因为它们们能相互互为对方方提供必必需的限限制性营营养物质质。这种种现象在在自然界界中普遍遍存在，发发酵饲料料的菌种种组合应应该多考考虑这种种组合优优势。四、 共 生共生是指指两种微微生物在在同一个个严酷环环境中彼彼此相依依为命。比比较典型型的例子子是地衣衣，它是是蓝细菌菌（或蓝蓝藻）与与真菌共共同组成成的一个个形态和和生理单单位。蓝蓝藻或蓝蓝细菌的的细胞仅仅限于特特定的层层内，地地衣内的的菌丝交交织成菌菌丝组织织，形成成一个

19、稠稠密的外外皮层。皮皮层下为为蓝藻的的细胞层层，在下下面为菌菌丝疏松松交织的的菌髓层层。真菌菌可以从从蓝藻获获得碳水水化合物物，真菌菌菌丝所所摄取的的水和无无机盐又又可以提提供给蓝蓝藻，因因此地衣衣能耐干干旱、潮潮湿和抗抗寒冷。这这种现象象在发酵酵饲料的的生产过过程中很很难遇到到，少有有实用的的例子。五、 竞 争当两种微微生物对对某种环环境因子子有相同同要求时时，就会会发生生生存竞争争。由于于微生物物的世代代时间比比较短，代代谢强度度大，所所以生存存竞争往往往表现现的很激激烈。在一个生生存环境境内，不不同的时时间会出出现不同同的优势势种。这这种优势势微生物物在某种种环境下下能最有有效地适适应当

20、时时的环境境，而环环境条件件一旦改改变，就就可能被被另一种种微生物物代替并并发育成成新的优优势种。目目前工业业化发酵酵生产之之所以采采用纯种种培养，其其主要原原因就是是消除其其他微生生物的竞竞争。目目标代谢谢物合成成能力强强的微生生物其生生长速度度往往比比较低，至至少比同同类的野野生菌低低。野生生菌的代代谢活动动是很“经济的的”。如果果从生长长速度分分析，它它们的物物质和能能量的利利用效率率要远高高于生产产菌种。但但是，由由于生产产成本的的限制，发发酵饲料料的生产产往往不不能采用用纯种培培养，所所以微生生物之间间的生存存竞争不不可避免免。如何巧妙妙利用微微生物之之间的生生存竞争争是研究究微生物

21、物发酵饲饲料生产产的一个个非常重重要的课题。从从理论上上分析，通通过控制制调节微微生物生生存环境境可以调调整物料料中微生生物的种种类和数数量分布布，从而而达到利利用微生生物有益益菌群种种群优势势发酵饲饲料的目目的，但但是到目目前为止止，有关关方面的的成熟技技术还是是很少。六、拮 抗一种微生生物可以以产生不不利于另另一种微微生物生生存的代代谢物质质，或者者通过代代谢活动动改变生生存环境境，而这这种环境境不利于于其他周周围微生生物的生生长，这这种现象象就称为为“拮抗”。如：青青贮饲料料接种的的乳酸菌菌和醋酸酸菌在发发酵过程程中，不不断降低低pH值值，结果果绝大多多数不耐耐酸的微微生物不不能生存存，

22、甚至至趋向死死亡。酵酵母菌在在无氧条条件下将将糖发酵酵成酒精精，当酒酒精浓度度达到一一定数值值时，其其他微生生物就不不能生存存。研究发现现拮抗还还具有明明显选择择性，农农业部饲饲料工业业中心分分离获得得的枯草草芽孢杆杆菌MAA1399能分泌泌杀灭大大肠杆菌菌、沙门门氏菌和和金黄色色葡萄球球菌的抗抗菌肽（细细菌素），但对自身、酵母菌和乳酸菌的生长代谢基本没有影响，这种拮抗的选择性是发酵饲料研究所希望的。七、寄 生一种微生生物生活活在另一一种微生生物体内内或体外外，依靠靠摄取寄寄生细胞胞的营养养进行生生长繁殖殖，并使使后者遭遭受损害害甚至死死亡，这这种现象象称之为为寄生。这这种现象象在饲料料发酵过

23、过程中可可能存在在，目前前在研究究中还没没有遇到到。微生物是是发酵饲饲料的动动力来源源，研究究发酵饲饲料中微微生物的的相互关关系是获获得高质质量发酵酵饲料的的必要前前提，也也是饲料料发酵生产产的核心心。第四节 发酵饲饲料的生生产工艺艺一、 固态厌氧氧发酵高高活性生生物饲料料相对于好好氧发酵，厌厌氧发酵酵的能耗耗低，微微生物代代谢产生生的热量量也要小小得多，生生产过程程往往不不需要翻翻拌散热热。另外外，发酵酵产品只只要密封封得当，即即使长期期存放也也不会腐腐败变质质。目前比较较典型的的固态厌厌氧发酵酵生物饲饲料的成成功例子子主要有有两种：一种是是适合养养殖户自自产自用用的袋装装发酵饲饲料；另另一

24、种是是属于规规模化流流水线生生产的袋袋装发酵酵饲料。它它们接种种的微生生物基本本一致，主主要有酵酵母菌、乳乳酸菌和和芽孢杆杆菌。适合养殖殖户自产产自用的的发酵袋袋是一种种普通的的密封包包装袋，物物料接种种以后装装袋，再再将袋口口用绳扎扎紧，物物料的含含水量为为30%400%。开开始时，酵酵母菌消消耗袋内内残留的的氧气进进行增殖殖和呼吸吸代谢，同同时也为为乳酸菌菌创造一一个厌氧氧的生活活环境。然然后，酵酵母菌在在无氧条条件下进进行糖酵酵解，产产生酒精精和COO2，乳酸酸菌也同同时增殖殖、代谢谢，产生生有机酸酸。随着着袋内气气压的不不断增加加，不断断有COO2带着酒精精和有机机酸排出出袋外，管管理

25、饲料料的饲养养员可以以根据排排出的酸酸香味来来判定物物料发酵酵的成熟熟度。有氧发酵酵阶段：C6H112O6+6OO26COO2+6HH2O无氧发酵酵阶段：C6H112O62COO2+2C2H5OH(乙醇)在夏季，发发酵35d就就有明显显的酸香香味。在在冬季，时时间需要要延长。如如果环境境温度低低于122，发酵酵就有可可能归于于失败。酵酵母在低低温下长长期代谢谢低迷，不不产生CCO2，使使得外界界的O22长时间间与接种种的乳酸酸菌接触触，会导导致乳酸酸菌活力力大减，甚甚至死亡亡。事实证明明，如果果环境温温度适宜宜，时间间控制得得当，采采用上述述袋装式式土办法法发酵，也也可以获获得质量量很好的的微

26、生物物发酵饲饲料，活活性乳酸酸菌的含含量能达达到1008cuff/g以以上。将将其在生生羊配合饲饲料中添添加155%220%，生生羊采食量量能明显显提高，最最多能提提高100%以上上，而且且增重速速度和健健康水平平也有显显著提高高。这种种工艺虽虽然简单单，但是是受限制制的因素素很多，质质量标准准也很难难把握，实实际推广广有一定定困难。为了使这这种袋装装发酵技技术进入入程序化化、工业业化应用用，发酵酵饲料的的质量能能得到有有效保证证，必须须完成以以下几个个前提：发酵过过程不受受环境温温度限制制；产品品质量不不受存放放时间限限制，或或者保质质期能达达到三个个月以上上；产品品在储存存和运输输过程中中

27、不受外外界空气气干扰。农业部饲饲料工业业中心的的微生物物发酵饲饲料课题题组发明明了呼吸吸膜可移移动式固固态厌氧氧发酵饲饲料（也也称袋装装发酵饲饲料）生生产技术术。这种发酵酵技术的的具体工工艺流程程如图1-11。发酵原料粉碎机过 渡 仓电 子 秤搅拌机菌种液计量和包装机成品原料接种种以后直直接进入入包装袋袋中，包包装袋上上附加一一个可以以调节气气压的硅硅胶膜。在发酵过程中，微生物会产生CO2等气体，使得袋内的气压大于外界常压。当袋内气压达到某一临界值时，气体通过硅胶膜排到外界。但是外界的气体始终没有机会进入发酵体系，从而也就排除了外界杂菌的干扰。 研制的的特定微微生物菌菌种组合合能使乳乳酸菌迅迅

28、速繁殖殖，占据据数量优优势，原原料不需需要消毒毒就可以以直接用用于接种种培养。这种工艺艺很简单单，如果果以日产产30tt计算，设设备投资资不超过过40万万元，特特别适合合在我国国广大农农村推广广使用。第三章 发酵饲料料生产技技术第一节 发酵饲料料用乳酸酸菌的分分离筛选选乳酸菌是是一类最最常见的的益生菌菌，生物物饲料的的发酵生生产一般般都离不不开乳酸酸菌。乳乳酸菌种种类很多多，市场场上流行行的产品品也极多多，至少少有200多种。大量实验证明，只有动物消化道国有的微生物才能在消化道内定植，外源微生物只能短时间存活在消化道内，不可能长期融合到动物消化道的微生态系统中。筛选发酵饲料的生产菌种，其主体应

29、该来源于最终适用的动物消化道，而乳酸菌细菌是动物消化道内起主要作用的微生物。一、 样品的采采集为了获得得合适的的生产用用乳酸菌菌，样品品的采集集很重要要。适合合于实际际生产的的乳酸菌菌必须来来源于健健康动物物的消化化道，最最好是在在发生了了瘟疫的的养殖场场而幸存存的畜禽禽。发生生瘟疫的的养殖场场，动物物大比例例死亡，幸幸存的畜畜禽虽少少，但是是生命力力很顽强强，是极极好的生生产菌种种采集样样本。以下以筛筛选符合合生羊健康养养殖需要要的生物物饲料用用乳酸菌菌为例，叙叙述样品品的采集集和乳酸酸菌的分分离。在在实验室室中对生羊进行攻攻毒试验验，在饲饲料中不不断加大大大肠杆杆菌（实实验用EE.Cool

30、iKK88,这是一一种常见见的攻毒毒试验用用大肠杆杆菌）的用量量，以检检验生羊羊的抵抗抗力。经经过57d的的试验，生生羊的健康康水平越越来越差差。我们们选择其其中两头头最健康康的生羊羊进行屠屠宰，在在无菌环环境中提提取它的的胃液、小小肠液和和大肠液液，迅速速保存在在无菌生生理盐水水（NaaCl的的浓度为为0.99%）中中。目标乳酸酸菌一般般都是厌厌氧菌，为为了确保保乳酸菌菌的活力力，需要要尽可能能降低生生理盐水水的氧化化还原电电位。最最简便的的方法是是在溶液液中加入入适量的的半胱氨氨酸，半半胱氨酸酸有巯基（SH），有很很好的还还原力，可可以消除除溶液中中残余的的氧。二、 乳酸菌的的分离纯纯化样

31、品中的的目标乳乳酸菌含含量一般般都不是是很高，而而且还污污染了其其他杂菌菌。为了了提高筛筛选成功功的几率率，在样样品进行行分离纯纯化以前前，可以以对样品品进行选选择性增增殖培养养，以增增加目标标乳酸菌菌的含量量。样品的增增殖培养养比较简简单，把把经过适适当处理理的样品品接种到到适于目目标乳酸酸菌生长长的培养养基中。比比较常用用的是牛牛奶增殖殖培养液液，在无无抗生素素牛奶中中补充66%88%的蔗蔗糖，高高温消毒毒、冷却却，然后后用氮气气或者二二氧化碳碳驱除溶溶液中残残留的空空气，再再接入适适量采集集的样品品，在330332条件下下厌氧培培养100244h。如如果样品品中的目目标乳酸酸菌含量量比较

32、低低，可以以适当延延长培养养时间。样品经过过预增殖殖培养以以后，目目标乳酸酸菌含量量明显提提高，可可以进入入下一步步分离纯纯化操作作。乳酸菌分分离培养养基通常常采用MMRS琼琼脂培养养基，其其营养组组成与ppH如下下：蛋白白胨：55.0gg/L；牛肉浸浸膏：44.0gg/L；酵母膏膏：2.0g/L；葡葡萄糖：12.0g/L；玉玉米浆：10.0mLL;司盘盘80：1ml;磷酸氢氢二钾：1.00g/LL；三水水乙酸钠钠：3.00g/LL；柠檬檬酸三铵铵：1.0g/L；硫硫酸镁：0.11g/LL；硫酸酸锰：00.033g/LL；琼脂脂：188.0gg/L。ppH6.20.22。加热溶解解上述各各组分

33、，配配制成均均匀的溶溶液，分分装在厌厌氧滚管管中（每每个管中中加56mLL）。在1115消毒杀杀菌300minn。冷却却至500左右后后，在冰冰水中滚滚动滚管管，使固固体培养养基均匀匀凝固在在管壁上上。为了指示示培养基基的氧化化还原电电位，可可以在培培养基中中加入极极少量的的刃天青青（一种种显色剂剂），浓浓度0.02%就足够够了。在在低电位位时培养养基显蓝蓝色，随随氧化还还原电位位不断上上升，培培养基的的颜色逐逐步由蓝蓝转为浅浅蓝、粉粉红、红红色。如如果培养养基的颜颜色转成成粉红就就基本不不合格了了。同增增殖培养养过程一一样，在在MRSS分离培培养基中中加入适适量的半半胱氨酸酸可以在在一定时时

34、间内维维持环境境的低电电位。分离纯化化培养基基准备好好以后，就就可以进进行目标标乳酸菌菌的分离离操作了了。在超净工工作台上上（或者者其他无无菌环境境中），对对经过增增殖培养养的样品品进行梯梯度稀释释，稀释释液还是是用无菌菌的生理理盐水，把把稀释后后的样品品接种到到厌氧滚滚管中，密密封（滚滚管有密密封盖）。在在3032条件下下培养112dd。为了提高高筛选几几率，可可以同时时做多个个稀释梯梯度样品品的培养养。如果果两天以以后不出出现理想想的菌落落，可以以再延长长培养时时间。虽然乳酸酸菌的最最适宜生生长温度度是377400，但是是在分离离筛选过过程中，培培养温度度应适当当调低，以以降低其其生长速速

35、度，这这样菌落落之间的的差异可可以更明明晰，也也更有利利于挑选选理想的的菌种。经过上述述分离操操作，我我们获得得了5株株乳酸菌菌，它们们分别是是：1.来源源于羊胃的格格氏乳杆菌（Laactoobaccilllus gassserri）;2.来源源于十二二指肠的的罗伊氏氏乳杆菌菌（Laactoobaccilllus reuuterri）;3.来源源于小肠肠的屎肠肠球菌（EEnteeroccocccus faeeciuum）;4.来源源于空肠肠的嗜酸酸乳杆菌菌（Laactoobaccilllus aciidopphillus）;5.来源源于结肠肠的发酵酵乳杆菌菌（Laactoobaccilllus

36、 ferrmenntiuum）。三、发酵酵力和耐耐酸稳定定性分析析为了后续续生产应应用的需需要，我我们对分分离获得得的乳酸酸菌进行行发酵力力测定和和耐酸稳稳定性试试验。发发酵力测测定比较较简单，主主要测定定其乳酸酸菌的产产量，具具体方法法如下：接种分离离获得的的细菌纯纯种于试试管培养养液中，33032恒温培培养122h，然然后再扩扩大接种种到牛奶奶瓶中，330332恒温培培养6hh，测定定乳酸含含量。在乳酸发发酵的过过程中乳乳酸通常常以乳酸酸钙的形形式存在在， 通通过去除除发酵液液中的葡葡萄糖和和蛋白质质，并加加入适当当浓度硫硫酸酸化化，钙离离子转化化成难溶溶的硫酸酸钙沉淀淀，使溶溶解度不不高

37、的乳乳酸钙全全部转变变为乳酸酸。乳酸酸在铜离离子的催催化下，与与浓硫酸酸作用生生成乙醛醛，乙醛醛能与对对羟基联联苯作用用生成在在 5665 nnm 处处有特征征吸收的的紫色物物质。在在一定浓浓度范围围内，乳乳酸含量量与 5565 nm 处波长长吸光度度呈线性性关系，因因此，可可以通过过测定 5655 nmm 处的的吸光度度来测定定乳酸的的含量。实验室乳乳酸含量量的测定定一、原理理稀乳酸在在浓硫酸酸作用下下加热，可可以变成成乙醛。乙乙醛与羟羟基联苯苯作用可可以生成成红色的的复合物物，在5565nnm条件件下比色色测定，可可以确定定乳酸含含量。二、试 剂1. 44.0%硫酸铜铜溶液将4g无无水硫酸

38、酸铜溶解解在水溶溶液中，定定容至1100mml。2.羟基基联苯（CC6H55C6HH4OHH）溶液液将1g羟羟基联苯苯溶解于于1000ml浓浓度为00.088moll/L的的NaOOH溶液液中，储储存在褐褐色试剂剂瓶中。3.乳酸酸标准液液将2800mg纯纯乳酸锂锂溶于水水中，配配成2550mLL溶液，其其乳酸浓浓度为11mg/mL，存存放于44冰箱中中。在做做标准曲曲线时将将溶液稀稀释100倍，使使乳酸含含量为1100g/mmL。在在分别取取1，22，3，44，5，66mL稀稀释液，稀稀释配制制成1，22，3，44，5，66g/mmL乳酸酸标准液液。4.浓硫硫酸溶液液在比色管管中分别别加入11

39、mL乳乳酸标准准液和00.055mL硫硫酸铜溶溶液，然然后加入入6mLL浓硫酸酸，放置置5miin，冷冷却至220以下。三、标准准曲线的的制备和和乳酸含含量的测测定在上述比比色管中中加入00.055mL羟羟基联苯苯溶液，混混合均匀匀，在室室温下放放置68h，过过夜。在在5655nm波波长下进进行比色色测定，绘绘制标准准曲线。（1） 最大吸吸收波长长的确定定乳酸发酵酵液样品品显色后后，表明明，最大大吸收波波长为 5655 nmm。图2-11最大吸吸收波长长的确定定（2） 最佳显显色条件件的选择择结果表明明，氢氧氧化钙和和浓硫酸酸的加入入量对显显色反应应影响显显著，其其余因素素的作用用不显著著，最

40、佳佳显色条条件为AA2B3CC2D11E1FF3，即氢氢氧化钙钙0.005g，200%硫酸酸铜 00.8 ml，浓浓硫酸 6 mml，对对羟基联联苯 00.1225 mml，静静置时间间 155 miin，加加热显色色时间 5 mmin。（3） 乳酸标标准曲线线的制备备乳酸标准准应用液液浓度在在 10080 g/mml范围围内与吸吸光度值值基本呈呈线性关关系，当当浓度大大于等于于 600 g/mml时吸吸光度值值大于 1，考考虑到仪仪器误差差的因素素，故制制备标准准曲线时时浓度范范围取在在 155、200、255、300、355、400、455、500 g/mml，得得到如图图的乳酸酸标准曲曲

41、线，求求得标准准曲线回回归方程程为A=0.001899C00.08808(A为吸吸光度值值，C为为乳酸浓浓度，nn=8)，r=0.999899，在 1550g/mml范围围内呈良良好线性性关系。（图2-2：乳酸标标准应用用液浓度度与吸光光度值之之间的关关系）（图2-3：乳酸标标准曲线线）本实验对对发酵液液进行预预处理，排排除蛋白白质和葡葡萄糖的的干扰，使使测定结结果更接接近真实实值；优优化了显显色条件件，使测测定时操操作简便便，精确确度高，显显色稳定定，准确确度高，适适合于发发酵液中中乳酸含含量的测测定。耐酸稳定定性分析析主要是是考虑乳乳酸菌在在实际使使用过程程中过动动物胃酸酸的成活活问题。生

42、生长育肥肥羊的胃胃酸pHH比较低低，一般般的微生生物很难难在其中中存活，这这种功能能实际上上也利于于生羊的的健康，使使它可以以在卫生生条件比比较差的的环境中中生存。但但是这种种特性不不利于外外源有益益微生物物的存活活，外源源有益菌菌必须先先通过胃胃液的考考验才能能达到其其发挥作作用的场场所（肠肠道）。所所以耐胃胃酸稳定定性也是是决定乳乳酸菌实实际使用用效果的的一个重重要指标标，具体体检验方方法如下下：取11.0mmL活菌菌数量已已知的培培养液，在在无菌条条件下，接接种到生生长羊、牛牛的胃液液中，在在37恒温培培养。同同时做66个平行行，每隔隔1h取取样1次次，分析析乳酸菌菌数量的的变化。在生长

43、羊羊胃液中中，上述述5株菌菌都体现现了很好好的稳定定性，其其存活率率都在550%以以上（见见表2-4）表3-44各种乳乳酸细菌菌在生长长羊胃液液中的稳稳定性时间/hh123456格氏乳杆杆菌存活活率/%88.2282.6691.4495.88112136罗伊氏乳乳杆菌存存活率/%88.4481.3371.4466.9957.2246.88屎肠球菌菌存活率率/%86.5562.1176.3371.2264.8855.66嗜酸乳杆杆菌存活活率/%91.2288.6684.2276.8871.3364.22发酵乳杆杆菌存活活率/%94.6692.8891.4488.5586.3384.66本组试验验

44、均是在在羊消化道道中分离离获得的的乳酸菌菌都是天天然菌，没没有经过过基因工工程改造造，属于于安全菌菌株。遗遗传性能能稳定，不不会随着着传代而而发生变变异，安安全无毒毒。可以以大量应应用在牛牛、羊等等饲料中中。另有研究究提出在在模拟的的胃酸中中（pHH值与真真实胃液液胃酸相相同）进进行稳定定性试验验，其结结果不能能代表乳乳酸菌在在真正胃胃液胃酸酸中的稳稳定性，其其原因是是真实胃胃液中蛋蛋白酶对对外来生生物活性性物质具具有极强强的分解解作用，破坏了相当部分外来多酶蛋白和一些细菌素的活性。这是自然界一种自我保护的功能。第二节 发酵饲饲料用芽芽孢杆菌菌的分离离筛选和和安全性性评价芽孢杆菌菌也是一一类比

45、较较常见的的发酵饲饲料生产产菌，但但是这类类菌的应应用效果果与菌种种来源、饲饲养环境境和动物物类型都都有很大大的关系系。虽然然种类很很多，但但是真正正能体现现出稳定定的、优优良效果果的还很很少。另外，芽芽孢杆菌菌不同于于乳酸菌菌和酿酒酒酵母（或或者啤酒酒酵母），乳乳酸菌和和酵母菌菌的安全全稳定性性一般都都很可靠靠（一些些耗氧发发酵的丝丝状酵母母除外），但但是芽孢孢杆菌的的安全稳稳定性却却一直是是行业主主管部门门关注的的重点。芽孢杆菌菌一般都都不是动动物消化化道内固固有菌，它它们发挥挥作用的的原因至至今还没没有统一一的定论论。但是是目前人人们对两两点原因因是比较较认可的的：产生生能杀灭灭大肠杆杆

46、菌和沙沙门氏菌菌等有害害微生物物的抗菌菌肽类物物质（或或者称为为细菌素素）；消消耗环境境中的氧氧气，为为乳酸菌菌的生长长繁殖创创造厌氧氧环境。芽芽孢杆菌菌的分离离筛选主主要也是是依据上上述两个个原则。安全性评评价主要要依据抗抗生素敏敏感性以以及致毒毒性，相相关的技技术都比比较成熟熟。一、样品品的采集集和初筛筛与乳酸菌菌的分离离筛选一一样，目目标芽孢孢杆菌也也是从发发生了瘟瘟疫的动动物养殖殖场或者者进行攻攻毒试验验幸存的的动物体体中筛选选。1.样品品的采集集与初筛筛在发生了了大批死死亡的养养殖场里里，我们们从土壤壤和粪便便中采集集样品，共共需采集224个样样品，每每个样品品约2gg，在无无菌条件

47、件下分别别保存在在20mmL无菌菌生理盐盐水中，并并用冰块块降温，在在12hh内进行行后续的的培养分分离，具具体方法法如下：（1）取取0.55ml样样品液，加加入到55ml的的复合营营养肉汤汤（MNNB）中中。MNNB培养养基组成成与pHH：葡萄糖：5.00g/LL;蛋白白胨：55.0gg/L；牛肉膏膏：3.0g/L;酵酵母浸粉粉：1.0g/L;MMgSOO4H2O:0.0005gg/L。ppH:77.00.22把上述组组分均匀匀溶解在在水溶液液中，在在1200消毒330miin，然然后冷却却到常温温，备用用。（2）从从24种种样品中中分离得得到芽孢孢杆菌菌菌株约1120株株，这些些芽孢杆杆菌均具具有革兰兰氏阳性性、过氧氧化物酶酶阳性、产产生好氧氧芽孢的的特性，但但是仅有有6株对对E.ccoliiK888具有强强烈的抑抑制作用用，它们们都基本本具备了了芽孢杆杆菌的特特性，将将此6株株菌株编编号为：MA223、MMA1339、MMA2557、MMA599、MAA6333和MAA7444，并将将这6株株作为后后续复