《分子生物学检验技术》实验指导chw.docx

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1、实验一小小鼠肝组组织DNNA的提提取及鉴鉴定【实验目目的】1、 掌握动物物组织DDNA提提取的方方法；2、 掌握紫外外分光光光度法检检测、鉴鉴定DNNA浓度度和纯度度的方法法。【实验原原理】获得相当当纯度和和完整性性的基因因组DNNA，可可用于DDNA酶酶切图谱谱、多态态性分析析、基因因诊断、构构建基因因组文库库等。因因此，DDNA样样品质量量的好坏坏将直接接关系到到实验的的成败。较较理想的的DNAA样品应应达到以以下三点点要求：不应存存在对酶酶有抑制制作用的的有机溶溶剂和过过高浓度度的金属属离子；最大程程度地降降低蛋白白质、多多糖和脂脂类分子子的污染染；排除RRNA分分子的污污染和干干扰。D

2、NA以以核蛋白白形式存存在于细细胞中，提提取DNNA的原原则是即即要将DDNA与与蛋白质质、脂类类和糖类类等成分分分离，又又要保持持DNAA分子的的完整。本本实验中中，用阴阴离子去去垢剂十十二烷基基磺酸钠钠（SDDS）消消化破裂裂细胞膜膜、核膜膜，并使使组织蛋蛋白变性性沉淀，DDNA从从核蛋白白中游离离分开；为控制制组织中中脱氧核核糖核酸酸酶（DDNasse）对对DNAA的降解解，加入入柠檬酸酸钠或乙乙二胺四四乙酸二二钠（EEDTAANaa2）以除去去激动该该酶的金金属离子子，SDDS也能能使DNNasee变性失失活；蛋蛋白酶KK可水解解蛋白质质，消化化DNAA酶；分分离后的的DNAA用饱和和

3、酚/氯氯仿抽提提除去蛋蛋白质，接接着用氯氯仿抽提提以除去去DNAA溶液中中微量酚酚的污染染；最后后用无水水乙醇沉沉淀DNNA，得得到欲提提取的基基因组DDNA。260nnm处DDNA有有最大吸吸收峰，测测DNAA的A2260，可可计算其其浓度。而而蛋白质质在2880nmm处有最最大吸收收峰，可可测定AA2600nm/A2880nmm比值，检检测DNNA的纯纯度，该该比值介介于1.822.0之之间。【实验器器材和试试剂】1、动物物小白鼠2、设备备移液器、台式离离心机、水浴箱箱、陶瓷研研钵等；7511紫外分分光光度度计、石石英比色色皿、洗洗瓶、滤滤纸等。3、试剂剂（1）基基因组DDNA提提取试剂剂

4、盒（北北京康为为世纪生生物科技技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生生理盐水水，4贮存（8）无无水乙醇醇、700%乙醇醇【操作步步骤】1、制备备肝匀浆浆迅速处死死小白鼠鼠，称取取新鲜肝肝脏组织织50 mmg，用用预冷生理盐盐水洗去去血液，滤滤纸吸干干后剪碎碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 l Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 l蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55孵育直到组织溶解（约1小时）。2、提取取DNAA（1）加加入1.5 l RRNasse AA，颠倒倒混匀，

5、337孵育115-660 mmin。（2）冰冰上孵育育1分钟钟使样品品迅速冷冷却。（3）加加入1/3体积积的Buuffeer PPP，涡涡旋震荡荡20 s，1120000 rrpm离离心3 minn。（4）将将上清转转移到个新的的离心管管中，加加入等体体积异丙丙醇，轻轻轻颠倒倒混匀，可可见絮状状沉淀（纤纤维状DDNA）从从溶液中中析出。1120000 rrpm离离心1 minn，弃上上清。（5）加加入3000 l 770乙乙醇，颠颠倒数次次以洗涤涤DNAA沉淀。1120000 rrpm离离心1 minn，弃上上清，室室温干燥燥15 minn。（6）加加入500 l BBufffer GE溶溶解

6、DNNA（如如果DNNA的量量比较大大，可以以65孵育以以促进DDNA的的溶解），室温保存待测。3、DNNA浓度度和纯度度的测定定取0.11 mll DNNA样品品，加蒸馏水水至1 ml，在在7511紫外分分光光度度计上测测A2660值和和A2880值。计算：DDNA浓浓度（g/mml）=A2600500100（请问系系数500、100是如何何得来的的？）DNA纯纯度=A2600nm/A2880nmm【注意事事项】（1）由由于DNNA主要要存在于于细胞核核内，为为便于提提取DNNA，肝肝脏的破破碎要严严格控制制好。即即要尽可可能的将将细胞膜膜破碎，又又要尽可可能多保保留完整整的细胞胞核，以以保

7、留660770的的完整细细胞核为为宜。为为避免DDNA过过度断裂裂，不宜宜用电动动研磨器器制备匀匀浆。在提取过过程中，染染色体会会发生机机械断裂裂，产生生大小不不同的片片段，因因此分离离基因组组DNAA时应尽尽量在温温和的条条件下操操作，如如尽量减减少酚/氯仿抽抽提，混混匀过程程要轻缓缓, 以以保证得得到较长长的DNNA。（2）用用氯仿除除去组织织蛋白，要要不断振振荡使蛋蛋白质变变性。如如要得到到高纯度度DNAA，可加加入蛋白白酶K降降解蛋白白质。（3）酚酚和氯仿仿均有很很强的腐腐蚀性，操操作时应应避免接接触皮肤肤。（4）室室温下干干燥时尽尽可能使使残留的的乙醇挥挥发掉（DDNA中中残留的的乙

8、醇会会影响内内切酶的的活性或或电泳时时DNAA不下沉沉），但但不要让让DNAA完全干干燥，否否则极难难溶解，DDNA溶溶解过程程通常需需要122-244hr。（5）提提取过程程应尽量量保持低低温。（6）在在波长2260nnm紫外外线下，11OD的的光密度度值相当当于双链链DNAA浓度为为50g/mml；单单链DNNA或RRNA为为40g/mml；单单链寡核核苷酸为为20g/mml。据据此来计计算核酸酸样品的的浓度。紫紫外分光光光度法法只用于于测定浓浓度00.255g/ml的的核酸溶溶液。（7）AA2600nm/A2880nmm比值应应介于11.82.00之间，若若比值2表示示DNAA样品中中含

9、有较较多的RRNA，如如比值线性DNA。（2）琼琼脂糖凝凝胶浓度度：不同同的凝胶胶浓度，分分辨不同同范围的的DNAA ：琼脂糖凝凝胶浓度度可分辨的的线性DNNA片段段大小（kb）0.5%56000.7%0.8121.0%0.461.5%0.241.755%0.232.00.13（3）DDNA构构象：一一般迁移移速率超超螺旋环环状线状DDNA单链开开环。当当条件变变化时，情情况会相相反，还还与琼脂脂糖的浓浓度、电电流强度度、离子子强度及及EB含含量有关关。（4）所所加电压压：低电电压时，线线状DNNA片段段的迁移移速率与与所加电电压成正正比。使使分辨效效果好，凝凝胶上所所加电压压不应超超过200

10、V/ccm，电电泳温度度应该低低于300。（5）嵌嵌入染料料的存在在：降低低线性DDNA迁迁移率（不提倡倡加在电电泳液中中）。（6）电电泳缓冲冲液（00.5TBEE）的组组成及其其离子强强度影响响DNAA的迁移移率。无离子子存在时时，核酸酸基本不不泳动；离子强强度过大大产热厉厉害，熔熔化凝胶胶并导致致DNAA变性。一般采采用1TAEE，1TBEE，1TPEE（均含含EDTTA ppH8.0）。2溴化化乙锭（EEB）为为致癌剂剂，操作作时应戴戴手套，尽尽量减少少台面污污染，凡是沾沾污了EEB的容容器或物物品必须须经专门门处理后后才能清清洗或丢丢弃。3电泳泳指示剂剂：核酸酸电泳常常用的指指示剂有有两种，溴溴酚蓝（bbrommophhenool bbluee, BBb）呈呈蓝紫色色；二甲甲苯晴（xxyleene cyaanoll, XXc）呈呈蓝色，它它携带的的电荷量量比溴酚酚蓝少，在在凝胶中中的的迁迁移率比比溴酚蓝蓝慢。【实验结结果与分分析】1电泳泳过程中中，你自自己或本本组所采采用的电电压为_伏特特（v），电电流为_毫安（mmA），通通电时间间为_分分钟。 2在在实验报报告上描描画自己己或实验验组的电电泳图谱谱，标明阳阳极和阴阴极位置置。【思考题题】你的电泳泳结果如如何？成成功或失失败有哪哪些方面面的原因因？进行行琼脂糖糖凝胶电电泳时应应注意哪哪些问题题？- 14 -