时间分辨技术的原理最新资料61595.docx
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1、30时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术:1、 时间分辨原理: 用三价稀稀土离子子及其鳌鳌合剂作作为示踪踪物,代代替荧光光物质、同同位素或或酶,标标记蛋白白质、多多胎、激激素、抗抗体、核核酸探针针或生物物流行性性细胞,当当反应体体系发生生后,用用时间分分辨仪器器测定最最后产物物中荧光光强度。根根据荧光光强度或或相对荧荧光强度度比值,来来判断反反应体系系中分析析物的浓浓度,达达到定量量分析之之目的。2、 时间分辨原原子标记记物的特特点:l 发射光和激激发光有有较大的的STOOKESS位移高特异异性l 长寿命荧光光,降低低其他物物质的荧荧光干扰扰高灵灵敏度l 半衰期长达达几十万万年,试试剂受
2、干干扰小高稳稳定性原子标记与与大分子子标记物物的对比比 原 子子 标 记 物物 大大 分 子 标标 记 物标记位点多个,可达达20个个只有1个对被标记物物蛋白活活性的影影响影响小,基基本无影影响影响大,经经常影响响蛋白活活性对被标记物物空间结结构的影影响无影响,保保证稳定定性影响大,造造成试剂剂的不稳稳定受环境因素素的影响响影响小影响大,温温度影响响3、波长分分辨:l 标记离子的的荧光激激发光波波长范围围较宽,发发射光光光谱范围围较窄,是是类线光光谱,有有利于降降低本底底荧光强强度,提提高分辨辨率。l 激发与发射射光之间间有一个个较大的的STOOKESS位移,有有利于排排除非特特异荧光光的干扰
3、扰,增强强测量的的特异性性。4、时间分分辨:l 标记离子螯螯合物产产生的荧荧光强度度高,寿寿命长,有有利于消消除样品品及环境境中荧光光物质对对检测结结果的影影响。l 每一秒名检检测样品品10000次,取取其中不不受干扰扰的4000次的的均值作作为测定定值,有有利于提提高检测测的准确确性。时间分辨技技术取代代酶免、放放免是免免疫检测测技术发发展的必必然趋势势!RIA(放放免)l 放射性(1125II),对对环境和和身体的的危害,已已经为重重视环保保的国家家逐步取取消,如如整个欧欧洲仅尚尚存几个个放免试试验室。l 125I半半衰期短短,导致致试剂的的有效期期短,需需每次定定标,造造成很大大的浪费费
4、。l 由于标记物物(1225I)的的不断变变化,带带来药盒盒批间、批批内较大大的变异异,标准准曲线无无法保存存备用。ELESAA(酶免免)l 灵敏度、重重复性不不及放免,易易造成漏漏检和假假阳性。l 酶的纯度和和反应过过程容易易受环境境因素影影响,导导致稳定定性、重重复性不不好。与其它技术术的相对对优势:(1)、是是现有的的免疫检检测方法法中灵敏敏度最高高的(2)、是是现有的的免疫检检测方法法中稳定定性最好好的(3)、多多标记检检测是目目前所有有免疫检检测技术术中独一一无二的的TRF技术术与电化化学发光光的比较较时间分辨荧荧光电化学发光光标记物四种原子:Eu,Sm,Te,Dy一种原子:钌多标记
5、技术术有无科研项目能(10000多种种科研项项目)无试剂种类58种临床床,244种科研研,共882种40种临床床,无科科研试剂价格低高TRF与化化学发光光的比较较时间分辨荧荧光化学发光发光效率95%1%重复检测可无数次重重复不可重复本底噪声零本底干扰大灵敏级数10-19910-155标记物原子大分子化合合物标记位点每个抗体可可达200个1个标准曲线稳定达一年年以上稳定2到44周多标记有,最多可可达四标标记无科研开发有无时间分辨荧荧光免疫疫定量分分析简介介时间分辨荧荧光分析析(Tiimerresoolveed Fluuorooimmmunooasssay,TRFFIA)是一种非同位素免疫分析技术
6、,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。解离增强镧镧元素荧荧光免疫疫分析是是时间分分辨荧光光免疫分分析中的的一种。它它用具有有双功能能基团结结构的螯螯合剂,使使其一端端与铕(EEu)连连接,另另一端与与抗体/抗原分分子上的的自由氨氨基连接接,形成成EU标记记的抗体体/抗原原,经过过免疫反反应之后后生成免免疫复合合物。由由于这种种复合物物在水中中的荧光光强度非非常弱,因因此加入入一种增增强剂,使使Eu33+从复复合物上上解离下下来,自自由Euu3+同同增强剂剂中
7、的另另一种螯螯合剂螯螯形成一一种胶态态分子团团,这种种分子团团在紫外外光的激激发下能能发出很很强的荧荧光,信信号增强强了百万万倍。因因为这种种分析方方法使用用了解离离增强步步骤,因因此称为为解离增增强镧系系元素荧荧光免疫疫分析。乙肝病毒(HHBV)标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物,由60年代末70年代初的琼脂扩撒法,依次发展为血凝法酶联免疫吸附(ELISA)、同位素免疫标记(RIA)化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和80年代中建立的稀土离子荧光标记(时间分辨荧光免疫分析)等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步,其方法每发展一步,乙肝标记物检出的灵敏度和
8、准确性都得到不同的提高。时间分辨荧荧光免疫疫分析(TTRF)为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物,以单克隆抗体包被支持物与样品中抗原反应,再加入有铕(EU)标记的抗体,进行反应检测,可大大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点,提高了检测的灵敏度和准性,该TRF法检测乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好,干扰因素少,TRF为目前检测乙肝病毒标记物最理想的方法。TRF定量量检测乙乙肝病毒毒“两对半半”为临床床诊断乙乙肝提供供了新手手段,有有助于临临床客观观的分析析HBVV感染情情况、疗疗效的观观察和转转归等情情况的分分析,至至少可对对下列情情况更具具有独特特的诊断断价值:1、治疗前前
9、进行病病毒定量量检测,可可以指导导选择抗抗病毒药药物,避避免盲目目用药。2、治疗后后定量间间接判断断体内病病毒数量量,有助助于疗效效的观察察。 3、怀孕孕前进行行定量测测定,有有助于选选择有利利于的怀怀孕时机机。乙肝肝孕妇进进行定量量检查,有有助于使使部分病病人得到到及时的的正确的的诊断 目前我科已已正式开开展了乙乙肝二对对半的TTRFIIA定量量分析,其其每一项项的正常常值范围围均是由由我国卫卫生部根根据美国国雅培的的标准而而制定,其其灵敏度度,准确确度,及及精确度度都有远远远优于于一般的的ELIISA法法,乙肝肝两对半半的定量量制定将将给临床床提供一一个关于于乙肝诊诊断及疗疗效,预预后判断
10、断的更可可靠的实实验结果果。1、 极大地提高高了检测测的灵敏敏度 时时间分辨辨荧光免免疫定量量技术(TTRFIIA)检检测HbbsAgg灵敏度度可达00.2nng/mml,而而酶标(EEIASSA)检检测的灵灵敏度是是2ngg/mll,极大大地提高高检测的的灵敏度度。因此此,在急急性乙肝肝早期能能及早检检出HbbsAgg,确证证HBVV感染,缩缩短窗口口期;其其次,可可发现低低浓度HHbsAAg携带带者;在在部分慢慢性乙肝肝患者中中,由于于机体缺缺乏对HHBV包包蟆蛋白白的免疫疫应答,HbsAg表达较低,酶标检测可出现HbsAg和HbsAb均阴性的情况,TRF技术则可避免这些情况的发生,为正确
11、判断病情提供依据。2、 能动态观察察疗效和和监测病病情1) 定量分析HHBsAAg和HBssAb的的浓度变变化,可可预见急急性乙肝肝是否处处于恢复复期。如如HBssAg浓浓度降低低,HBBsAbb浓度逐逐渐升高高,可说说明病情情正往恢恢复期发发展;反反之,HHBsAAg浓度度处于较较高水平平或上升升趋势,而而HBssAb一一直处于于较低水水平,则则易发展展为慢性性乙肝或或病毒携携带者。2) 定量分析HHBeAAg和HBeeAb的的浓度变变化,可可反映病病情变化化和治疗疗效果。定定量测定定能明确确检测 HBeeAg和和HBeeAb转转换的时时期,即即表现为为HBeeAg浓浓度下降降和HBBeAb
12、b升高的的过程。高高浓度的的HBeeAg还还可间接接提示病病毒处于于高复制制状态,具具有较高高传染性性。高浓浓度的HHBeAAb一方方面提示示病情好好转而在在某些时时候(如如肝功能能指标很很差)则则可能与与肝坏死死、肝硬硬化、肝肝癌有关关。3) HBcAbb浓度的的高低可可反映病病毒感染染的状态态。高浓浓度的抗抗-Hbbc提示示乙肝性性感染,恢恢复期浓浓度降低低。慢性性乙肝呈呈抗-HHbc持持续高浓浓度。而而低浓度度的抗-Hbcc一般为为恢复期期或既往往感染。4) 有利于对慢慢性肝炎炎活动性性或非活活动性的的判断。非非活动性性慢性乙乙肝各项项指标相相对稳定定,活动动性往往往呈现进进行性变变化。
13、3、 TRFIAA和定量量PCRR技术可可互相补补充血清HBVVDNAA荧光定定量PCCR测定定可以直直接反映映血液中中病毒复复制状态态,具有有很多临临床应用用价值,但但不能完完全反映映病毒复复制静息息期肝细胞胞内HBBV病毒毒状态。HBVDNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除,结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态。4、 HBsAbb的定量量测定能能够对乙乙肝的预预防起到到监督作作用 HBsAAb的定定量测定定能够对对抗体是是否真正具有有“中和”HBVV的免疫疫力作出出正确评评价,对对乙肝的的预防起起到监督督作用。HBsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA检测即可呈
14、阳性结果,但并不提示机体都一定具有免疫力,而HBsAb的含量在10100mlU/ml 之间的样本,定性虽为“阳性”,但此时机体对HBV的免疫力较弱,甚至不能预防HBV感染。只有HBsAb的含量达到100mlU/ml以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量检测,可根据HBsAb的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙肝苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义,特别是在少年儿童预防乙肝方面。乙肝两对半半定量的的临床意意义1、 乙肝表面抗抗原(HHBsAAg)定定量l 能极早地检检出HBBsAgg,确证证乙肝感感染,几几乎能与与preeSl同同时检测测出。在在
15、乙肝病病程中大大大缩短了了窗口期期的时间间。l 由于机体常常缺乏对对包膜蛋蛋白的免免疫应答答,HBBsAgg表达较较低,可可出现HHBsAAg、AAntii-HBBs均阴阴性的情情况,定定量检测测HBssAg则则可避免免这些情情况的出出现。l 病毒发生变变异后,病病毒表达达量较低低,甚至至“定性”检测不不出抗原原。可检检测出HHBsAAg,并并极有可可能同时时检测出出HBssAg、Anti-HBs。l 国内外学者者研究表表明HBBsAgg的细胞胞免疫应应答与肝肝细胞损损伤有一一定关系系。血清清中HBBsAgg含量和和病人对对HBssAg细细胞免疫疫成反比比关系,而而肝功能能改就则则与此种种细胞
16、免免疫成反反比。而而定量检检测HBBsAgg是反映映这一关关系的唯唯一手段段。l 一般来说,慢慢性肝炎炎HBssAgCCOI相相对恒定定:而活活动性肝肝炎HBBsAggCOII往往较较高且不不稳定。2、乙肝表表面抗体体(Annti-HBss)定量量l Anti-HBss的定量量检测能能够地机机体是否否真正具具有“中和”HBVV免疫力力作为正正确评价价,避免免误误导导病人,对对乙肝的的预防起起到监督督作用。l Anti-HBss含理在在101000IU/L之间间的样本本,乙肝肝两对半半定性的的结果为为阳性,但但此时机机体对HHBV并并无中和和作用,仍仍有感染染HBVV的危险险。只有有定量检检测A
17、nnti-HBss在1000UII/L以以上时才才具有抵抵抗HBBV入侵侵的作用用。因此此,定量量检测乙乙肝两对对半对乙乙肝疫苗苗免疫力力的评价价和高危危人群预预防具有有重要意意义。3、乙能ee抗原(HHBeAAg)定定量l HBeAgg是乙肝肝病毒在在肝细胞胞在繁殖殖时出现现的前CC/C基基因的产产物,经经蛋白酶酶水解后后HBee蛋白质质以非颗颗粒形式式分泌入入血清中中。在急急性HBBV感染染时,血血清中可可出现HHBeAAg,但但维持可可测水平平的时间间很短暂暂(数天天数周)。HHBeAAg阳性性一般是是提示有有大量病病毒存在在,是急急性乙肝肝恢复期期的首选选血清学学指标。l 由前C基因因
18、突变HHBV感感染所致致的急性性或慢性性乙肝,始始终不出出HBeeAg,但但HBVV-DNNA进行行性复制制。HBBeAgg亦在高高COII水平波波动。与与前者HHBeAAg阳性性慢性乙乙肝类型型中的转转换期比比较,两两对半定定性均表表现为小小三阳,但但后者主主要表现现在高HHBeAAgCOOI值,忽忽高忽低低的ALLT值和和HBVV-DNNA始终终阳性。4、乙肝ee抗体(AAntii-HBBe定量量l 由HBV野野型株感感染所引引起的急急性或慢慢性乙型型肝炎,其其自然史史分为HHBeAAg阳性性期和AAntii-HBBe阳性期。定定量监测测能明确确出HBBeAgg向Annti-HBee换的时
19、时期,即即表现为为HBeeAgCCOI下下降(含含量降低低)和AAntii-HBBeCOOI下降降(含量量升高)的的过程。因因此,AAntii-HBBe定量量与HBBeAgg定量联联合检测测对监测测HBVV感染的的病程及及药物的的疗效观观察有很很好的实实际意义义。l 由前C基因因突就株株HBVV感染所所致异型型慢性乙乙肝,由由于患者者始终不不出现HHBeAAg。因因此,长长期监测测患者AAntii-HBBe含量量对判断断其预后后和转归归具有十十分重要要的价值值。5、乙肝核核心抗体体(Annti-HBcc)定量量l 乙肝病毒由由外壳HHBsAAg和内内核HBBcAgg组成。乙乙肝病毒毒感染期期间
20、,一一般会产产生Annti-HBcc,在HHBcAAg出现现后即可可从血清清中检测测到。偶偶尔也有有Antti-HHBc阴阴性的HHBV感感染者,多多见于免免疫抑制制的病人人。l 在乙肝感染染康复者者HBssAg携携带者中中,Annti-HBcc可长期期存在。因因此,在在特殊人人群中开开展Annti-HBcc筛选试试验对预预防乙肝肝的传播播有重要要参考价价值。l Anti-HBcc定量怀怀其他HHBV试试验一同同检测有有助于乙乙肝感染染的诊断断和监测测。在其其他指标标缺乏的的情况下下(如HHBsAAg阴性性),AAntii-HBBc定量量可能是是现存HHBV感感染的唯唯一指标标。时间分辨免免疫
21、荧光光法检测测乙型肝肝炎病毒毒标志物物临床工作中中发现少少部分经经酶联免免疫吸附附法(EELISSA)检检测仅乙乙型肝炎炎表面抗抗原(HHBsAAg)和和抗HBBc IIgG阳阳性的患患者,病病毒含量量却很高高。为此此,采用用时间分分辨免疫疫荧光分分析法(TTRF)对对34例例此类患患者进行行乙型肝肝炎标志志物(HHBVMM)的检检查,现现将结果果报道如如下:一、 资料与方法法 11.病例选选择:为为20002年22月至99月住院院或门诊诊患者,共共34例例,男221例,女女13例例,年龄龄5558岁,平平均(229.2218.7)岁岁。采静静脉血分分离血清清,用EELISSA进行行HBVV标
22、志物物(HBBV MM)检测测及HBBV DDNA定定量检查查。留取取血清置置-300保存。(11)HBBsAgg、抗HHBc IgGG阳性,乙乙型肝炎炎e抗原原(HBBeAgg)、抗抗-HBss、抗-HBcc IggM阴性性;(22)HBBV DDNA含含量1044拷贝/ml;(3)近近3个月月未使用用抗病毒毒药物。每每人进行行2次抗抗原抗体检查查,结果果一致。22次HBBV DDNA检检查,结结果相差差1个数数量级以以下。2.常规HHBV M检测测:用EELISSA法,试试剂为上上海科华华生物工工程股份份有限公公司产品品,按产产品说明明书操作作。3.HBVV DNNA含理理测定:采用实实时
23、荧光光定量PPCR法法,试剂剂盒购自自广州中中山医科科大学达达安基因因诊断中中心。仪仪器为美美国Peerkiin EElmeer 公公司GeeneAAmp E57700型型PCRR仪。严严格按说说明书操操作,检检测灵敏敏度为1103拷拷贝/mml。 44.TRRF法检检查HBBV MM:试剂剂为上海海新波生生物技术术有限公公司产品品,采用用Anyytesst20000时时间分辨辨检测仪仪。严格格按照说说明书操操作。 5.统计分分析:取取HBVV DNNA含量量的对数数值进行行成组设设计的两两样本均均数比较较,行tt检验。二、 结果 11.HBVV M :用TTRF法法检查发发现,334例患患者
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