TSPOTTB技术用于辅助诊断结核临床病例报道3011.docx

《TSPOTTB技术用于辅助诊断结核临床病例报道3011.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TSPOTTB技术用于辅助诊断结核临床病例报道3011.docx（9页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET.T SPOT TB技术用于辅助诊断结核临床病例报道莫凌，孟成艳，张舒，金嘉琳，张文宏作者单位：20000400 上海海，复旦旦大学附附属华山山医院感感染科通讯作者：张文宏宏，Emmaill：zhhanggwennhonng退修稿：000744基金项目：国家重重点基础础研究发发展计划划（20005CCB52231002）近年来，我我国结核核病的发发病率有有上升趋趋势，临临床上经经常会遇遇到一些些症状不不典型的的结核病病和肺外外结核病病，而目目前可用用于诊断断结

2、核病病的方法法有限，同同时又缺缺乏快速速敏感的的实验室室技术，为为结核病病的早期期诊断与与治疗带带来困难难。ELLISPPOT（enzyme-linked immunospot assay, 酶联免疫斑点法）技术是一种新型的免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞1。由ELISPOT发展来的T SPOT TB（结核感染T细胞斑点试验）技术就是通过检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特异性的细胞因子IFN-来诊断是否存在结核感染。1ELIISPOOT技术术原理该方法源于于Mahhairras等等在19996年年发现的的一段存存在结核核分枝杆杆菌中名名为“RD1”的基因因序列2，而

3、在在卡介苗苗菌株和和大部分分环境中中的分枝枝杆菌基基因中则则缺乏RRD1序序列。RRD1编编码产生生两种蛋蛋白：EESATT-6和和CFPP-100（cuultuure filltraate prooteiin），EESATT-6和和CFPP-100作为特特异性抗抗原刺激激机体TT淋巴细细胞产生生特异性性的细胞胞因子IIFN-。 根据这一原原理，TT SPPOT技技术利用用结核杆杆菌感染染者外周周血单核核细胞中中存在结结核特异异的活化化T淋巴巴细胞，这这些淋巴巴细胞在在受到结结核杆菌菌特异抗抗原刺激激后分泌泌干扰素素而设计计的T细细胞免疫疫斑点试试验。外外周血单单核细胞胞，结核核特异的的混合抗

4、抗原A和和混合抗抗原B（分分别为EESATT-6和和CFPP-100的部分分多肽片片断），对对照试剂剂一起加加入预先先包被抗抗干扰素素抗体的的微孔培培养板进进行培养养。当外外周血单单核细胞胞中存在在针对结结核杆菌菌的效应应T淋巴巴细胞时时，培养养液中加加入的结结核杆菌菌特异混混合抗原原多肽AA和B将将刺激这这些效应应T淋巴巴细胞分分泌干扰素素。分泌泌的干扰素素被微孔孔板上的的抗体捕捕获，再再次加入入的碱性性磷酸酶酶标记并并针对干扰素素不同表表位的抗抗体与被被捕获的的干扰素素结合，滞滞留在微微孔板表表面。显显色底物物溶液在在反应部部位被酶酶分解形形成不溶溶性色素素沉淀斑斑点。每每一个斑斑点代表表

5、一个干扰素素分泌细细胞（结结核特异异的效应应T细胞胞）。通通过对斑斑点进行行计数可可以推测测体内是是否存在在对结核核杆菌反反应的效效应T细细胞，从从而对结结核杆菌菌感染进进行辅助助诊断。2ELIISPOOT操作作方法采集8mll患者的的血液加加入含柠柠檬酸钠钠的CPPT采血血管，分分离外周周血单个个核细胞胞（PBBMC），加加入细胞胞培养液液，轻轻轻重悬细细胞。在在已包被被抗IFFN-抗体的的微量板板的4个个孔中，分分别加入入细胞培培养液作作为阴性性对照，植植物血凝凝素PHHA作为为阳性对对照，结结核分枝枝杆菌特特异混合合多肽AA和B，分分别含EESATT-6与与CFPP-100（Oxxfor

6、rd IImmuunotte LLtd., OOxfoord, UKK）。然然后在每每个孔中中加入含含25000000个细胞胞的上述述悬液。把把微量板板放在337培养116-220小时时后，用用PBSS液洗板板4次，加加入碱性性磷酸酶酶标记的的小鼠抗抗人IFFN-单抗，在在2-88下孵育育1小时时。孵育育后再用用PBSS液洗板板4次。最最后每孔孔加入显显色底物物液BCCIP/NBTTPLUUS，室室温中静静置7分分钟后观观察结果果，并用用计算机机辅助成成像分析析系统进进行斑点点阅读与与统计（EELISSPOTT试剂盒盒由上海海复星科科技有限限公司提提供）。第第一孔为为阴性对对照孔，第第二孔为为

7、阳性对对照孔，如如出现斑斑点，说说明试验验成功。第第三，四四孔为实实验孔，当当测试孔孔A或BB达到以以下标准准则判定定为阳性性结果：（1） 如果阴阴性对照照孔斑点点数为00-5个个，测试试孔斑点点数减去去阴性对对照孔斑斑点数6。（22） 如如果阴性性对照孔孔斑点数数6个，测测试孔斑斑点数必必须2倍的的阴性对对照孔斑斑点数。3ELIISPOOT的临临床应用用我院传染科科首次将将T SSPOTT TBB技术用用于临床床，辅助助诊断疑疑似结核核患者，为为结核病病的诊断断提供了了一项新新的技术术，并取取得一定定成效。现现将一例例经T SPOOT TTB 技技术鉴别别诊断后后得到有有效治疗疗反应的的病例

8、报报道如下下。31病病例报道道患者，男，62岁。入院前3月无诱因下出现颈部疼痛,一月前出现左上肢麻木,进行性乏力，伴发热，体温在38度左右，无畏寒，寒战，无咳嗽，咳痰，无消瘦，盗汗等。入院查体，精神较萎，左侧颈部可扪及肿大淋巴结，质软，无压痛。心肺无特殊，腹软，肝脾肋下未及。颈软，克氏征（-），布氏征（-），余病理征均阴性。左上肢肌力3级，肌张力可，余肢体肌力，肌张力正常。辅助检查，血血常规：白细胞胞9.442109/L,中性粒粒细胞772%。脑脑脊液：白细胞胞 2106/L，总总蛋白 9833mg/L,葡葡萄糖33.9mmmoll/L,氯化物物 1220mmmol/L。脑脑脊液抗抗酸染色色，

9、细菌菌涂片培培养，真真菌涂片片培养均均阴性。颈椎MRI：多发椎体异常信号伴硬膜增厚（图1）。头颅MRI示：双侧额叶、侧脑室旁多发斑点状异常信号（图2）。高度怀疑颈部与颅内异常信号为转移性肿瘤可能大，但骨髓穿刺，腹部B超，腹部CT，颈部淋巴结活检均未发现异常。PPD（-）。图1：A图图为该患患者治疗疗前颈椎椎MRII：在颈颈2-44椎体之之间有异异常信号号，并有有硬脊膜膜增厚。BB图为治治疗后同同一部位位的MRRI：可可见原先先的异常常信号降降低，硬硬脊膜增增厚略有有减轻。图2：该患患者头颅颅MRII。可见见侧脑室室旁有圆圆形异常常信号。32结结 果用T SPPOT TB检检测该患患者血液液标本

10、，结结果阳性性（图33）。于于是对该该患者行行诊断性性抗痨治治疗，方方案为四四联（异异烟肼，利利福平，吡吡嗪酰胺胺，乙胺胺丁醇），同同时加用用甲强龙龙30mmg。治治疗3天天后，患患者体温温平，治治疗一周周后，患患者颈部部疼痛好好转，左左上肢肌肌力逐渐渐恢复，两两周后，患患者左上上肢肌力力基本恢恢复正常常。复查查颈部MMRI示示：原先先异常信信号减弱弱，硬脊脊膜增厚厚减轻（图图1-BB）。患患者出院院时仍维维持四联联抗痨治治疗，激激素减为为强的松松20mmg ，嘱嘱患者随随访。从从该病人人的治疗疗反应诊诊断该患患者为结结核性脑脑脊髓膜膜炎和椎椎体结核核。图3：该病病例的EELISSPOTT结果

11、。其其中第一一行为阴阴性对照照孔，第第二行为为阳性对对照孔，第第三，四四行为实实验孔。图图中可见见第3孔孔中出现现大量斑斑点，为为阳性结结果。每每个斑点点代表一一个分泌泌INFF- 的TT细胞。用用计算机机辅助成成像技术术进行斑斑点计数数得到44个孔的的斑点数数分别为为2，8832，4401，00。33讨讨 论该患者是肺肺外结核核感染，缺缺乏典型型的结核核中毒症症状，如如消瘦，盗盗汗等，影影像学检检查发现现颈椎，头头颅有异异常信号号，从形形态学上上倾向于于转移性性肿瘤，但但对常见见肿瘤的的筛查未未发现原原发肿瘤瘤的迹象象，脑脊脊液检查查只有蛋蛋白较高高，细胞胞数无明明显升高高。常见见的结核核检

12、查，如如PPDD试验，脑脑脊液抗抗酸染色色，涂片片均为阴阴性，淋淋巴结活活检也未未发现结结核感染染病灶。在在这种情情况下，我我们用EELISSPOTT技术对对其血液液进行检检测，结结果提示示阳性。当当然，EELISSPOTT不是诊诊断结核核的金标标准，所所以我们们不能就就此确诊诊为结核核。于是是对病人人行诊断断性抗痨痨治疗，从从抗痨治治疗的反反应来看看，患者者症状明明显好转转，由此此判断治治疗有效效，证实实该患者者为结核核感染诊诊断成立立。目前，临床床诊断结结核的方方法有限限。结核核菌素试试验（TTST）是是临床常常用筛查查结核的的免疫学学方法，虽虽然操作作简单，观观察结果果方便，但但由于其其

13、有较高高的假阳阳性和假假阴性，对对临床结结核病的的诊断意意义不大大。细菌菌学是诊诊断结核核的金标标准，但但培养需需要两个个月的时时间，而而且阳性性率取决决于采集集标本中中细菌的的数量，不不利于早早期诊断断与治疗疗。影像像学作为为辅助诊诊断方法法，对活活动性肺肺结核诊诊断有一一定价值值，但对对肺外结结核诊断断存在困困难。EELISSOPTT法作为为一种新新的酶免免疫检测测方法在在国外（主主要是英英国与美美国）新新近刚开开始用于于结核杆杆菌感染染的检测测，它不不仅灵敏敏度高，特特异性强强3，而且且操作简简单，需需时少，一一般两天天就能看看到结果果。在国国内也已已经进入入试验性性的诊断断阶段，但但尚

14、缺乏乏大规模模的临床床实验及及评价。Susann等在一一项前瞻瞻性、双双盲队列列研究中中得到EELISSPOTT的敏感感性为883%，显显著高于于皮试的的敏感性性63%，同时时，非结结核病人人不会产产生假阳阳性。在在小于33岁，合合并HIIV感染染及营养养不良的的儿童中中，皮试试的敏感感性显著著下降，而而ELIISPOOT的敏敏感性没没有显著著性改变变4。另有有研究得得到ELLISPPOT在在普通人人群中的的敏感性性为966%，在在健康人人群中的的特异性性为1000%，在在HIVV阳性患患者中的的特异性性为922%55。目前前该技术术已在国国外广泛泛用于活活动性结结核病和和结核潜潜伏感染染者的

15、诊诊断，HIVV合并结结核感染染的检测测，用于于区别结结核感染染者与BBCG接接种以及及耐药结结核菌感感染的快快速检测测。4总结综上所述，ELISPOT作为一种新的检测结核感染的酶免疫学方法,其敏感性与特异性显著高于传统的TST,而且所需时间少，有利于结核病的早期诊断与治疗意义重大，对隐性结核感染也有诊断价值。但由于价格昂贵,不如TST操作简便易行,限制了该方法在临床的推广与应用。我院首次将该方法试验性的用于辅助临床诊断，并取得一定成效，在临床症状不典型，PPD诊断不明确，涂片及培养均为阴性的疑似结核病患者中，辅以ELISPOT方法，可以帮助确诊结核感染。参考文献1侯世世芳，许许贤豪，刘刘广志

16、等等，酶联联免疫斑斑点（EELISSPOTT）技术术的应用用. 中中国神经经免疫学学和神经经病学杂杂志，220022;100（9）:2000-2002.2 LLalbbanii A. Spoottiing lattentt innfecctioon: thee paath to bettterr tuuberrcullosiis cconttroll.Thhoraax 20003;58:9166-91183 PPhillip C, Rogger H, Annnettte FF, eet aal. Larrge-scaale evaaluaatioon oof eenzyyme-linnkedd

17、 immmunnosppot asssay andd skkin tesst ffor diaagnoosiss off Myycobbactteriium tubbercculoosiss inffecttecttionn aggainnst a ggraddiennt oof eexpoosurre iin tthe Gammbiaa.Cllin Inffectt Diis.220044;388:9666-9973.4Liiebeeschhuettz SS, Baambeer SS, Ewwer K, et al. Diaagnoosiss off tuuberrcullosiis iin

18、 SSoutth AAfriicann chhilddrenn wiith a TT-ceell-bassed asssay: a proospeectiive cohhortt sttudyy. LLanccet. 20004;3644(94452):21196-22033.5Chhapmman AL, Muunkaantaa M, Wiilkiinsoon KKA, et al. Raapidd deetecctioon oof aactiive andd laatennt ttubeercuulossis inffecttionn inn HIIV-pposiitivve iindiividdualls bby eenummeraatioon oof MMycoobatteriium tubbercculoosiss-sppeciificc T cellls.AIDDS. 20002,116:222855-22293.