LabAlliace高效液相色谱系统培训教材(增加)6578.docx

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1、天津兰博实验仪器设备有限公司LabAlliace高效液相色谱系统培训教材一、液相色谱系统的基本原理 1、色谱法分类按两相的物物理状态态可分为为：气相相色谱法法(GCC)和液液相色谱谱法(LLC)。气气相色谱谱法适用用于分离离挥发性性化合物物。GCC根据固固定相不不同又可可分为气气固色谱谱法(GGSC)和气液液色谱法法(GLLC)，其其中以GGLC应应用最广广。液相相色谱法法适用于于分离低低挥发性性或非挥挥发性、热热稳定性性差的物物质。LLC同样样可分为为液固色色谱法(LSCC)和液液液色谱谱法(LLLC)。此外外还有超超临界流流体色谱谱法(SSFC)，它以以超临界界流体（界界于气体体和液体体之

2、间的的一种物物相）为为流动相相（常用用CO22），因因其扩散散系数大大，能很很快达到到平衡，故故分析时时间短，特特别适用用于手性性化合物物的拆分分。按原理分为为吸附色色谱法(AC)、分配配色谱法法(DCC)、离离子交换换色谱法法(IEEC)、排排阻色谱谱法(EEC，又又称分子子筛、凝凝胶过滤滤(GFFC)、凝凝胶渗透透色谱法法(GPPC）和和亲和色色谱法。(此外还还有电泳泳)。按操作形式式可分为为纸色谱谱法(PPC)、薄薄层色谱谱法(TTLC)、柱色色谱法。2、液相色色谱理论论发展简简况色谱法的分分离原理理是：溶溶于流动动相(mmobiile phaase)中的各各组分经经过固定定相时，由由于

3、与固固定相(staatioonarry pphasse)发发生作用用（吸附附、分配配、离子子吸引、排排阻、亲亲和）的的大小、强强弱不同同，在固固定相中中滞留时时间不同同，从而而先后从从固定相相中流出出。又称称为色层层法、层层析法。色谱法最早早是由俄俄国植物物学家茨茨维特（TTsweett）在在19006年研研究用碳碳酸钙分分离植物物色素时时发现的的，色谱谱法(CChroomattogrraphhy)因因之得名名。后来来在此基基础上发发展出纸纸色谱法法、薄层层色谱法法、气相相色谱法法、液相相色谱法法。液相色谱法法开始阶阶段是用用大直径径的玻璃璃管柱在在室温和和常压下下用液位位差输送送流动相相，称

4、为为经典液液相色谱谱法，此此方法柱柱效低、时时间长（常常有几个个小时）。高高效液相相色谱法法(Hiigh perrforrmannce Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HPPLC)是在经经典液相相色谱法法的基础础上，于于60年年代后期期引入了了气相色色谱理论论而迅速速发展起起来的。它它与经典典液相色色谱法的的区别是是填料颗颗粒小而而均匀，小小颗粒具具有高柱柱效，但但会引起起高阻力力，需用用高压输输送流动动相，故故又称高高压液相相色谱法法(Hiigh Preessuure Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HPPLC)。又因因分析速速度快而而称为

5、高高速液相相色谱法法(Hiigh Speeed Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HSSLP)。也称称现代液液相色谱谱。3、HPLLC的特特点和优优点HPLC有有以下特特点：高压压力力可达11503000kg/ccm2。色谱谱柱每米米降压为为75 kg/ccm2以上。高速流速速为0.11100.00 mll/miin。高效可达达50000塔板板每米。在在一根柱柱中同时时分离成成份可达达1000种。高灵敏度紫外检检测器灵灵敏度可可达0.01nng。同同时消耗耗样品少少。HPLC与与经典液液相色谱谱相比有有以下优优点：速度快通通常分析析一个样样品在115330 mmin，有

6、有些样品品甚至在在5 mmin内内即可完完成。分辨率高可选择择固定相相和流动动相以达达到最佳佳分离效效果。灵敏度高紫外检检测器可可达0.01nng，荧荧光和电电化学检检测器可可达0.1pgg。柱子可反复复使用用一根根色谱柱柱可分离离不同的的化合物物。样品量少，容容易回收收样品品经过色色谱柱后后不被破破坏，可可以收集集单一组组分或做做制备。4、高效液液相色谱谱分离原原理高效液相色色谱法按按分离机机制的不不同分为为液固吸吸附色谱谱法、液液液分配配色谱法法（正相相与反相相）、离离子交换换色谱法法、离子子对色谱谱法及分分子排阻阻色谱法法。a液固色色谱法使用固固体吸附附剂，被被分离组组分在色色谱柱上上分

7、离原原理是根根据固定定相对组组分吸附附力大小小不同而而分离。分分离过程程是一个个吸附解吸附附的平衡衡过程。常常用的吸吸附剂为为硅胶或或氧化铝铝，粒度度5110mm。适用用于分离离分子量量200010000的的组分，大大多数用用于非离离子型化化合物，离离子型化化合物易易产生拖拖尾。常常用于分分离同分分异构体体。b液液色色谱法使用将将特定的的液态物物质涂于于担体表表面，或或化学键键合于担担体表面面而形成成的固定定相，分分离原理理是根据据被分离离的组分分在流动动相和固固定相中中溶解度度不同而而分离。分分离过程程是一个个分配平平衡过程程。涂布式固定定相应具具有良好好的惰性性；流动动相必须须预先用用固定

8、相相饱和，以以减少固固定相从从担体表表面流失失；温度度的变化化和不同同批号流流动相的的区别常常引起柱柱子的变变化；另另外在流流动相中中存在的的固定相相也使样样品的分分离和收收集复杂杂化。由由于涂布布式固定定相很难难避免固固定液流流失，现现在已很很少采用用。现在在多采用用的是化化学键合合固定相相，如CC18、CC8、氨基基柱、氰氰基柱和和苯基柱柱。液液色谱法法按固定定相和流流动相的的极性不不同可分分为正相相色谱法法(NPPC)和和反相色色谱法(RPCC)。正相色谱法法采用用极性固固定相(如聚乙乙二醇、氨氨基与腈腈基键合合相)；流动相相为相对对非极性性的疏水水性溶剂剂(烷烃烃类如正正已烷、环环已烷

9、），常常加入乙乙醇、异异丙醇、四四氢呋喃喃、三氯氯甲烷等等以调节节组分的的保留时时间。常常用于分分离中等等极性和和极性较较强的化化合物(如酚类类、胺类类、羰基基类及氨氨基酸类类等）。反相色谱法法一般般用非极极性固定定相（如如C188、C8）；流流动相为为水或缓缓冲液，常常加入甲甲醇、乙乙腈、异异丙醇、丙丙酮、四四氢呋喃喃等与水水互溶的的有机溶溶剂以调调节保留留时间。适适用于分分离非极极性和极极性较弱弱的化合合物。RRPC在在现代液液相色谱谱中应用用最为广广泛，据据统计，它它占整个个HPLLC应用用的800%左右右。随着柱填料料的快速速发展，反反相色谱谱法的应应用范围围逐渐扩扩大，现现已应用用于

10、某些些无机样样品或易易解离样样品的分分析。为为控制样样品在分分析过程程的解离离，常用用缓冲液液控制流流动相的的pH值值。但需需要注意意的是，CC18和CC8使用的的pH值值通常为为2.557.5（228），太太高的ppH值会会使硅胶胶溶解，太太低的ppH值会会使键合合的烷基基脱落。有有报告新新商品柱柱可在ppH 11.510范范围操作作。正相色谱法法与反相相色谱法法比较表表正相色谱法法 反相相色谱法法固定相极性性高中中 中中低流动相极性性低中中 中中高组分洗脱次次序极性性小先洗洗出 极性大大先洗出出从上表可看看出，当当极性为为中等时时正相色色谱法与与反相色色谱法没没有明显显的界线线（如氨氨基键

11、合合固定相相）。c离子交交换色谱谱法固固定相是是离子交交换树脂脂，常用用苯乙烯烯与二乙乙烯交联联形成的的聚合物物骨架，在在表面未未端芳环环上接上上羧基、磺磺酸基（称称阳离子子交换树树脂）或或季氨基基（阴离离子交换换树脂）。被被分离组组分在色色谱柱上上分离原原理是树树脂上可可电离离离子与流流动相中中具有相相同电荷荷的离子子及被测测组分的的离子进进行可逆逆交换，根根据各离离子与离离子交换换基团具具有不同同的电荷荷吸引力力而分离离。缓冲液常用用作离子子交换色色谱的流流动相。被被分离组组分在离离子交换换柱中的的保留时时间除跟跟组分离离子与树树脂上的的离子交交换基团团作用强强弱有关关外，它它还受流流动相

12、的的pH值值和离子子强度影影响。ppH值可可改变化化合物的的解离程程度，进进而影响响其与固固定相的的作用。流流动相的的盐浓度度大，则则离子强强度高，不不利于样样品的解解离，导导致样品品较快流流出。离子交换色色谱法主主要用于于分析有有机酸、氨氨基酸、多多肽及核核酸。d离子对对色谱法法又称称偶离子子色谱法法，是液液液色谱谱法的分分支。它它是根据据被测组组分离子子与离子子对试剂剂离子形形成中性性的离子子对化合合物后，在在非极性性固定相相中溶解解度增大大，从而而使其分分离效果果改善。主主要用于于分析离离子强度度大的酸酸碱物质质。分析碱性物物质常用用的离子子对试剂剂为烷基基磺酸盐盐，如戊戊烷磺酸酸钠、辛

13、辛烷磺酸酸钠等。另另外高氯氯酸、三三氟乙酸酸也可与与多种碱碱性样品品形成很很强的离离子对。分析酸性物物质常用用四丁基基季铵盐盐，如四四丁基溴溴化铵、四四丁基铵铵磷酸盐盐。离子对色谱谱法常用用ODSS柱（即即C188），流流动相为为甲醇-水或乙乙腈-水水，水中中加入33100 mool/LL的离子子对试剂剂，在一一定的ppH值范范围内进进行分离离。被测测组分保保时间与与离子对对性质、浓浓度、流流动相组组成及其其pH值值、离子子强度有有关。e排阻色色谱法固定相相是有一一定孔径径的多孔孔性填料料，流动动相是可可以溶解解样品的的溶剂。小小分子量量的化合合物可以以进入孔孔中，滞滞留时间间长；大大分子量量

14、的化合合物不能能进入孔孔中，直直接随流流动相流流出。它它利用分分子筛对对分子量量大小不不同的各各组分排排阻能力力的差异异而完成成分离。常常用于分分离高分分子化合合物，如如组织提提取物、多多肽、蛋蛋白质、核核酸等。5、固定相相和流动动相在色谱分析析中，如如何选择择最佳的的色谱条条件以实实现最理理想分离离，是色色谱工作作者的重重要工作作，也是是用计算算机实现现HPLLC分析析方法建建立和优优化的任任务之一一。本节节着重讨讨论填料料基质、化化学键合合固定相相和流动动相的性性质及其其选择。（1）基质质（担体体）HPLC填填料可以以是陶瓷瓷性质的的无机物物基质，也也可以是是有机聚聚合物基基质。无无机物基

15、基质主要要是硅胶胶和氧化化铝。无无机物基基质刚性性大，在在溶剂中中不容易易膨胀。有有机聚合合物基质质主要有有交联苯苯乙烯-二乙烯烯苯、聚聚甲基丙丙烯酸酯酯。有机机聚合物物基质刚刚性小、易易压缩，溶溶剂或溶溶质容易易渗入有有机基质质中，导导致填料料颗粒膨膨胀，结结果减少少传质，最最终使柱柱效降低低。A基质的种种类1）硅胶硅胶是HPPLC填填料中最最普遍的的基质。除除具有高高强度外外，还提提供一个个表面，可可以通过过成熟的的硅烷化化技术键键合上各各种配基基，制成成反相、离离子交换换、疏水水作用、亲亲水作用用或分子子排阻色色谱用填填料。硅硅胶基质质填料适适用于广广泛的极极性和非非极性溶溶剂。缺缺点是

16、在在碱性水水溶性流流动相中中不稳定定。通常常，硅胶胶基质的的填料推推荐的常常规分析析pH范范围为228。硅胶的主要要性能参参数有：平均粒度度及其分分布。平均孔径径及其分分布。与与比表面面积成反反比。比表面积积。在液液固吸附附色谱法法中，硅硅胶的比比表面积积越大，溶溶质的kk值越大大。含碳量及及表面覆覆盖度（率率）。在在反相色色谱法中中，含碳碳量越大大，溶质质的k值值越大。含水量及及表面活活性。在在液固吸吸附色谱谱法中，硅硅胶的含含水量越越小，其其表面硅硅醇基的的活性越越强，对对溶质的的吸附作作用越大大。端基封尾尾。在反反相色谱谱法中，主主要影响响碱性化化合物的的峰形。几何形状状。硅胶胶可分为为

17、无定形形全多孔孔硅胶和和球形全全多孔硅硅胶，前前者价格格较便宜宜，缺点点是涡流流扩散项项及柱渗渗透性差差；后者者无此缺缺点。硅胶纯度度。对称称柱填料料使用高高纯度硅硅胶，柱柱效高，寿寿命长，碱碱性成份份不拖尾尾。2）氧化铝铝具有与硅胶胶相同的的良好物物理性质质，也能能耐较大大的pHH范围。它它也是刚刚性的，不不会在溶溶剂中收收缩或膨膨胀。但但与硅胶胶不同的的是，氧氧化铝键键合相在在水性流流动相中中不稳定定。不过过现在已已经出现现了在水水相中稳稳定的氧氧化铝键键合相，并并显示出出优秀的的pH稳稳定性。3）聚合物物以高交联度度的苯乙乙烯-二二乙烯苯苯或聚甲甲基丙烯烯酸酯为为基质的的填料是是用于普普

18、通压力力下的HHPLCC，它们们的压力力限度比比无机填填料低。苯苯乙烯-二乙烯烯苯基质质疏水性性强。使使用任何何流动相相，在整整个pHH范围内内稳定，可可以用NNaOHH或强碱碱来清洗洗色谱柱柱。甲基基丙烯酸酸酯基质质本质上上比苯乙乙烯-二二乙烯苯苯疏水性性更强，但但它可以以通过适适当的功功能基修修饰变成成亲水性性的。这这种基质质不如苯苯乙烯-二乙烯烯苯那样样耐酸碱碱，但也也可以承承受在ppH133下反复复冲洗。所有聚合物物基质在在流动相相发生变变化时都都会出现现膨胀或或收缩。用用于HPPLC的的高交联联度聚合合物填料料，其膨膨胀和收收缩要有有限制。溶溶剂或小小分子容容易渗入入聚合物物基质中中

19、，因为为小分子子在聚合合物基质质中的传传质比在在陶瓷性性基质中中慢，所所以造成成小分子子在这种种基质中中柱效低低。对于于大分子子像蛋白白质或合合成的高高聚物，聚聚合物基基质的效效能比得得上陶瓷瓷性基质质。因此此，聚合合物基质质广泛用用于分离离大分子子物质。B基质的的选择硅胶基质的的填料被被用于大大部分的的HPLLC分析析，尤其其是小分分子量的的被分析析物，聚聚合物填填料用于于大分子子量的被被分析物物质，主主要用来来制成分分子排阻阻和离子子交换柱柱。硅胶氧化铝苯乙烯-二二乙烯苯苯甲基丙烯酸酸酯耐有机溶剂剂+适用pH范范围+抗膨胀/收收缩+耐压+表面化学性性质+效能+注：+好+一般+差（2）化学学

20、键合固固定相将有机官能能团通过过化学反反应共价价键合到到硅胶表表面的游游离羟基基上而形形成的固固定相称称为化学学键合相相。这类类固定相相的突出出特点是是耐溶剂剂冲洗，并并且可以以通过改改变键合合相有机机官能团团的类型型来改变变分离的的选择性性。A键合相相的性质质目前，化学学键合相相广泛采采用微粒粒多孔硅硅胶为基基体，用用烷烃二二甲基氯氯硅烷或或烷氧基基硅烷与与硅胶表表面的游游离硅醇醇基反应应，形成成Si-O-SSi-CC键形的的单分子子膜而制制得。硅硅胶表面面的硅醇醇基密度度约为55个/nnm2，由由于空间间位阻效效应（不不可能将将较大的的有机官官能团键键合到全全部硅醇醇基上）和和其它因因素的

21、影影响，使使得大约约有400500%的硅硅醇基未未反应。残余的硅醇醇基对键键合相的的性能有有很大影影响，特特别是对对非极性性键合相相，它可可以减小小键合相相表面的的疏水性性，对极极性溶质质（特别别是碱性性化合物物）产生生次级化化学吸附附，从而而使保留留机制复复杂化（使使溶质在在两相间间的平衡衡速度减减慢，降降低了键键合相填填料的稳稳定性。结结果使碱碱性组分分的峰形形拖尾）。为为尽量减减少残余余硅醇基基，一般般在键合合反应后后，要用用三甲基基氯硅烷烷(TMMCS)等进行行钝化处处理，称称封端（或或称封尾尾、封顶顶，ennd-ccapppingg），以以提高键键合相的的稳定性性。另一一方面，也也有

22、些OODS填填料是不不封尾的的，以使使其与水水系流动动相有更更好的“湿湿润”性性能。由于不同生生产厂家家所用的的硅胶、硅硅烷化试试剂和反反应条件件不同，因因此具有有相同键键合基团团的键合合相，其其表面有有机官能能团的键键合量往往往差别别很大，使使其产品品性能有有很大的的不同。键键合相的的键合量量常用含含碳量(C%)来表示示，也可可以用覆覆盖度来来表示。所所谓覆盖盖度是指指参与反反应的硅硅醇基数数目占硅硅胶表面面硅醇基基总数的的比例。pH值对以以硅胶为为基质的的键合相相的稳定定性有很很大的影影响，一一般来说说，硅胶胶键合相相应在ppH=228的的介质中中使用。B键合相相的种类类化学键合相相按键合

23、合官能团团的极性性分为极极性和非非极性键键合相两两种。常用的极性性键合相相主要有有氰基(-CNN)、氨氨基(-NH22)和二二醇基(DIOOL)键键合相。极极性键合合相常用用作正相相色谱，混混合物在在极性键键合相上上的分离离主要是是基于极极性键合合基团与与溶质分分子间的的氢键作作用，极极性强的的组分保保留值较较大。极极性键合合相有时时也可作作反相色色谱的固固定相。常用的非极极性键合合相主要要有各种种烷基(C1C188)和苯苯基、苯苯甲基等等，以CC18应应用最广广。非极极性键合合相的烷烷基链长长对样品品容量、溶溶质的保保留值和和分离选选择性都都有影响响，一般般来说，样样品容量量随烷基基链长增增

24、加而增增大，且且长链烷烷基可使使溶质的的保留值值增大，并并常常可可改善分分离的选选择性；但短链链烷基键键合相具具有较高高的覆盖盖度，分分离极性性化合物物时可得得到对称称性较好好的色谱谱峰。苯苯基键合合相与短短链烷基基键合相相的性质质相似。另外C188柱稳定定性较高高，这是是由于长长的烷基基链保护护了硅胶胶基质的的缘故，但但C188基团空空间体积积较大，使使有效孔孔径变小小，分离离大分子子化合物物时柱效效较低。C固定相相的选择择分离中等极极性和极极性较强强的化合合物可选选择极性性键合相相。氰基基键合相相对双键键异构体体或含双双键数不不等的环环状化合合物的分分离有较较好的选选择性。氨氨基键合合相具

25、有有较强的的氢键结结合能力力，对某某些多官官能团化化合物如如甾体、强强心甙等等有较好好的分离离能力；氨基键键合相上上的氨基基能与糖糖类分子子中的羟羟基产生生选择性性相互作作用，故故被广泛泛用于糖糖类的分分析，但但它不能能用于分分离羰基基化合物物，如甾甾酮、还还原糖等等，因为为它们之之间会发发生反应应生成SSchiiff 碱。二二醇基键键合相适适用于分分离有机机酸、甾甾体和蛋蛋白质。分离非极性性和极性性较弱的的化合物物可选择择非极性性键合相相。利用用特殊的的反相色色谱技术术，例如如反相离离子抑制制技术和和反相离离子对色色谱法等等，非极极性键合合相也可可用于分分离离子子型或可可离子化化的化合合物。

26、OODS(Octaadeccyl sillanee)是应应用最为为广泛的的非极性性键合相相，它对对各种类类型的化化合物都都有很强强的适应应能力。短短链烷基基键合相相能用于于极性化化合物的的分离，而而苯基键键合相适适用于分分离芳香香化合物物。另外，美国国药典对对色谱法法规定较较严，它它规定了了柱的长长度，填填料的种种类和粒粒度，填填料分类类也较详详细，这这样使色色谱图易易于重现现；而中中国药典典仅规定定填料种种类，未未规定柱柱的长度度和粒度度，这使使检验人人员难于于重现实实验，在在某些情情况下还还浪费时时间和试试剂。（3）、流流动相A流动相相的性质质要求一个理想的的液相色色谱流动动相溶剂剂应具有

27、有低粘度度、与检检测器兼兼容性好好、易于于得到纯纯品和低低毒性等等特征。选好填料（固固定相）后后，强溶溶剂使溶溶质在填填料表面面的吸附附减少，相相应的容容量因子子k降低低；而较较弱的溶溶剂使溶溶质在填填料表面面吸附增增加，相相应的容容量因子子k升高高。因此此，k值值是流动动相组成成的函数数。塔板板数N一一般与流流动相的的粘度成成反比。所所以选择择流动相相时应考考虑以下下几个方方面：流动相应应不改变变填料的的任何性性质。低低交联度度的离子子交换树树脂和排排阻色谱谱填料有有时遇到到某些有有机相会会溶胀或或收缩，从从而改变变色谱柱柱填床的的性质。碱碱性流动动相不能能用于硅硅胶柱系系统。酸酸性流动动相

28、不能能用于氧氧化铝、氧氧化镁等等吸附剂剂的柱系系统。纯度。色色谱柱的的寿命与与大量流流动相通通过有关关，特别别是当溶溶剂所含含杂质在在柱上积积累时。必须与检检测器匹匹配。使使用UVV检测器器时，所所用流动动相在检检测波长长下应没没有吸收收，或吸吸收很小小。当使使用示差差折光检检测器时时，应选选择折光光系数与与样品差差别较大大的溶剂剂作流动动相，以以提高灵灵敏度。粘度要低低（应2cpp）。高高粘度溶溶剂会影影响溶质质的扩散散、传质质，降低低柱效，还还会使柱柱压降增增加，使使分离时时间延长长。最好好选择沸沸点在1100以下的的流动相相。对样品的的溶解度度要适宜宜。如果果溶解度度欠佳，样样品会在在柱

29、头沉沉淀，不不但影响响了纯化化分离，且且会使柱柱子恶化化。样品易于于回收。应应选用挥挥发性溶溶剂。B流动相相的选择择在化学键合合相色谱谱法中，溶溶剂的洗洗脱能力力直接与与它的极极性相关关。在正正相色谱谱中，溶溶剂的强强度随极极性的增增强而增增加；在在反相色色谱中，溶溶剂的强强度随极极性的增增强而减减弱。正相色谱的的流动相相通常采采用烷烃烃加适量量极性调调整剂。反相色谱的的流动相相通常以以水作基基础溶剂剂，再加加入一定定量的能能与水互互溶的极极性调整整剂，如如甲醇、乙乙腈、四四氢呋喃喃等。极极性调整整剂的性性质及其其所占比比例对溶溶质的保保留值和和分离选选择性有有显著影影响。一一般情况况下，甲甲

30、醇-水水系统已已能满足足多数样样品的分分离要求求，且流流动相粘粘度小、价价格低，是是反相色色谱最常常用的流流动相。但但Snyyderr则推荐荐采用乙乙腈-水水系统做做初始实实验，因因为与甲甲醇相比比，乙腈腈的溶剂剂强度较较高且粘粘度较小小，并可可满足在在紫外11852055nm处处检测的的要求，因因此，综综合来看看，乙腈腈-水系系统要优优于甲醇醇-水系系统。在分离含极极性差别别较大的的多组分分样品时时，为了了使各组组分均有有合适的的k值并并分离良良好，也也需采用用梯度洗洗脱技术术。参考资料：乙腈的毒性性是甲醇醇的5倍倍，是乙乙醇的225倍。价价格是甲甲醇的667倍倍。反相色谱中中，如果果要在相

31、相同的时时间内分分离同一一组样品品，甲醇醇/水作作为冲洗洗剂时其其冲洗强强度配比比与乙腈腈/水或或四氢呋呋喃/水水的冲洗洗强度配配比有如如下关系系：C乙腈00.322C 22甲醇0.557C甲甲醇C四氢呋喃喃0.666C甲甲醇C为不同有有机溶剂剂与水混混合的体体积百分分含量。1100%甲醇的的冲洗强强度相当当于899%的乙乙腈/水水或666%的四四氢呋喃喃/水的的冲洗强强度。C流动相相的pHH值采用反相色色谱法分分离弱酸酸（3pKaa7）或或弱碱（77pKKa88）样品品时，通通过调节节流动相相的pHH值，以以抑制样样品组分分的解离离，增加加组分在在固定相相上的保保留，并并改善峰峰形的技技术称

32、为为反相离离子抑制制技术。对对于弱酸酸，流动动相的ppH值越越小，组组分的kk值越大大，当ppH值远远远小于于弱酸的的pKaa值时，弱弱酸主要要以分子子形式存存在；对对弱碱，情情况相反反。分析析弱酸样样品时，通通常在流流动相中中加入少少量弱酸酸，常用用50mmmoll/L磷磷酸盐缓缓冲液和和1%醋醋酸溶液液；分析析弱碱样样品时，通通常在流流动相中中加入少少量弱碱碱，常用用50mmmoll/L磷磷酸盐缓缓冲液和和30mmmoll/L三三乙胺溶溶液。注：流动相相中加入入有机胺胺可以减减弱碱性性溶质与与残余硅硅醇基的的强相互互作用，减减轻或消消除峰拖拖尾现象象。所以以在这种种情况下下有机胺胺（如三三

33、乙胺）又又称为减减尾剂或或除尾剂剂。D流动相相的脱气气HPLC所所用流动动相必须须预先脱脱气，否否则容易易在系统统内逸出出气泡，影影响泵的的工作。气气泡还会会影响柱柱的分离离效率，影影响检测测器的灵灵敏度、基基线稳定定性，甚甚至使无无法检测测。（噪噪声增大大，基线线不稳，突突然跳动动）。此此外，溶溶解在流流动相中中的氧还还可能与与样品、流流动相甚甚至固定定相（如如烷基胺胺）反应应。溶解解气体还还会引起起溶剂ppH的变变化，对对分离或或分析结结果带来来误差。溶解氧能与与某些溶溶剂（如如甲醇、四四氢呋喃喃）形成成有紫外外吸收的的络合物物，此络络合物会会提高背背景吸收收（特别别是在2260nnm以下

34、下），并并导致检检测灵敏敏度的轻轻微降低低，但更更重要的的是，会会在梯度度淋洗时时造成基基线漂移移或形成成鬼峰（假假峰）。在在荧光检检测中，溶溶解氧在在一定条条件下还还会引起起淬灭现现象，特特别是对对芳香烃烃、脂肪肪醛、酮酮等。在在某些情情况下，荧荧光响应应可降低低达955%。在在电化学学检测中中（特别别是还原原电化学学法），氧氧的影响响更大。除去流动相相中的溶溶解氧将将大大提提高UVV检测器器的性能能，也将将改善在在一些荧荧光检测测应用中中的灵敏敏度。常常用的脱脱气方法法有：加加热煮沸沸、抽真真空、超超声、吹吹氦等。对对混合溶溶剂，若若采用抽抽气或煮煮沸法，则则需要考考虑低沸沸点溶剂剂挥发造

35、造成的组组成变化化。超声声脱气比比较好，110220分钟钟的超声声处理对对许多有有机溶剂剂或有机机溶剂/水混合合液的脱脱气是足足够了（一一般5000mll溶液需需超声220330miin方可可），此此法不影影响溶剂剂组成。超超声时应应注意避避免溶剂剂瓶与超超声槽底底部或壁壁接触，以以免玻璃璃瓶破裂裂，容器器内液面面不要高高出水面面太多。离线（系统统外）脱脱气法不不能维持持溶剂的的脱气状状态，在在你停止止脱气后后，气体体立即开开始回到到溶剂中中。在114小小时内，溶溶剂又将将被环境境气体所所饱和。在线（系统统内）脱脱气法无无此缺点点。最常常用的在在线脱气气法为鼓鼓泡，即即在色谱谱操作前前和进行行

36、时，将将惰性气气体喷入入溶剂中中。严格格来说，此此方法不不能将溶溶剂脱气气，它只只是用一一种低溶溶解度的的惰性气气体（通通常是氦氦）将空空气替换换出来。此此外还有有在线脱脱气机。一般说来有有机溶剂剂中的气气体易脱脱除，而而水溶液液中的气气体较顽顽固。在在溶液中中吹氦是是相当有有效的脱脱气方法法，这种种连续脱脱气法在在电化学学检测时时经常使使用。但但氦气昂昂贵，难难于普及及。E流动相相的滤过过所有溶剂使使用前都都必须经经0.445&mmicrro;mm（或00.222&miicroo;m）滤滤过，以以除去杂杂质微粒粒，色谱谱纯试剂剂也不例例外（除除非在标标签上标标明“已已滤过”）。用滤膜过滤滤时

37、，特特别要注注意分清清有机相相（脂溶溶性）滤滤膜和水水相（水水溶性）滤滤膜。有有机相滤滤膜一般般用于过过滤有机机溶剂，过过滤水溶溶液时流流速低或或滤不动动。水相相滤膜只只能用于于过滤水水溶液，严严禁用于于有机溶溶剂，否否则滤膜膜会被溶溶解！溶溶有滤膜膜的溶剂剂不得用用于HPPLC。对对于混合合流动相相，可在在混合前前分别滤滤过，如如需混合合后滤过过，首选选有机相相滤膜。现现在已有有混合型型滤膜出出售。F流动相相的贮存存流动相一般般贮存于于玻璃、聚聚四氟乙乙烯或不不锈钢容容器内，不不能贮存存在塑料料容器中中。因许许多有机机溶剂如如甲醇、乙乙酸等可可浸出塑塑料表面面的增塑塑剂，导导致溶剂剂受污染染

38、。这种种被污染染的溶剂剂如用于于HPLLC系统统，可能能造成柱柱效降低低。贮存存容器一一定要盖盖严，防防止溶剂剂挥发引引起组成成变化，也也防止氧氧和二氧氧化碳溶溶入流动动相。磷酸盐、乙乙酸盐缓缓冲液很很易长霉霉，应尽尽量新鲜鲜配制使使用，不不要贮存存。如确确需贮存存，可在在冰箱内内冷藏，并并在3天天内使用用，用前前应重新新滤过。容容器应定定期清洗洗，特别别是盛水水、缓冲冲液和混混合溶液液的瓶子子，以除除去底部部的杂质质沉淀和和可能生生长的微微生物。因因甲醇有有防腐作作用，所所以盛甲甲醇的瓶瓶子无此此现象。G卤代有有机溶剂剂应特别别注意的的问题卤代溶剂可可能含有有微量的的酸性杂杂质，能能与HPP

39、LC系系统中的的不锈钢钢反应。卤卤代溶剂剂与水的的混合物物比较容容易分解解，不能能存放太太久。卤卤代溶剂剂（如CCCl44、CHHCl33等）与与各种醚醚类（如如乙醚、二二异丙醚醚、四氢氢呋喃等等）混合合后，可可能会反反应生成成一些对对不锈钢钢有较大大腐蚀性性的产物物，这种种混合流流动相应应尽量不不采用，或或新鲜配配制。此此外，卤卤代溶剂剂（如CCH2CCl2）与与一些反反应性有有机溶剂剂（如乙乙腈）混混合静置置时，还还会产生生结晶。总总之，卤卤代溶剂剂最好新新鲜配制制使用。如如果是和和干燥的的饱和烷烷烃混合合，则不不会产生生类似问问题。HHPLLC用水水HPLC应应用中要要求超纯纯水，如如检

40、测器器基线的的校正和和反相柱柱的洗脱脱。进行HPLLC、GGC、电电泳和荧荧光分析析，或在在涉及组组织培养养时，没没有有机机物污染染是非常常重要的的。测高高锰酸钾钾颜色保保留时间间的定性性方法反反应慢，对对很低水水平的有有机物（对对HPLLC可能能还是太太高了）不不够灵敏敏，特别别是不能能定量。总总有机碳碳(TOOC)分分析仪（把把有机物物氧化成成CO22，测游游离的CCO2）常常用于II类（NNCCLLS）水水中低浓浓度有机机物的测测定。I类水标准准：NCCLSSASTM电阻率，MMccm，225，最最小10.018.0硅酸盐，mmg/LL，最大大0.050.0033微粒，&mmicrro;

41、mm滤器0.220.2微生物，CCFU/ml10分三档美国药典224版（220000年）要要求TOOC00.5 mg/L（用用标准蔗蔗糖溶液液1.119 mmg/LL），电电导率在在室温ppH 66时22.4 &miicroo;S/cm（即即0.42 Mcm）。HHPLCC级水增增加吸收收特性：在1ccm池中中，用超超纯水作作空白，在在1900nm、2200nnm和22504000nm的的吸收度度分别不不得过00.011、0.01和和0.005。增增加不挥挥发物，3pppm（中中国药典典纯水10pppm）。二、LabbAllliannce 液相色色谱系统统组成泵进样器色谱柱（柱柱温箱）检测器工

42、作站柱后衍生装装置调节流速开泵/关泵模式切换出口单向阀入口单向阀泵头旁通阀出口过滤器Seriees 泵前前视图 手动进样阀阀AS10000/330000自动进进样器色谱柱201型检检测器LabAllliaancee 工作作站界面面三、LabbAllliannce液液相色谱谱系统常常见使用用故障及及维护1、泵的使使用和维维护注意意事项为了延长泵泵的使用用寿命和和维持其其输液的的稳定性性，必须须按照下下列注意意事项进进行操作作：防止任何何固体微微粒进入入泵体，因因为尘埃埃或其它它任何杂杂质微粒粒都会磨磨损柱塞塞、密封封圈、缸体体和单向向阀，因因此应预预先除去去流动相相中的任任何固体体微粒。流流动相

43、最最好用微微孔滤膜膜（0.2或0.445umm）过滤。泵泵的入口口都应连连接0.2umm过滤头头（或片片）。泵泵的滤头头应经常常清洗或或更换。流动相不不应含有有任何腐腐蚀性物物质，含含有缓冲冲液的流流动相不不应保留留在泵内内，尤其其是在停停泵过夜夜或更长长时间的的情况下下。如果果将含缓缓冲液的的流动相相留在泵泵内，由由于蒸发发或泄漏漏，甚至至只是由由于溶液液的静置置，就可可能析出出盐的微微细晶体体，这些些晶体将将和上述述固体微微粒一样样损坏密密封环和和柱塞等等。因此此，必须须泵入纯纯水将泵泵充分清清洗后，再再换成适适合于色色谱柱保保存和有有利于泵泵维护的的溶剂（对对于反相相键合硅硅胶固定定相，

44、可可以是甲甲醇或甲甲醇-水水）。泵工作时时要留心心防止溶溶剂瓶内内的流动动相被用用完，否否则空泵泵运转也也会磨损损柱塞、缸缸体或密密封环，最最终产生生漏液。输液泵的的工作压压力决不不要超过过规定的的最高压压力，否否则会使使高压密密封环变变形，产产生漏液液。流动相应应该先脱脱气，以以免在泵泵内产生生气泡，影影响流量量的稳定定性，如如果有大大量气泡泡，泵就就无法正正常工作作。如果输液泵泵产生故故障，须须查明原原因，采采取相应应措施排排除故障障：没有流动相相流出，又又无压力力指示。原原因可能能是泵内内有大量量气体，这这时可打打开排气气阀，用用一个550mll针筒在在泵出口口处抽出出气体。另另一个可可

45、能原因因是密封封环磨损损，需更更换。压力和流流量不稳稳。原因因可能是是气泡，需需要排除除；或者者是单向向阀内有有异物，可可卸下单单向阀，浸浸入甲醇醇水溶液液中超声声清洗。有有时可能能是流动动相滤头内有气气泡，或或被盐的的微细晶晶粒或滋滋生的微微生物部部分堵塞塞，这时时，可卸卸下滤头浸入甲醇醇水溶液液内超声声除气泡泡。压力过高高的原因因是管路路被堵塞塞，需要要清除和和清洗。压压力降低低的原因因则可能能是管路路有泄漏漏。检查查堵塞或或泄漏时时应逐段段进行。2、手动进进样阀和和自动进进样器。现在大都使使用六通通进样阀阀或自动动进样器器。进样样装置要要求：密密封性好好，死体体积小，重重复性好好，保证证

46、中心进进样，进进样时对对色谱系系统的压压力、流流量影响响小。手动进样阀阀和自动动进样器器的维护护注意事事项包括括：样样品溶液液进样前前必须用用0.445umm滤膜过过滤，以以减少微微粒对进进样阀的的磨损。转动阀阀芯时不不能太慢慢，更不不能停留留在中间间位置，否否则流动动相受阻阻，使泵泵内压力力剧增，甚甚至超过过泵的最最大压力力；再转转到进样样位时，过过高的压压力将使使柱头损损坏。为防止止缓冲盐盐和样品品残留在在进样阀阀中，每每次分析析结束后后应冲洗洗进样阀阀。通常常可用水水冲洗，或或先用能能溶解样样品的溶溶剂冲洗洗，再用用水冲洗洗。3、色谱柱柱的维护护色谱是一种种分离分分析手段段，分离离是核心

47、心，因此此担负分分离作用用的色谱谱柱是色色谱系统统的心脏脏。对色色谱柱的的要求是是柱效高高、选择择性好，分分析速度度快等。市市售的用用于HPPLC的的各种微微粒填料料如多孔孔硅胶以以及以硅硅胶为基基质的键键合相、氧氧化铝、有有机聚合合物微球球（包括括离子交交换树脂脂）、多多孔碳等等，其粒粒度一般般为3,5,77,100m等等，柱效效理论值值可达55166万/米米。对于于一般的的分析只只需50000塔塔板数的的柱效；对于同同系物分分析，只只要5000即可可；对于于较难分分离物质质对则可可采用高高达2万万的柱子子，因此此一般110330cmm左右的的柱长就就能满足足复杂混混合物分分析的需需要。柱效受柱内内外因素素影响，为为使色谱谱柱达到到最佳效效率，除除柱外死死体积要要小外，