纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析-硅胶包裹纳米铽荧23997.docx

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1、纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析作 者：叶志志强, 谭谭明乾 指导教师：袁景利, 王桂兰兰一室1011组摘要：在油油包水型的的微乳液中中，合成了了三种形状状规则、尺尺寸均匀的的硅胶基质质纳米稀土土荧光材料料。与前驱驱体相比，新新型荧光纳纳米微粒具具有更强的的荧光强度度和抗光漂漂白性能。将将纳米微粒粒表面修饰饰并标记链链酶亲和素素SA（或或抗体）后后应用于时时间分辨荧荧光免疫分分析，建立立了人血清清中前列腺腺特异抗原原（PSAA）、甲胎胎蛋白（AAFP）和和乙肝表面面抗原（HHBsAgg）的高灵灵敏度检测测方法。关键词：荧荧光纳米微微粒；稀土土配合物；生物标记记；时间分分辨荧光免免疫分析。

2、 时间分辨辨荧光生物物分析技术术是基于稀稀土荧光化化合物特殊殊荧光性质质而建立起起来的一种种高灵敏度度分析方法法，现已广泛泛应用于免免疫测定、DDNA杂交交测定和荧荧光显微镜镜成像测定定等生化检检测的领域域1。该技术术利用具有有荧光寿命命长、Sttokess 位移大大和半峰宽宽窄等特点点的稀土荧荧光配合物物作为标记记物，不仅仅适用于多多标记分析析，而且可可完全消除除各种散乱乱光和短寿寿命荧光对对测定的干干扰，从而而实现超高高灵敏度分分析。基于于这些优点点，时间分分辨荧光生生物分析技技术在近20年来取取得了重大大的发展，在临床医学与与生命科学学的实践与与研究中发发挥着重要要的作用。近年来，纳纳米

3、尺度发发光材料在在生化分析析领域中的的作用受到到了越来越越多的关注注。量子点点2、胶体金金3、核壳型型荧光探针针4等纳米颗颗粒作为标标记物已经经开始应用用于生化检检测领域。但是由于纳米尺度的发光粒子的瑞利、拉曼和丁达尔散射产生的背景光对测定的严重干扰,影响了检测结果的灵敏度、精密度和准确度，无法实现高灵敏的定量分析。在我们的研研究中，综综合稀土荧荧光标记物物和纳米技技术的优势势，合成了了三种具有有长寿命荧荧光的纳米米稀土荧光光微粒5-7。新型型纳米荧光光微粒用于于时间分辨辨荧光生物物分子分析析，不仅可可从根本上上彻底消除除各种散乱乱光和短寿寿命荧光对对测定的干干扰，提高高分析方法法的灵敏度度,

4、而且由由于荧光配配合物被包包覆在硅胶胶的骨架结结构中,基基本隔绝了了外部环境境对配合物物的影响，极极大地增强强了荧光材材料的光稳稳定性。实验部分1.掺杂型型纳米荧光光微粒的制制备将160mmg N,N,N11,N1-2, 6-bbis(33-amiinomeethyll-1-pyrrazollyl)-phennyl- pyriidineetettrakiis(accetatte)-Tb3+（BPTTA-Tbb3+）溶于于1.1 ml的水水后和2000l的四乙乙氧基硅（TTEOS）搅搅拌下加入入到1000 ml的的圆底烧瓶瓶中，然后后再分别加加入2.337 g Tritton XX-1000、1

5、.887 g 正己醇和和7.255g环己烷烷，制成WW/O型微微乳液，在在剧烈搅拌拌下向其中中加入含有有2.377 g TTritoon X-100、11.87 g正己醇醇、7.225g环己己烷及2000l浓氨水水的另一种种微乳液。室室温搅拌反反应24小小时后，加加入50 ml丙酮酮结束反应应。将反应应液离心后后除去上清清液，沉淀淀部分用乙乙醇和二次次蒸馏水各各洗三次，真真空干燥后后得到白色色硅胶包裹裹BPTAA-Tb33+纳米荧荧光微粒。2.掺杂型型纳米荧光光微粒用于于测定人血血清样品中中的PSAA将含抗人PPSA单克克隆抗体（110 g/mll）的pHH值为9.6的0.1 mool/L的的

6、碳酸钠缓缓冲溶液550 l分注于于96微孔孔板的各孔孔中，4 oC, 224小时包包被后，将将PSA标标准溶液（用用5% BBSA-00.9% NaCll-0.11% NaaN3的pH值值7.8的的0.055 moll/L TTris-HCl溶溶液制备）或或血清样品品45 l注入上上述包被后后的微孔板板中。377 0C，1小小时反应后后，用含有有0.055% Twween 20 的的pH值77.8的00.05 mol/L Trris-HHCl缓冲冲溶液（缓缓冲溶液11）洗两次次，再用ppH值7.8的0.05 mmol/LL Triis-HCCl缓冲溶溶液（缓冲冲溶液2）洗洗一次，然然后加入44

7、5 l生物素素标记的抗抗PSA抗抗体溶液，337 0C，1小小时反应后后，用缓冲冲溶液1洗洗两次，缓缓冲溶液22洗一次，再再加入455 l 纳米米微粒标记记的SA溶溶液，377 0C，1小小时反应后后，用缓冲冲溶液1洗洗4次，然然后进行固固相时间分分辨荧光测测定。 3.共聚合合型纳米荧荧光微粒的的制备将160mmg BPPTA-TTb3+溶于1.1 mll的水后和和200l的TEEOS搅拌拌下加入到到100 ml的圆圆底烧瓶中中，然后再再分别加入入2.377 g TTritoon X-100、11.87 g正辛醇醇及7.225g环己己烷，制成成W/O型型微乳液，在在剧烈搅拌拌下向其中中加入含有

8、有2.377 g TTritoon X-100、11.87 g正辛醇醇、7.225g环己己烷及2000l浓氨水水的另一种种微乳液。室室温搅拌反反应5小时时后，加入入6 l的3-2-(2-amminoeethyllaminno)etthylaaminooproopyl- triimethhoxyssilanne（AEEPS），继继续搅拌119小时后后，加入550 mll丙酮结束束反应。将将反应液离离心后除去去上清液，沉沉淀部分用用乙醇和二二次蒸馏水水分别洗三三次，真空空干燥后得得到白色的的共聚合型型硅胶包裹裹BPTAA-Tb33+纳米荧荧光微粒。4.共聚合合型荧光纳纳米微粒用用于测定人人血清样品

9、品中的AFFP将含抗人AAFP单克克隆抗体（110 g/mll）的pHH值为9.6的0.1 mool/L碳碳酸钠缓冲冲溶液500 l分注于于96微孔孔板的各孔孔中，4 0C, 224小时包包被后将AAFP标准准溶液或血血清样品445 l注入上上述包被后后的微孔板板中，377 0C，1小小时反应后后，用缓冲冲溶液1洗洗两次，缓缓冲溶液22洗一次。加加入45 l纳米荧荧光微粒标标记的抗AAFP多抗抗溶液，337 0C，1小小时反应后后，用缓冲冲溶液1洗洗4次，然然后进行固固相时间分分辨荧光测测定。5. 共价价键合型荧荧光纳米微微粒的制备备将10.44mg氨丙丙基三乙氧氧基硅 (APS，447 mm

10、ol)，7.11mmol4,4-biis(1, 1,1,2,22,3,3-hepttafluuoro-4,66-heexaneedionn-6-yl)-chloorosuulfo-o- teerpheenyl (BHHHCT)及及3.555mmolEuuCl36H2O 加入入30 l环己烷烷中，超声声振荡反应应15分钟钟后，反应应液加入到到含有1.1 mll水，4.74 gg Triiton X-1000、3.64 gg正辛醇及及14.550 g环环己烷的WW/O型微微乳液中，搅搅拌0.55小时后，加加入2000 l的TEEOS和2200 l的浓氨氨水。室温温搅拌反应应24小时时后，加入入40

11、 mml丙酮结结束反应。将将反应液离离心后除去去上清液，沉沉淀部分用用乙醇和二二次蒸馏水水分别洗三三次后悬浮浮于水中备备用。6. 共价价键合型纳纳米微粒用用于人血清清中乙肝表表面抗原（HHBsAgg）测定使用抗HBBsAg单单抗和多抗抗进行测定定，测定步步骤与掺杂杂型纳米荧荧光微粒测测定人血清清中PSAA相同。结果和讨论论 1. 掺杂杂型纳米荧荧光微粒的的制备及时时间分辨荧荧光免疫测测定PSAA掺杂型纳米米荧光微粒粒的制备原原理见图11。在表面面活性剂和和助表面活活性剂的作作用下，含有 TTEOS,BPTAA-Tb33+的水溶溶液在油相相中形成均均匀的小液液室，每一个小小液室相当当于一个微微反

12、应器，TEOSS的水合化化和聚合化化的过程都都被限制在在微反应器器内。微反应器器的体积主主要由水和和表面活性性剂的比值值所决定，而微反应应器的体积积大小又决决定了纳米米颗粒的尺尺寸大小。我们用这这种方法制制备了直径径在42 3 nnm的纳米米颗粒(图图2)，由电镜照照片可以看看出纳米颗颗粒形状规规则、尺寸寸均匀。图1 在微微乳液中制制备纳米微微粒的原理理 图2 硅硅胶包裹BBPTA-Tb3+纳米微粒粒的电镜照照片纳米荧光微微粒表面的的硅胶经过过修饰后可可与生物分分子相连。将将纳米荧光光微粒与SSA共价结结合后，可可用于时间间分辨荧光光免疫测定定。PSAA是前列腺腺癌诊断的的一个重要要指标，现现

13、用于临床床检测的方方法主要有有放射性免免疫法和酶酶联免疫法法，它们的的检测灵敏敏度大约在在100pgg/ml左右。而而最近的研研究表明，如如果方法的的检测灵敏敏度可达到到20 ppg/ml以下，那那么至少可可以提前一一年诊断出出治疗后前前列腺癌患患者是否复复发。所以以发展高灵灵敏度的血血中PSAA的检测方方法显得十十分重要。使使用BPTTA-Tbb3+纳米微微粒标记SSA的时间间分辨荧光光免疫分析析法测定PPSA的工工作曲线如如图3所示示，方法的的最低检测测限为7 pg/mml（用本本底信号标标准偏差的的3倍计算算）。使用用本方法对对24个人人血清样品品的PSAA浓度进行行了测定，并并与临床测

14、测定的结果果进行了比比较，两者者的相关性性见图4。两两种方法对对24个人人血清样品品中PSAA浓度测定定结果的相相关性方程程式为y1.011x0.008，相相关系数为为0.9998，说明明使用纳米米微粒作为为标记物的的测定方法法的结果是是完全可信信的。图3用硅胶胶包裹BPPTA-Tbb3+纳米微粒粒标记SAA 图4 新方法和和临床检测测法用于224个人血血清的时间分辨辨荧光免疫疫测定PSSA的工作作曲线 样品中中PSA浓度度测定的相相关性2. 共聚聚合型纳米米荧光微粒粒的制备及及时间分辨辨荧光免疫疫测定AFFPAEPS和和TEOSS一样，都都可以在氨氨水存在的的条件下发发生水解和和聚合反应应。

15、而且它它具有的活活性基团-NH2在聚合后后会存在于于纳米微粒粒的表面，为为后续标记记生物分子子提供极大大的方便。所所以，在我我们的研究究中利用将将AEPSS和TEOOS共聚合合的方法在在微乳液中中制备出了了表面带有有活性氨基基的功能性性硅胶包裹裹铽配合物物纳米荧光光微粒。其其电镜测定定结果（见见图5）显显示这种纳纳米微粒不不仅形状规规则，而且且粒径分布布范围窄(453nm)。聚合后存存在于纳米米微粒表面面的-NHH2基团使得得生物标记记更加容易易。通过简简单的方法法将纳米微微粒与抗AAFP抗体体结合后，建建立了一种种以纳米微微粒为标记记物的时间间分辨荧光光免疫分析析方法用于于人血清中中AFP的

16、的测定，其其工作曲线线见图6。本本方法的最最低检测限限为0.11 ng/ml，相相对标准偏偏差（CVV%）小于99.0%，血清添添加回收率率在84.0-98.00%范围，说说明该法具具有较高的的精密度和和准确度，可可以用于人人血清样品品的测定。图5功能性性铽纳米荧荧光微粒的的电镜照片片 图6 测定AFFP的工作作曲线3. 共价价键合型纳纳米荧光微微粒的制备备及时间分分辨荧光免免疫测定HHBsAggBHHCTT-Eu3+是一种强强荧光性铕铕配合物，只只是它的水水溶性较差差，所以在在用掺杂型型方法制备备纳米微粒粒时只有少少量的配合合物被包进进纳米微粒粒中，导致致制得的纳纳米微粒荧荧光很弱。而而采用

17、共价价键合的方方法则不但但可以增加加每个纳米米微粒中所所包含BHHHCT-Eu3+分子的的个数，从从而使得纳纳米微粒的的荧光强度度得到大幅幅度提高，而而且一次性性地在纳米米微粒表面面导入了自自由氨基。电电镜测定结结果（见图图7）显示示该法制得得的纳米微微粒大小均均匀，粒径径为373nm。图7 共价价键合型纳纳米微粒的的电镜照片片 图8. 纳米微粒粒标记SAA（a）和和BHHCCT-Euu3+标记SSA-BSSA（b）测定人血清中HBsAg的工作曲线将纳米微粒粒与SA结结合后，用用于时间分分辨荧光免免疫测定人人血清中的的HBsAAg，其工工作曲线见见图8a。本本法的最低低检测限为为23pg/mm

18、l，证明明其灵敏度度要高于直直接使用BBHHCTT-Eu3+为标记记物的测定定方法（图图8b，最最低检测限限为84pg/ml）。该该法用于人人血清样品品测定的相相对标准偏偏差小于110%，添加回收收率在800-110%范围，说明明该法具有有较高的精精密度和准准确度。结论本研究利用用微乳液法法制备了三三种硅胶基基质纳米稀稀土荧光微微粒，制备备方法简单单且重复性性好。所制备的的纳米微粒粒形状规则则、尺寸均均匀，在对对其进行表表面修饰后后用于生物物标记及时时间分辨荧荧光免疫测测定，建立立了人血清清中PSAA、AFP及HBsAgg的高灵敏敏度定量测测定方法。由由于新型稀稀土荧光微微粒具有强强荧光、强强

19、抗光漂白白性能及易易用于生物物标记等优优点，预计计其在荧光光显微镜生生物成像测测定及生物物芯片等领领域也有重重要的应用用前景，这这部分的研研究工作将将在近期展展开。注：本文系系由中国科科学院领域域前沿项目目大连化化物所青年年基金资助助参考文献：1. Soinii, E.; Lvgreen, TT.CRCC Criit. RRev. Anall. Chhem. 19877, 18, 1105-1154.2. Tayloor, JJ. R.;Fanng, MM. M.;Nie, S. Anall. Chhem. 20000. 72. 11979-19866.3. Schrooedteer, AA.

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22、n Waang101 ggroupp, Deeparttmentt of Anallyticcal CChemiistryyAbstrract: Thrree kkindss of siliica-bbasedd fluuoresscentt lannthannide nanoopartticlees haavingg reggularr shaape aand uunifoorm ssize havee beeen prreparred aand ccharaacterrizedd. Thhe noovel nanoopartticlees arre sttronggly ffluorres

23、ceent aand hhighlly phhotosstablle coomparred wwith lantthaniide cchelaates. Thee nannoparrticlles wwere usedd forr strreptaavidiin orr anttiboddy laabeliing. Ultrrasennsitiive ttime-resoolvedd fluuoroiimmunnoasssays for prosstatee speecifiic anntigeen (PPSA), a-feetoprroteiin (AAFP) and hepaatitiis B surfface antiigen(HBsAAg) in humaan seerum sampples weree devvelopped bby ussing the nanoopartticlees ass thee fluuoresscencce prrobess.Keywoords: Fluuoresscentt nannoparrticlle, LLanthhanidde chhelatte, BBiolaabeliing, Timee-ressolveed flluorooimmuunoasssay.8