研究生植物组织培养39041.docx

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1、第一章 植物组织培养的应用植物组织培培养可应用用于以下几几个方面 ：1挽救濒濒于灭绝的的植物；2快速繁繁殖稀有植植物或有较较大经济价价值的植物物；3、生产脱脱毒苗；4、利用组组织培养的的材料作为为植物生物物反应器；多种中草草药资源匮匮乏，产量量不足，甚甚至濒于灭灭绝。利用用组织和细细胞培养的的方法在实实验室内生生产；可不不再依附于于自然环境境，不仅可可以解决现现有困难，而而且可以通通过筛选高高产有效成成分的细胞胞系，来提提高其药用用价值。如如用培养的的人参悬浮浮细胞来生生产人参皂皂苷。利用用培养的植植物细胞和和组织作为为生物反应应器，也可可生产某些些蛋白质、氨氨基酸、抗抗生素、疫疫苗等。5、组

2、织培培养结合超超低温可经经济有效地地保存植物物种质资源源 6、组织培培养是转基基因技术不不可或缺的的组成部分分；7、作物育育种（1）单倍倍体育种：采用花药药培养可缩缩短杂合体体纯化所需需的时间，节节省土地，假假定两个杂杂交亲本在在n个独立立遗传的位位点上彼此此不同，通通过花药培培养，在理理论上只要要有2n个个F1代花花粉植株，就就有可能得得到一个所所需要的基基因组合，而而传统育种种方法，则则至少要有有4n个FF1植株才才能得到一一个所需要要的基因组组合。（2）在远远缘杂交中中，通过离离体授粉或或原生质体体融合有可可能克服受受精前障碍碍，通过幼幼龄合子胚胚培养可以以克服受精精后障碍，通通过体细胞

3、胞融合还有有可能制造造出细胞质质杂种。（3）通过过细胞培养养，在细胞胞水平上进进行突变体体选择，可可在一定程程度上使高高等植物的的育种程序序微生物化化，从而提提高选择效效率，节省省时间和土土地面积。 （4）体细细胞无性系系变异是除除有性杂交交和理化诱诱变之外的的第三个变变异来源。 8、用人工工种皮包被被体细胞胚胚制造人工工种子，为为稀有和珍珍贵物种的的繁殖提供供了一种高高效的手段段。9、用于遗遗传学、分分子生物学学、细胞生生物学、胚胚胎学、基基因工程、植植物发育等等的基础研研究。10、试管管花第二章 植植物组织培培养的发展展简史一、 探索索阶段(220世纪初初至20世世纪30年年代中) 20世

4、纪初初，德国植植物生理学学家Habberlaandt提提出了高等等植物的器器官和组织织可不断分分割，直至至分到单个个细胞的观观点，并设设想离体细细胞具有再再生完整植植株的潜力力。Habberlaandt首首次进行了了离体细胞胞培养的实实验，在11902年年发表的“植物离体体细胞培养养实验”报告中，提提出了胚囊囊液在组织织培养中的的作用和看看护培养法法等科学的的预见。 1904年年Hannnig在无无机盐和蔗蔗糖溶液中中培养了萝萝卜和辣根根菜的胚，并并使这些胚胚在离体条条件下长到到成熟。Laibaach(11925，11929)把由亚麻麻种间杂交交形成的不不能成活的的胚剖出，在在人工培养养基上培

5、养养至成熟，从从而证明了了胚培养在在植物远缘缘杂交中利利用的可能能性；1922年年，美国的的Robbbins和和德国的KKottee分别报道道培养离体体根尖获得得某些成功功。1934年年，Whiite成功功离体培养养了番茄的的根尖。 二、 奠基基阶段(220世纪330年代中中至50年年代末) 1、Whiite（11934年年）在番茄茄根培养实实验中使用用的培养基基包含无机机盐、酵母母浸出液和和蔗糖。他他后来(11937)用3种BB族维生素素（吡哆醇醇、硫胺素素和烟酸），取取代酵母浸浸出液获得得成功。认认识了B族族维生素对对植物生长长的重要意意义。2、Gauutherret(11934)在山毛柳

6、柳等形成层层组织的培培养中发现现，虽然在在含有葡萄萄糖和盐酸酸半胱氨酸酸的Knoop溶液中中，这些组组织可以不不断增殖几几个月，但但只有在培培养基中加加入了B族族维生素和和IAA以以后，形成成层组织的的生长才能能显著增加加。19339年Gaautheeret连连续培养胡胡萝卜根形形成层获得得首次成功功。同年，WWhitee由烟草种种间杂种的的瘤组织，NNobeccourtt由胡萝卜卜，也建立立了类似的的连续生长长的组织培培养物。因因此，Gaautheeret、WWhitee和Nobbecouurt一起起被誉为植植物组织培培养的奠基基人。3、Skooog(11944)以及Skkoog和和崔澂等(

7、19511)发现，腺腺嘌呤或腺腺苷不但可可以促进愈愈伤组织的的生长，而而且还能解解除培养基基中生长素素(IAAA)对芽形形成的抑制制作用，诱诱导芽的形形成，从而而确定了腺腺嘌呤与生生长素的比比例是控制制芽和根形形成的主要要条件之一一。 4、19552年，MMorell和Marrtin首首次证实，通通过茎尖离离体培养，可可以由已受受病毒侵染染的大丽花花中获得无无病毒植株株。 5、19553-19954年，MMuir进进行单细胞胞培养获得得初步成功功。把万寿寿菊和烟草草的愈伤组组织转移到到液体培养养基中，放放在摇床上上振荡，形形成了由单单细胞和细细胞聚集体体组成的细细胞悬浮液液。Muiir等还用用

8、机械方法法由细胞悬悬浮液和容容易散碎的的愈伤组织织中分离得得到单细胞胞，把它们们置于一张张铺在愈伤伤组织上面面的滤纸上上培养，使使细胞发生生了分裂。 6、19555年，MMilleer等由鲱鲱鱼精子DDNA中分分离出一种种首次为人人所知的细细胞分裂素素，并把它它定名为激激动素(kkinettin)。7、19557年，SSkoogg和Milller提提出了植物物激素控制制器官形成成的概念，指指出在烟草草髓组织培培养中，根根和茎的分分化是生长长素对细胞胞分裂素比比率的函数数。8、19558年，SStewaard等以以胡萝卜为为材料，首首次通过实实验证实了了Habeerlanndt关于于细胞全能能性

9、的设想想，成为了了植物组织织培养研究究历史中的的一个里程程碑。9、19558-19959年，RReineert和SStewaard分别别报道，在在胡萝卜愈愈伤组织培培养中形成成了体细胞胞胚。 三、迅速发发展阶段(20世纪纪60年代代至现在) 1、基础研研究： 11965年年，Vassil和HHildeebranndt用一一种化学成成分确定的的培养基，由由分隔培养养的烟草单单细胞获得得了完整的的再生植株株，进一步步证实了植植物细胞的的全能性 。2、原生质质体培养取取得重大突突破： 1960年年Cockking等等用真菌纤纤维素酶分分离植物原原生质体获获得成功。1971年年，Takkebe等等首次

10、获得得了烟草原原生质体再再生植株。1972年年，Carrlsonn等通过两两个烟草物物种之间原原生质体的的融合，获获得了第一一个体细胞胞杂种。3、花药培培养取得显显著成绩： 1964年年，Guhha和Maaheshhwarii报道，在在毛曼陀罗罗中通过离离体花药培培养由小孢孢子直接发发育成胚。 1967年年，Bouurginn和Nittsch通通过花药培培养获得了了完整的烟烟草植株。 4、微繁技技术得到广广泛应用 1960年年，Morrel建立立了一个离离体无性繁繁殖兰花的的方法，繁繁殖系数极极高。由于于这一方法法有巨大的的实用价值值，很快被被兰花生产产者所采用用，迅速建建立起“兰花工业业”

11、。第三章 植植物组织培培养有关的的基本概念念一、植物细细胞全能性性(tottipottencyy) 细胞全能性性:指一个个活的植物物细胞，只只要有完整整的膜系统统和细胞核核，它就会会有一整套套发育成一一个完整植植株的遗传传基础，在在一个适当当的条件下下可以通过过分裂、分分化再生成成一个完整整植株。从理论上讲讲，只要是是一个活的的细胞，都都有再生出出一个完整整植株的潜潜力，但实实际情况并并非如此简简单。就目目前所知，细细胞的再生生潜力与其其分化程度度呈负相关关，就是说说细胞分化化程度越高高其再生能能力越低，所所以应尽量量选取幼嫩嫩的植物组组织作为培培养的实验验材料。 二、细胞分分化、脱分分化与再

12、分分化 细胞分化分生性性细胞在形形态结构和和功能上发发生永久性性(不可逆逆转性)适适度变化的的过程。脱分化由失去分分裂能力的的细胞回复复到分生性性状态并进进行分裂，形形成无分化化的细胞团团（即愈伤伤组织）的的过程。 再分化由无分化化的愈伤组组织细胞再再转变成为为具有一定定结构，执执行一定生生理功能的的细胞团和和组织，构构成一个完完整的植物物体或植物物器官的过过程。 三、器官发发生 器官发生由愈伤伤组织的部部分细胞先先分化产生生芽(或根根)，再在在另一种培培养基上产产生根(或或芽)，形形成一个完完整植株。第四章 植物组织织培养所需需的基本设设备与条件件一个理想的的植物组织织培养室应应包括：11、

13、化学药药品室；22、培养基基配制室；3、灭菌菌室；4、接接种室；55、培养室室；6、培培养物的检检测和观察察记录室。 一、化学药药品室 应配置几个个药品橱、实实验台、万万分之一和和百分之一一的电子天天平。室内内还应放一一台大容量量的冰箱，用用来分门别别类地保存存激素、抗抗生素和各各种需低温温保存的物物品。组织培养所所需主要药药品的存放放要求如下下： 1、可室温温存放的药药品：无机机物、蔗糖糖、 盐酸酸、氢氧化化钠，955酒精，琼琼脂。 2、宜于零零上低温存存放的化学学药品: 有机机物、激素素3、应当在在一20下保存的的药品： 液体体抗生素等等。 二、培养基基配制室 需要大于440m2的的一个房

14、间间或更大些些，为了方方便起见可可将房间分分为两个区区:一是玻璃器器皿的清洗洗、消毒、干干燥区：二是培养基基配制区：应有大型型实验台若若干个，还还应配备常常温冰箱一一台，电炉炉(10000W，22000WW)，微波波炉，放置置移液管、微微量移液器器的架子，酸酸度计等。 三、灭 菌 室室 灭菌室面积积可小一些些，其内除除放灭菌锅锅外，最好好还有临时时存放培养养基、培养养器皿的架架子，也应应有自来水水装置。灭灭菌室可根根据灭菌锅锅的多少，工工作量大小小来确定面面积，要求求房间能有有较好的通通风散热条条件，且要要配备专门门的电源线线路，因为为电热灭菌菌锅的耗电电量很大。 四、接 种 室室 接种室是对

15、对培养的植植物材料进进行无菌操操作的地方方，应有超超净工作台台、放置培培养容器的的架子等。整整个房间最最好设有缓缓冲间和双双层门窗，以以防灰尘和和微生物。房房间内最好好装有紫外外灯或经常常喷洒杀菌菌剂，以抑抑制过多微微生物生长长。工作人人员在进入入接种室之之前在缓冲冲间内更换换衣服、鞋鞋帽、穿好好工作服，戴戴上口罩、防防尘帽，换换上拖鞋才才能进入接接种区，进进入接种区区之后随手手把活动门门关上。 五、培养室室 培养室最重重要的是要要恒温、恒恒湿，无尘尘且空气流流通。温度度应维持在在(253)，相对湿湿度应在550660%。培培养室内有有规律地安安放培养架架或摇床。培养室内所所有光照和和黑暗应由

16、由定时器自自动控制。整整个培养室室内还应装装有一个或或多个紫外外灯，以便便能定时对对整个房间间进行杀菌菌处理，特特别是在夏夏天潮湿、霉霉雨季节，最最好每天在在晚上用紫紫外灯杀菌菌30 mmin以上上。培养室室内的地面面、墙壁、培培养架及所所有器物的的表面都应应经常清洗洗、擦拭以以防过多灰灰尘和微生生物滋生。 六、培养物物的检测与与观察记录录室 对培养物进进行及时的的检测和观观察记录是是研究植物物组织培养养的重成部部分之一，如如不及时观观察记录或或对培养物物的形态、结结构、生理理变化以及及培养基变变化等进行行及时检测测，就不可可能获得准准确有效一一手资料，也也就不能及及时地发现现和找出问问题，提

17、出出解决问题题的方法和和改进培养养的方案。检检测与观察察记录室最最好单独设设立一个房房里面摆放放实体解剖剖镜、普通通光学显微微镜、显微微照相和记记录设备 。第五章 植物组组织培养常常用培养基基成分及培培养基配制制目前所使用用的培养基基有10余余种之多，大大部分都是是在前人研研究的基础础上经过分分析综合和和改进而成成的。例如如，Whiite培养养基是Usspensski和UUspennskaiia(19925)的的藻类培养养基演化的的结果，被被广泛用于于根的培养养；Gauutherret培养养基是建立立在Knoop营养液液(18665)基础础上的。以以后的培养养基大部分分是在Whhite和和Ga

18、utthereet培养基基的基础上上改进而成成。一、培养基基的成分（一）、无无机营养成成分(包括括大量元素素，微量元元素和铁盐盐)1、大量元元素：一般般指在培养养基中的浓浓度大于OO.5mmmolLL的元素。氮：常以硝硝态氮(NN03)或或氨态氮(NH4)，或两者者相互配合合的形式存存在。缺氮氮时愈伤组组织会出现现花色素苷苷的颜色，愈愈伤组织内内部不能形形成导管。 磷：常以NNaH2PP04H2O、KKH2P004或(NNH4)HH2P044的形式提提供。钾：常以KKCl、KKN03或或KH2PP04形式式。 钙：常以CCaCl222H2OO、Ca(N03)2。镁：常以MMgS0447H2OO

19、的形式，既既提供了镁镁也提供了了硫。缺硫时培养养的植物组组织会明显显的退绿；缺磷或钾钾时细胞会会过度生长长，愈伤组组织表现出出极其蓬松松状态。 2微量元元素：指小小于O.55mmollL的元元素。 主要包括铁铁(Fe)、锰(MMn)、铜铜(Cu)、锌(ZZn)、氯氯(C1)、硼(BB)和钼(Mo)等等。 铁作为一种种微量元素素，对植物物也是必需需的，但由由于Fe的的特殊性质质，即很不不稳定、易易沉淀，需需要在酸性性条件下才才能比较稳稳定，故在在培养基配配制时常常常把Fe盐盐单独配制制，且常以以螯合物的的形式，把把FeS004和它的的螯合剂乙乙二胺四乙乙酸钠(NNa2EDDTA)先先分别配成成溶

20、液，再再相互混合合使形成螯螯合铁，以以防止沉淀淀和帮助被被植物吸收收。 （二）、有有机营养成成分 维生素: 除维生生素B1、维维生素B66、烟酸之之外，在部部分培养基基中还添加加维生素CC(抗坏血血酸)、维维生素H(生物素)等。甘氨酸(氨氨基乙酸)和肌醇(环己六醇醇):肌醇醇主要以磷磷酸肌醇和和磷脂酰肌肌醇的形式式参与由CCa介导的的信号转导导。另外，在在某些植物物或某些组组织的培养养中还加有有水解乳蛋蛋白、水解解酪蛋白、椰椰子汁、玉玉米胚乳、麦麦芽浸出物物、西红柿柿汁和酵母母浸出物等等。 （三）、碳碳水化合物物用作碳源的的碳水化合合物通常为为蔗糖或葡葡萄糖，用用量通常为为244%，高者者可达

21、5，亦可用用市售的白白糖所代替替。 几乎所有的的培养物在在蔗糖作为为碳源时生生长都比较较好，只有有少数植物物或组织在在葡萄糖或或果糖作为为碳源的培培养基上生生长更合适适。也有用用麦芽糖、半半乳糖、甘甘露糖、山山梨醇和乳乳糖作为碳碳源的。 （四）、植植物生长调调节物质 在植物组织织培养中使使用的生长长调节物质质主要有生生长素类和和细胞分裂裂素类两大大类，少数数培养基中中还添加赤赤霉素GAA3等。1生长素素：主要被被用于诱导导刺激细胞胞分裂和根根的分化。常用的生长长素有：NNAA(萘萘乙酸)，IIAA(吲吲哚乙酸)，IBAA(吲哚丁丁酸)，NNOA(萘萘氧乙酸)，2，44一D(22，4一二二氯苯氧

22、乙乙酸)，22，4，55一T(22，4，55一三氯苯苯氧乙酸)。对愈伤组织织增殖最有有效的是22，4一DD，特别是是对单子叶叶植物。但但2，4-D是一种种极有效的的器官发生生抑制剂，不不能用于启启动根和芽芽分化的培培养基中。 2细胞分分裂素 使用细胞分分裂素的主主要目的是是刺激细胞胞分裂，诱诱导芽的分分化、叶片片扩大和茎茎长高，抑抑制根的生生长。 常用的天然然CTK主主要有：玉玉米素,玉玉米素核苷苷，二氢玉玉米素 。常用的人工工合成CTTK主要有有: 激动动素(KTT)、6-苄基腺嘌嘌呤(6-BA)、22ip(异异戊烯氨基基嘌呤)、和和TDZ(thiddiazuuron，噻噻二唑苯基基脲)等

23、。3赤霉素素 ：主要要是GA33。用时需需过滤灭菌菌；促进试试管苗伸长长。 （五）、琼琼脂或其他他支持物 除液体悬浮浮培养外，所所有的培养养物都应生生长在固体体或半固体体的培养基基上,以防防止培养物物沉人液体体培养基，因因缺氧而死死亡。琼脂脂是一种极极为理想的的支持物。它它是由海藻藻得来的多多糖类物质质，但并不不是培养基基中的必需需成分，只只是作为一一种凝固剂剂使培养基基变成固体体或半固体体状态。（六）、其其他添加物物 ：酵母母提取物，椰椰乳，香蕉蕉粉，橘子子汁，活性性炭，渗透透调节剂、水水解酪蛋白白、水解乳乳蛋白等。1活性炭炭：能从培培养基中吸吸附许多有有机物和无无机物分子子，可清除除培养中

24、植植物组织在在代谢过程程中产生的的、对培养养物有不良良或毒副作作用的物质质，也可以以调节激素素的供应。活性炭还有有刺激胚胎胎发生(如如烟草花药药培养)或或组织生长长和形态发发生的作用用。2渗透调调节剂：常常选用一些些代谢微弱弱的糖来充充当，如甘甘露(糖)醇、山梨梨醇和聚乙乙二醇等，这这些糖基本本上不被培培养的植物物组织所吸吸收，而只只存留在培培养基中，起起到调节渗渗透的作用用。3抗生素素：培养的的植物组织织内部携带带有病原物物，表面消消毒不解决决问题时，可可在配置培培养基时添添加抗生素素，如加22003300U的的庆大霉素素可使细菌菌污染受到到很好的控控制。 二、培养基基的选择 1选择合合适的

25、培养养基 基本培养基基： MSS培养基适适合于大多多数双子叶叶植物，BB5和N66培养基适适合于许多多单子叶植植物， WWhitee培养基适适于根的培培养 激素浓度和和相对比例例的确定 先参考已有有的报道，看看是否有用用相同植物物、相同组组织或相近近者做过成成功或失败败的试验，如如果有则直直接作为参参考；如果果没有，则则在建立激激素配比中中，将每一一种拟使用用的激素选选择355个水平，再再按随机组组合的方式式建立起如如下的实验验方案。 三、培养基基的配制 （一）、配配制母液（二）、配配制培养基基 (三)、配配制培养基基时应注意意的有关问问题 1、高温温灭菌的基基本过程 检查灭菌锅锅内有无足足够

26、量的水水，最好用用蒸馏水或或去离子水水，因为自自来水含有有较多的矿矿物质，容容易使锅内内形成水垢垢，影响锅锅的使用寿寿命。将需需要灭菌的的器皿、培培养基等放放入锅内，不不要装得太太满，以不不超过锅的的容量34为宜。 2、高温下下培养基成成分的降解解 经高温灭菌菌后赤霉素素GA3的的活性仅及及不经高温温灭菌的新新鲜溶液的的10。NNAA、22，4一DD、激动素素和玉米素素在高温下下是比较稳稳定的。蔗糖经高温温后部分被被降解成DD-葡萄糖糖和D-果果糖，果糖糖又可被部部分水解，产产生抑制培培养的植物物组织生长长的物质。高温可使碳碳水化合物物和氨基酸酸发生反应应。维生素具有有不同程度度的热稳定定性，

27、但如如果培养基基的pH值值高于5.5，则维维生素B11会被迅速速降解。 第六章 无菌操作作技术与设设备一、干热灭灭菌 干热灭菌就就是在1880的烘箱内内对器皿进进行杀菌处处理，是一一种彻底杀杀死微生物物的方法。适适合于干热热灭菌的器器皿和物品品有：玻璃器皿皿，如三角角瓶、烧杯杯、量筒等等；金属物品品，如镊子子、解剖刀刀、剪刀等等；可以高温温灭菌的塑塑料制品。二、湿热灭灭菌湿热灭菌就就是人们平平时所说的的蒸汽灭菌菌。灭菌的的温度为1121，压力为为103.4 kPPa，灭菌菌时间除液液体外要求求在1211下维持115 miin以上。液液体灭菌时时间可依据据体积而定定，体积越越大，需要要时间越长长

28、，如2.5L需220minn，10LL需28mmin，225L需331minn。 湿热灭菌时时应注意以以下问题：1、不能随随意延长灭灭菌时间，因因为延长时时间会使一一些化合物物过多分解解，特别是是蔗糖会分分解为单糖糖，使培养养基pH降降低，琼脂脂不能很好好的凝固；2、如果灭灭菌锅没有有吹干程序序，从锅内内取出的纸纸制品、纱纱布等最好好立即转到到60的温箱中中吹干；3、由于锡锡箔纸不透透气，推荐荐使用牛皮皮纸或报纸纸等包装物物品，以利利于水分快快速蒸发；4、灭菌锅锅所装蒸馏馏水或去离离子水应经经常更换，以以防止微生生物污染和和水中杂质质过多，给给灭菌锅和和要灭菌的的物品带来来不利影响响； 三、微

29、过滤滤灭菌是使需要灭灭菌的液体体通过一个个微孔滤膜膜，以除去去液体中的的微生物、微微颗粒等，过过滤的范围围是0.0025llOm。这种种方法对于于高温灭菌菌容易引起起分解的物物质最为适适宜，如容容易分解的的维生素、激激素、植物物组织提取取物、抗生生素等。微过滤灭菌菌的关键部部分是微孔孔滤膜，如如要彻底清清除细菌、酵酵母等微生生物，最好好使用0.22m的滤膜膜。如要获获得原生质质体，则可可使用O.45m的滤膜膜。 四、化学药药物灭菌 1、镊子、解解剖刀等器器具的灭菌菌：将准备使用用的镊子、解解剖刀等浸浸入75%酒精中，器器具的大半半部分都被被酒精浸泡泡。使用时时取出镊子子或解剖刀刀，放在酒酒精灯

30、上加加热至酒精精完全除去去为止，用用完后再放放回75%酒精中。2、外植体体的灭菌：将植物材料料先用自来来水加洗洁洁精少许浸浸泡10mmin以上上，浸泡期期间要轻轻轻搅动几次次，以便使使植物材料料与溶液充充分接触，然然后用自来来水冲洗110 miin左右。在超净工作作台上，将将材料在770酒精精中进行表表面预消毒毒30秒，倒倒掉酒精，再再用O.11升汞(HgCll2)进行行消毒8分分钟左右，或或用1次次氯酸钠(NaOCCl)或次次氯酸钙CCa(OCCl)2消消毒20 min左左右，具体体时间要根根据材料而而定。然后后用无菌水水冲洗34次，每每次2 mmin左右右。次氯酸酸盐在pHH6.O左左右时

31、活性性较高，高高于8.00时几乎无无活性；通通常往消毒毒液中添加加几滴吐温温20或吐吐温80等等表面活性性剂，以提提高灭菌效效果。 五、抗生素素灭菌 首先必须弄弄清楚要杀杀死的是真真菌、细菌菌还是病毒毒，是哪类类真菌、哪哪类细菌或或病毒；其其次应知道道使用的抗抗生素是否否对培养的的植物组织织有不良影影响；最后后要确定抗抗生素的使使用浓度、使使用时期和和处理时间间的长短。抗生素的使使用只能是是用作预防防微生物污污染的方法法，而不能能用于杀死死微生物，因因此在使用用时最好加加在培养基基当中，而而不宜作为为一种杀菌菌剂单独使使用。因为农杆菌菌介导法已已成为植物物基因转移移的一个主主要方法，在在转基因

32、过过程中的除除菌和抑菌菌都离不开开抗生素，所所以使用抗抗生素已逐逐渐成为植植物组织培培养中的灭灭菌技术之之一。六、无菌操操作中其他他应注意的的问题 注意防止紫紫外线的危危害 植植物组织培培养室和超超净工作台台上的紫外外灯开放时时间不可太太长，最好好在30mmin之内内。超净工工作台上的的紫外灯关关闭以后不不要立即走走近工作台台，最好让让无菌风吹吹23 min后后再开始操操作。 第七章 离体快速速繁殖方法法微繁在在无菌条件件下进行植植物的无性性繁殖。11960年年，Morrel提出出了一个离离体无性繁繁殖兰花的的方法，繁繁殖系数极极高。使微微繁技术真真正实用化化。 一、无菌培培养物的建建立 1、

33、外植体体的选择：茎段、茎茎尖、叶片片、嫩芽、鳞鳞茎的鳞片片、花器官官等。 注意：（11）、在生生长季节开开始时由活活跃生长的的枝条上切切取的外植植体，通常常能产生最最好的效果果。（2）、对对于需要低低温、高温温或特殊的的光周期才才能打破休休眠的鳞茎茎、球茎、块块茎和其他他器官，应应当在取芽芽之前进行行必要的处处理。2、消毒二、茎芽的的增殖（一）茎芽芽增殖的类类型1、器官型型(orggan ttype) 以芽增殖芽芽的方法，其其遗传性状状稳定，成成为目前快快速繁殖中中采用的主主要方法。2、器官发发生型(oorgannogennesiss typpe) 外植体先脱脱分化形成成愈伤组织织，再分化化出

34、器官的的方式。3、胚状体体发生型(embrryoidd typpe) 体细胞增殖殖发育的顺顺序与受精精卵发育极极为相似，经经过原胚一一球形胚一一心形胚一一鱼雷胚一一子叶胚55个时期，最最后发育成成完整的植植株。胚状状体可从愈愈伤组织形形成，也可可不经过脱脱分化直接接从子叶、下下胚轴和花花药培养形形成。通过过胚状体的的培养可以以获得大量量的植株，大大大提高繁繁殖率4、原球茎茎型(prrotoeeomb typee) 目前兰花的的快速繁殖殖主要靠原原球茎的分分化方式。 5、球茎芽芽型(gllobosse sttem bbud ttype) 观叶海棠的的叶柄表面面可产生一一个个圆球球形的小突突起（球

35、形形茎），小小突起的一一端产生芽芽和叶片，另另一端长出出根，最后后形成完整整的小植株株。 6 块茎型型(tubber ttype) 花叶芋的叶叶片或叶柄柄上，先形形成类似愈愈伤组织的的小硬粒突突起，并逐逐渐形成粒粒状的芋块块。随后粒粒状芋块上上分化出新新的144个小突起起。由小突突起上分化化出芽原基基。随着小小芋块的增增大，分化化出的芽也也越密集并并形成许多多小苗，在在小苗基部部与芋块交交界处分化化出白色的的根。 7 鳞茎型型(bullb tyype) 百合的鳞茎茎切块基部部近轴面或或在边缘直直接形成带带根的小鳞鳞茎。如卷卷丹鳞片的的顶部、中中部和基部部均能诱导导分化出小小鳞茎。郁郁金香鳞茎茎

36、旁又会分分化出小鳞鳞茎。（二）器官官发生型 1 愈伤组组织形成的的条件 诱导愈伤组组织常用的的生长素是是2，4一一D，IAAA和NAAA，常用用的细胞分分裂素是KKT和6-BA。在在禾谷类植植物中，只只用2，44一D就能能成功地诱诱导愈伤组组织。多数数情况下诱诱导愈伤组组织既需要要生长素，也也需要细胞胞分裂素。黑暗条件下下有利于愈愈伤组织的的形成，光光照对组织织的愈伤化化有抑制作作用。 2 愈伤组组织状态的的调控 优良愈伤组组织须具备备的特性： (1)高高度的胚性性或再分化化能力，以以便得到再再生植株；（2）容易易散碎，以以便用这些些愈伤组织织建立优良良的悬浮系系；（3）旺盛盛的自我增增殖能力

37、，以以便建立大大规模的愈愈伤组织无无性系。（4）经过过长期继代代保存不丧丧失胚性，以以便对它们们进行各种种遗传操作作。 愈伤组织状状况调整的的策略 （1）选择择适当的基基因型和外外植体。如如禾谷类植植物愈伤组组织培养的的成功，是是由于选择择了未成熟熟胚和幼穗穗作为外植植体，它们们的根和幼幼叶虽然也也能形成愈愈伤组织，但但都是非胚胚性的。（2）选择择正确的培培养基，特特别是正确确的植物激激素种类和和浓度，及及二者之间间正确的配配比。 （3）采用用某些特殊殊的理化因因素，改变变愈伤组织织诱导培养养基和培养养条件。如如在玉米幼幼胚愈伤组组织培养中中，通过在在培养基中中添加5mmgL或或10 mmgL

38、 AgNOO3，抑制制组织内乙乙烯的作用用。（4）还原原态氮具有有促进细胞胞分裂的作作用，硝态态氮具有抑抑制细胞分分裂的作用用。增加培培养基中的的氨态氮(或谷氨酰酰胺、精氨氨酸、水解解酪蛋白等等有机形式式的还原态态氮)可明明显促进细细胞分裂；增加培养养基中的硝硝态氮或减减少还原态态氮，可显显著抑制细细胞分裂。 3 影响茎茎芽分化的的因素 化学因素 （1）细胞胞分裂素/生长素 在茎芽芽诱导中，22ip在通通常情况下下是最为有有效的。（2）生长长素能抑制制芽的形成成: 在烟草中，浓浓度低到55molL的IAAA即足以以完全抑制制茎芽的自自发分化。当当与激动素素或腺嘌呤呤结合使用用时，生长长素可以抵

39、抵消它们促促进茎芽形形成的作用用。（3）赤霉霉素对于茎茎芽的分化化有抑制作作用:在烟草中，若若把正在分分化的愈伤伤组织在黑黑暗条件下下以GA33处理，时时间即使短短至3060miin，也会会减少芽的的分化，而而且在处理理之后488h，所有有的拟分生生组织或茎茎芽全都不不复存在。 物理因素 （1）琼脂脂浓度： 在培养养烟草薄层层组织时，当当琼脂为ll时，只只能形成花花；随着琼琼脂浓度的的下降，花花的形成频频率减少，营营养芽的分分化出现。在在液体培养养基中，则则只能愈伤伤化和分化化营养芽 ；（2）渗透透压： 在由马马铃薯叶肉肉原生质体体获得的愈愈伤组织中中，只有在在培养基里里加入0.2O.3 mo

40、olL甘甘露醇以使使渗透压保保持在2000到4000毫渗透透压摩尔时时，才可能能出现茎芽芽的分化。 （3）光照照： 高高强度的光光照对烟草草茎芽的形形成有抑制制作用。天天竺葵愈伤伤组织只有有在光照和和黑暗周期期交替(115166 h光照照最好)条条件下才能能分化茎芽芽，培养在在连续光照照下的愈伤伤组织总是是白色的，不不表现器官官发生。光质对器官官分化也有有影响。在在烟草中蓝蓝光促进茎茎芽分化，红红光刺激生生根。 （4）温度度： Skkoog(19444)在533的范围内内研究了温温度对烟草草愈伤组织织生长和分分化的影响响，发现直直到33时愈伤组组织的生长长都随温度度的上升而而增加，但但只有在1

41、18时最适合合茎芽的分分化，在333时不能形形成茎芽。 其他因子：培养材料的的染色体组组，供体植植株和外植植体的生理理状态，外外植体的细细胞发育状状态，培养养物的历史史以及内生生激素水平平。 （三）影响响茎芽增殖殖的因素1、无机盐盐水平 对有些植物物来说，MMS培养基基中的无机机盐水平或或有毒或太太高。如乌乌饭树的茎茎芽在只含含14强强度MS无无机盐的培培养基中能能长得很好好，无机盐盐水平再高高或是有毒毒或是并没没什么好效效果。2、激素 CTK 为了获得得健壮的茎茎芽应适当当降低细胞胞分裂素浓浓度。细胞胞分裂素使使用的 浓浓度范围是是O.55 mggL，大大多数适当当的浓度是是1 22 mgL

42、。GA 为促使茎茎的伸长，有有时加入GGA； 生长素 在进行茎茎芽繁殖时时，IAAA、NAAA使用的浓浓度范围是是0.11mgL。3、琼脂 微繁繁所用的培培养基通常常都用0.6 %O.8的琼脂固固化。但在在卡特兰和和大多数凤凤梨科植物物中，只有有在液体培培养基中才才能把培养养建立起来来。应用液液体振荡培培养的一个个特殊优点点是茎芽一一边增殖一一边彼此离离散，不必必用人工把把成簇的茎茎芽切开。4、光照和和温度光的作用只只是满足某某些形态发发生过程的的需要，因因此1000050000 llx的光强强即已足够够。光周期期严格地说说也是不重重要的。每每天16 h光照8 h黑黑暗交替照照明，即可可产生令

43、人人满意的效效果。培养室的温温度一般恒恒定在255左右。 三、离体枝枝条的生根根 1、试管内内生根 1）生根培培养基应降降低盐的浓浓度，减少少到122MS或114MSS。 2）诱导生生根需要有有适当的生生长素，最最常用的是是NAA和和IBA，浓浓度一般为为O.1 10.O mggL。3）对于难难生根的植植物，可尝尝试把它们们的下端浸浸在高浓度度生长素溶溶液中若干干时间(由由几秒到几几小时)之之后，再插插于无激素素培养基中中。4）在生根根培养基中中减少蔗糖糖浓度(如如减到1)和增加加光照强度度，能刺激激小植株通通过光合作作用制造食食物的能力力，以便由由异养型过过渡到自养养型。5）枝条在在离体条件

44、件下生根所所需的时间间由10dd到15dd不等。根根长15mmm左右时时移栽最为为方便，更更长的根在在移栽时易易断，会降降低植株的的成活率。 2、试管外外生根 在有些植物物中，可以以把在离体体条件下形形成的枝条条当做微插插条处理，使使它们在土土中生根。在在这种情况况下，须把把插条的基基部切口先先用标准的的生根粉或或混在滑石石粉中的IIBA处理理；有些植物如如月季，则则可先在试试管内诱导导枝条形成成根原基，然然后再移栽栽土中，遮遮荫保湿，待待其生根。试试管外生根根由于减少少了一个无无菌操作步步骤，因而而可降低成成本。 无根苗的嫁嫁接 试管内嫁接接(微体嫁嫁接): 即以试管管苗的0.1O.2mm长

45、长的茎尖为为接穗 ，以以在试管内内预先培养养出来的带带根无菌苗苗为砧木，在在无菌条件件下借助显显微镜进行行嫁接，之之后继续在在试管内培培养，愈合合后成为完完整植株再再移入土中中。 试管外嫁接接: 无籽籽西瓜试管管苗嫁接到到瓠子上后后，在温度度为2530，相对湿湿度基本饱饱和的条件件下，3dd后伤口长长出愈伤组组织，1周周后成活并并长出新叶叶。 四、壮苗、炼炼苗和移栽栽 需壮苗、炼炼苗的原因因 ：试管苗苗生长在恒恒温、高湿湿、弱光、无无菌和有完完全营养供供应的条件件下，虽有有叶绿素，但但营异养生生活，在形形态解剖和和生理特性性上都有很很大脆弱性性，如无角角质层或蜡蜡质层，气气孔开张过过大且不具具

46、备关闭功功能等。这这样的试管管苗若未经经充分锻炼炼，一旦被被移出试管管，投入到到一个变温温、低湿、强强光、有菌菌和缺少完完全营养的的条件下，必必定要被剧剧变的环境境所吞噬。 壮苗： 是是移栽成活活的首要条条件，在培培养基中加加入一定数数量的生长长延缓剂如如多效唑(PP3333)，BB9或矮壮壮素(CCCC)等，在在很多种植植物中都是是培育壮苗苗的一项有有效措施。炼苗： 壮壮苗之后则则须开瓶，降降低瓶中湿湿度，增强强光照强度度，以便促促使叶表面面逐渐形成成角质，促促使气孔逐逐渐建立开开闭机制，促促使叶片逐逐渐启动光光合功能等等。 移栽： 先先要轻轻地地、彻底地地洗掉沾在在根上的琼琼脂培养基基，以

47、免栽栽后发霉。要要选用排水水性和透气气性良好的的移栽介质质，例如蛭蛭石、河沙沙、珍珠岩岩、腐植土土等。移栽栽后，最初初10115 d要要通过喷雾雾或罩上透透明塑料以以保持很高高的湿度(90%100)。 五、微繁中中存在的一一些问题 1、物种的的局限性很多难于用用传统方法法繁殖的重重要树木，包包括若干裸裸子植物，离离体繁殖技技术还未过过关。2、无性系系变异 在商业性微微繁当中，一一旦无菌培培养已经建建立，人们们就禁不住住以此为起起点连续繁繁殖若干世世代，结果果就有可能能使培养早早期发生的的变异(芽芽变或偶然然变异)累累积起来。如如果是通过过愈伤组织织进行微繁繁的话，经经过长期继继代培养之之后，再生生植株中出出现变异的的可能性更更大。3、培养物物污染在植物大规规模微繁期期间，即使使外植体在在一开始进进行了严格格的表面消消毒，某些些