第二十一章基因诊断与基因治疗3618.docx

《第二十一章基因诊断与基因治疗3618.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二十一章基因诊断与基因治疗3618.docx（17页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第二十一章 基因诊断与基因治疗基因诊断与与基因治疗疗能够在比比较短的时时间从理论论设想变为为现实，主主要是由于于分子生物物学的理论论及技术方方法，特别别是重组DDNA技术术的迅速发发展，使人人们可以在在实验室构构建各种载载体、克隆隆及分析目目标基因。所所以对疾病病能够深入入至分子水水平的研究究，并已取取得了重大大的进展。因因此在200世纪700年代末诞诞生了基因因诊断(ggene diaggnosiis)；随后于于19900年美国实实施了第一一个基因治治疗(geene ttheraapy)的的临床试验验方案。可可见，基因因诊断和基基因治疗是是现代分子子生物学的的理论和技技术与医学学相结合的的范

2、例。第一节 基因诊断一. 基因诊断的的含义传统对疾病病的诊断主主要是以疾疾病的表型型改变为依依据，如患患者的症状状、血尿各各项指标的的变化，或或物理检查查的异常结结果，然而而表型的改改变在许多多情况下不不是特异的的，而且是是在疾病发发生的一定定时间后才才出现，因因此常不能能及时作出出明确的诊诊断。现知知各种表型型的改变是是由基因异异常造成的的，也就是是说基因的的改变是引引起疾病的的根本原因因。基因诊诊断是指采采用分子生生物学的技技术方法来来分析受检检者的某一一特定基因因的结构（DDNA水平平）或功能能（RNAA水平）是是否异常，以以此来对相相应的疾病病进行诊断断。基因诊诊断有时也也称为分子子诊

3、断或DDNA诊断断(DNAA diaagnossis)。基因因诊断是病病因的诊断断，既特异异又灵敏，可可以揭示尚尚未出现症症状时与疾疾病相关的的基因状态态，从而可可以对表型型正常的携携带者及某某种疾病的的易感者作作出诊断和和预测，特特别对确定定有遗传疾疾病家族史史的个体或或产前的胎胎儿是否携携带致病基基因的检测测具有指导导意义。二. 基因诊断的的原理及方方法（一）基因因诊断的原原理疾病的发生生不仅与基基因结构的的变异有关关，而且与与其表达功功能异常有有关。基因因诊断的基基本原理就就是检测相相关基因的的结构及其其表达功能能特别是RRNA产物物是否正常常。由于DDNA的突突变、缺失失、插入、倒倒位

4、和基因因融合等均均可造成相相关基因结结构变异，因因此，可以以直接检测测上述的变变化或利用用连锁方法法进行分析析，这就是是DNA诊诊断。对表达产物物mRNAA质和量变变化的分析析为RNAA诊断(RRNA ddiagnnosiss)。（二）基因因诊断的方方法 基基因诊断是是以核酸分分子杂交(nuclleic acidd mollecullar hhybriidizaationn)和和聚合酶链链反应（PPCR）为核心发发展起来的的多种方法法，同时配配合DNAA序列分析析，近年新新兴的基因因芯片可能能会发展成成为一种很很有用的基基因诊断方方法。1. DNA诊断断常用检测致致病基因结结构异常的的方法有下

5、下列几种。 斑点杂杂交：根据据待测DNNA 样本本与标记的的DNA探探针杂交的的图谱，可可以判断目目标基因或或相关的DDNA片段段是否存在在，根据杂杂交点的强强度可以了了解待测基基因的数量量。 等位基基因特异的的寡核苷酸酸探针（aallelle-sppeciffic ooligoonuclleotiide pprobee, ASSO prrobe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形

6、成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说明受检者不存在该种突变基因，如图21-1所示。若与PCRR方法联合合应用，即即PCR/ASO探探针杂交法法(PCRR/ASOO proobe hhybriidizaationn)，是一种种检测基因因点突变的的简便方法法

7、，先用PPCR方法法扩增突变变点上下游游的序列，扩扩增产物再再与ASOO探针杂交交，可明确确诊断突变变的纯合子子和杂合子子。此法对对一些已知知突变类型型的遗传病病，如地中中海贫血、苯苯丙酮尿症症等纯合子子和杂合子子的诊断很很方便。也也可分析癌癌基因如HH-rass和抑癌基基因如p553的点突突变。 单链构构象多态性性（sinngle straand cconfoormattion polyymorpphismm, SSSCP）分析相相同长度的的单链DNNA因其序序列不同，甚甚至单个碱碱基不同，所所形成的构构象不尽相相同，在非非变性聚丙丙烯酰胺凝凝胶电泳时时速度就不不同，若单单链DNAA用放射性

8、性核素标记记，显影后后即可区分分电泳条带带。一般先先设计引物物对突变点点所在外显显子进行扩扩增，PCCR产物经经变性成单单链后进行行电泳分析析。PCRR/SSCCP方法，能能快速、灵灵敏、有效效地检测DDNA突变变点，如图图21-22，此法可可用检测点点突变的遗遗传疾病，如如苯丙酮尿尿症、血友友病等，以以及点突变变的癌基因因和抑癌基基因。限制性性内切酶图图谱（reestriictioon maap）分析，如如果DNAA突变后改改变了某一一核酸限制制性内切酶酶的识别位位点，使原原来某一识识别位点消消失，或形形成了新的的识别位点点，那么相相应限制性性内切酶片片段的长度度和数目会会发生改变变。一般基

9、基因组DNNA经该种种限制性内内切酶水解解，再做SSouthhern印印迹，根据据杂交片段段的图谱，可可诊断该点点突变，如如图21-3所示。如如果用PCCR扩增该该突变点的的外显子，PPCR产物物经该种酶酶消化后，进进行琼脂糖糖电泳，溴溴乙锭染色色后可直接接观察片段段的大小及及数目。此此法可用于于检测有些些限制性内内切酶识别别位点消失失的遗传疾疾病，如镰镰状细胞贫贫血。或基基因缺失的的疾病如地中海贫贫血症，单单纯性生长长激素缺乏乏症等。 限制性性片段长度度多态性（rrestrrictiion ffragmment lenggth ppolymmorphhism ,RFLLP）遗传连锁分析人群中

10、个体间DNA的序列存在差异，据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了DNA限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因，见图21-4，此法可用于诊断甲型血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。 DNAA序列分析析对致病有有关的DNNA片段进进行序列测测定，是诊诊断基因异异常（已知知和未知）最最直接和准准确的方法法。2. RNA诊断断RNA诊断

11、断主要是分分析基因的的表达功能能，检测转转录物的质质和量，以以判断基因因转录效率率的高低，以以及转录物物的大小。RNA印印迹（Noortheern bblot）RRNA印迹迹是检测基基因是否表表达，表达达产物mRRNA的大大小的可靠靠方法，根根据杂交条条带的强度度，可以判判断基因表表达的效率率。RT-PPCR是一一种检测基基因表达产产物mRNNA灵敏的的方法，若若与荧光定定量PCRR结合可对对RT-PPCR产物物量进行准准确测定。三. 基因诊断的的应用（一）遗传传疾病现知遗传疾疾病有数千千种，但多多数遗传疾疾病属少见见病例，有有些遗传疾疾病在不同同民族，不不同地区的的人群中发发病率不同同，例如

12、镰镰状细胞贫贫血（siicklee celll annemiaa）,非洲洲黑色人种种发病率高高，而囊性性纤维化症症（cysstic fibrrosiss）常见于于美国白色色人种，这这二种遗传传疾病在我我国为罕见见病例。中中国较常见见的遗传疾疾病有地中中海贫血、甲甲型血友病病、乙型血血友病、苯苯丙酮尿症症、杜氏肌肌营养不良良症（DMMD）、葡葡萄糖-66磷酸脱氢氢酶（G-6PD）缺缺乏症、唐唐氏综合症症（Dowwns syyndroome）等等。根据不同遗遗传疾病的的分子基础础，可采用用不同的技技术方法进进行诊断，不不但可对有有症状患者者进行检测测，而且对对遗传疾病病家族中未未发病的成成员乃至胎

13、胎儿甚至胚胚胎着床前前（preeimpllantaationn）进行诊诊断是否携携带有异常常基因，这这对婚育具具有指导意意义。地中海贫血血（地贫）是是世界上最最常见和发发生率最高高的一种单单基因遗传传疾病（mmonoggenicc disseasee）,由于于一种或几几种珠蛋白白合成障碍碍导致类与类珠蛋白白不平衡造造成的，临临床以贫血血、黄疸、肝肝脾肿大及及特殊外貌貌为特征，地地贫最常见见的有两类类：地贫和地贫。地贫(-thallasseemiass)的的分子基础础主要为珠蛋白基基因缺失，也也有部分病病例是由于于碱基突变变造成的。可可采用限制制性内切酶酶图谱方法法检测珠蛋白基基因的缺失失。人珠

14、蛋白白基因簇位位于16号号染色体，长长度29 kb，包包含7个连连锁的类基因或或假基因。基因（1及2编码序列相同，仅非编码序列稍有差别,产物相同），该基因簇上有2个EcoRI识别位点，经EcoRI酶解，进行Southern印迹，用标记的基因片段作探针，得到一条23 kb的杂交条带，BamHI识别位点有4个，但只有14 kb片段能与mRNA基因探针杂交，见图21-5。Hb Baarts胎儿水水肿综合征征：由于该该病患儿二二条16号号染色体的的4个珠蛋白基基因均缺失失，不能合合成链，胎儿儿全身水肿肿、肝脾肿肿大、四肢肢短小，常常于妊娠330400周死亡或或早产后半半小时内死死亡。样本本DNA经经限

15、制性内内切酶图谱谱分析不能能显示珠蛋白基基因区带，RRNA诊断断也测定不不出有珠蛋白基基因的mRRNA。缺失型HBBH病：由由于一条116号染色色体上的两两个珠蛋白基基因均缺失失，另一条条16号染染色体上则则缺失一个个珠蛋白基基因，并缺缺失3.77 kb长度度的DNAA片段（右右侧缺失型型）或4.2 kb片段段（左侧缺缺失型），DDNA诊断断只产生119 kb长度度的EcooRI片段段，或100kb BBamHII片段。标准型地地贫：一条条16号染染色体上22个珠蛋白基基因全部缺缺失。而另另一条166号染色体体上具有22个正常的的珠蛋白基基因，DNNA诊断结结果，EccoRI和和BamHII都

16、出现与与正常一样样的23 kb或114 kbb的条带，但但杂交条带带的放射性性自显影较较正常人浅浅。地贫(-thallasseemiass)的的基因诊断断：地贫的分分子基础不不同于地贫，珠蛋白基基因通常并并不缺失，而而是由于基基因点突变变或个别碱碱基的插入入或缺失。每每一民族和和人群珠蛋白基基因点突变变部位不尽尽相同，都都有特定的的类型谱。（二）感染染性疾病 过过去对感染染性疾病(infeectioous ddiseaases)的诊断，一一是直接分分离检查病病原体，或或者对患者者血清学或或生物化学学的分析。有有些病原体体不容易分分离，有些些需经过长长期培养才才能获得。血血清学对病病原体抗体体的

17、检测虽虽然很方便便，但是病病原体感染染人体后需需要间隔一一段时间后后才出现抗抗体，并且且血清学检检查只能确确定是否接接触过该种种病原体，但但不能确定定是否有现现行感染，对对潜伏病原原体的检查查有困难。 对对感染性疾疾病的基因因诊断具有有快速、灵灵敏、特异异等优点。880年代建建立的PCCR技术已已广泛应用用于对病原原体的检测测。一般根根据各病原原体特异和和保守的序序列设计引引物，有的的还合成AASO探针针，对病原原体的DNNA可用PPCR技术术直接检查查，而对RRNA病毒毒，则采用用RT-PPCR。现现在市场已已经有许多多种病原体体的测定药药盒供应，每每一盒包含含扩增某种种病原体的的特异引物物

18、，所需的的酶以及配配妥的各种种反应试剂剂，并附有有可行的操操作方法步步骤。1. 病毒性感染染：多种病毒性性感染都可可采用基因因诊断检测测相应的病病原体，如如甲型、乙乙型、丙型型和丁型肝肝炎病毒，人人免疫缺陷陷病毒、可可萨奇病毒毒、脊髓灰灰质类病毒毒、腺病毒毒、EB病病毒、疱疹疹病毒、人人巨细胞病病毒、乳头头状病毒等。最最近新发现现的SARRS冠状病病毒，在基基因组（RRNA）序序列确定后后，便很快快建立了RRT-PCCR的基因因诊断法。2. 细菌性感染染：可应用基因因诊断检测测多种致病病性的细菌菌，如结核核分枝杆菌菌、痢疾性性大肠杆菌菌、霍乱弧弧菌、淋球球菌、绿脓脓杆菌等。3. 寄生虫：恶性疟

19、原虫虫、克鲁斯斯锥虫、利利什曼原虫虫、血吸虫虫、弓形虫虫等都有有基因诊断断的方法4. 其它:如衣衣原体、支支原体、真真菌性感染染也均用基基因诊断。（三）恶性性肿瘤分析一些原原癌基因的的点突变、插插入突变、基基因扩增、染染色体易位位和抑癌基基因的丢失失或突变，可可以了解恶恶性肿瘤的的分子机制制，有助于于对恶性肿肿瘤的诊断断，对肿瘤瘤治疗及预预后有指导导意义。(四)法医医学中的应应用对生物个体体识别和亲亲子鉴定传传统的方法法有血型、血血清蛋白型型、红细胞胞酶型和白白细胞膜抗抗原(HLLA)等，但但这些方法法都存在着着一些不确确定的因素素。近年来来对人基因因结构的深深入研究发发现，有些些具有个体体特

20、征的遗遗传标记可可用于个体体识别和亲亲子鉴定。1. DNNA指纹分分析(DNNA finggerprrintiing)近年研究发发现，人类类基因组中中许多位点点存在着一一种可变串串联重复序序列(vaariabble nnumbeer off tanndem repeeat，VNTRR)。这这种VNTTR主要存存在于基因因的非编码码区，重复复序列是头头对尾串联联排列着。人人类某些VNTRR是由200-50个个重复单位位组成，每每个单位含含15-1100 bbp，DNA的长长度为1kkb至5kb，较较普通卫星星DNA（约约100 kb）小小，所以称称为小卫星星DNA（miniisateellitt

21、e DNNA）。经研究究发现VNNTR有高高度的多态态性，在人人群中的分分布表现高高度的个体体特异性，甚甚至同一个个体同源染染色体的等等位VNTTR的重复复单位数也也不同，等等位基因按按孟德尔方方式遗传。VNTR区的重复单位数目不同，所以该区的DNA长度不同。但每一位点VNTR的核心序列却有高度的保守性，因此可认为VNTR是一种判断个体的遗传标记。1985年年， Jeeffreeys根据据VNTRR的特点，选选择某些核核心序列作作为探针，并并选用核心心序列无切切割位点的的限制性内内切酶如HHinf11，对DNAA样品进行行酶解，然然后作Sooutheern印迹迹。图谱显显示不同个个体具有不不同

22、条带，如如同人的指指纹具有高高度的个体体特异性一一样，因此此把这种SSouthhern印印迹图称作作DNA指纹图图谱(DNNA fiingerrprinnt)，如如图21-6所示。实实验证明，除除同卵双生生子有相同同的图谱外外，两个人人不可能有有完全相同同的图谱，所所以这种方方法对个体体识别，亲亲子鉴定，嫌嫌疑罪犯的的判断准确确可靠。图图21-77是引自文文献报道的的结果。可可是Souurtheern印迹迹技术操作作繁琐，所所需时间长长，需要DDNA量较较大，若DDNA降解解还会影响响对结果的的判断。所所以，Jeeffreeys又根根据每一VVNTR区区翼侧保守守序列设计计引物，用用PCR方法

23、法对该区进进行扩增，因因VNTRR长度不同同，所以产产物经琼脂脂糖凝胶电电泳，染色色后，根据据条带的不不同，可以以判断结果果。这种方方法既方便便又省时，对对部分酶解解DNA也适适用，对单单根毛发，血血斑，皮屑屑和精迹都都可进行分分析。但有有些VNTTR重复片片断较长，PCR难以扩增。2 短串联重复复(shoort ttandeem reepeatt,STRR)多态性分分析 900年代初，发发现人基因因组中存在在着数量众众多的STTR, SSTR的重重复单元较较短，核心心序列含22-4 bbp，DNA片段段长度为1100-5500 bbp，故称称为微卫星星DNA (miccrosaatellli

24、te DNA).与VNTTR相同, 有不少少的微卫星星DNA存在在着个体间间重复单元元数目不同同的多态性性, 所以以是一种应应用价值很很高的遗传传标记。又又因为微卫卫星DNAA 较短，易易进行PCCR操作，也也能适用于于降解的DDNA分析析。目前，STR-PCR技术在法医学中的应用已占主导地位。VNTR和和STR除除在法医学学中的应用用外，还用用于遗传作作图, 基基因定位及及遗传疾病病的诊断等等。第二节 基因治疗一. 基因治疗的的慨念（一）基因因治疗的定定义从基因角度度可以理解解为对缺陷陷的基因进进行修复或或将正常有有功能的基基因置换或或增补缺陷陷基因的方方法。若从从治疗角度度可以广义义地说是

25、一一种基于导导入遗传物物质以改变变患者细胞胞的基因表表达从而达达到治疗或或预防疾病病的目标的的新措施。导导入的基因因可以是与与缺陷基因因相对应的的有功能的的同源基因因或与缺陷陷基因无关关的治疗基基因。基因治疗有有两种形式式，一种是是改变体细细胞的基因因表达，即即体细胞基基因治疗（ssomattic ggene therrapy），另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗（germline gene therapy），从理论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传给子代。但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后果，涉及一

26、系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。（二）基因因治疗的方方式基因治疗的的方式（ttype of ggene therrapy）主要有3类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵（

27、decoy）转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。除上述3大类外，近日发展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。（三）导入入的方式导入基因有有两种方式式，一种是是体外导入入（ex vivoo）,即在在体外将基基因导入细细胞内，再再将这种基基因修饰过过的细胞回回输病人体体内，使这这种带有外外源基因的的细胞在体体内表达，从从而达到治治疗或预防防的目的。被被用于修饰饰的细胞可可以是自体体，同种异异体或异种种的体细胞胞。合适的的细胞应易易于从体内内取出和回回输，能在在体外增殖殖，经得起起体外实验验操作，能能够

28、高效表表达外源基基因，且能能在体内长长期存活。目目前常用的的细胞有淋淋巴细胞、骨骨髓干细胞胞、内皮细细胞、皮肤肤成纤维细细胞、肝细细胞、肌细细胞、角朊朊细胞（kkerattinoccyte）、多多种肿瘤细细胞等。另另一种是体体内导入（in vivo），即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。二. 外源治疗基基因无论是exx vivvo或in vvivo导导入基因的的方式，首首先要选择择合适的能能达到治疗疗或预防用用的目的基基因。如导导入遗传疾疾病所缺陷陷的基因或或增强机体体免疫的细细胞因子基基因。目前前用于临床床试验的治治疗基因主主要为该基基因的c DNA。一一些

29、临床试试验用的基基因见表221-1作为外源治治疗基因的的条件：基基因的大小小要根据所所用载体（vvectoor）能够运载的容量；若为分泌性产物需含信号肽序列；cDNA序列应正确无误；翻译时要求有起始密码子及终止密码子。三. 载体系统要有效将治治疗基因导导入人体细细胞内需要要靠合适的的运送基因因的工具，即即载体（vvectoor），载体有两类类：一类为为病毒载体体（virral vvectoor ）,另一一类为非病病毒载体（nnon-vviral vvectoor）目前临床6636个基基因治疗方方案所用的的载体列于于表21-2 目目前临床试试验用的载载体仍然以以病毒载体体居多，占占70%以以上，

30、而逆逆转录病毒毒载体约占占所用全部部载体的11/3。非非病毒载体体以脂质体体居多，而而裸质粒DDNA的应应用有逐渐渐上升的趋趋势。目前前所用的载载体尚不尽尽人意，有有些是存在在着安全性性问题，有有些则为效效率不高等等缺点。下下面将讨论论几类常用用载体的构构建极其优优点。（一）逆转转录病毒载载体1. 逆转录病毒毒载体的构构建逆转录病毒毒(rettroviirus)属属RNA病病毒，通过过其本身逆逆转录酶的的作用，形形成双链DDNA原病病毒,然后后整合于宿宿主细胞染染色体中, 详细的的基因结构构及生活史史见第十三三章。构建建载体时以以DNA原原病毒为基基础，将野野生型病毒毒的3类结结构基因ggag

31、，pol和env删除除，以供外外源基因的的插入，但但是要保存存病毒的包包装序列（）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，一种为标记基因（marker gene）供阳性筛选，常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶（NPT ,neoR基因），该酶能破坏抗生素G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳动物细胞在含G418的培养液中不能生长，若含有neoR基因能产生NPT ，即能在含有G418的培养液中生长，故便于筛选转导基因的细胞。另一种为供供治疗用的的基因，治治疗基因和和标记基因因可识别受受控于不同同启动子，其其中一种

32、受受逆转录病病毒的LTTR调控，另另一种常需需连接另外外的启动子子序列，或或者连接一一种称为内内核糖体进进入位点序序列（IRRES），使使转录成一一条多顺反反子mRNNA，在翻翻译过程中中IRESS具有内启启动作用，能能启动蛋白白质的合成成，所以同同一分子mmRNA能能合成2种种或2种以以上不同的的蛋白质。如何包装成成含有外源源基因的逆逆转录病毒毒供治疗用用的呢？因因为载体本本身的3类类结构基因因已被删除除，因此包包装所需的的结构蛋白白质，需要要靠一种所所谓的包装装细胞，如如PA3117, 提提供，这种种细胞含有有一种缺失失包装信号号的逆转录录病毒，只只能产生包包装所需的的结构蛋白白质，但本本

33、身的病毒毒RNA因因缺失包装装信号,所所以不会被被包装成病病毒颗粒，这这对治疗的的安全性很很重要，可可避免产生生有复制潜潜能的逆转转录病毒（RRCR）。将将上述所构构建的载体体转染包装装细胞PAA317，可可产生供治治疗用的含含有治疗基基因的逆转转录病毒颗颗粒，见图图21-88，这种病病毒能高效效感染细胞胞，使治疗疗基因能够够整合至细细胞的染色色体中，从从而能长期期表达基因因产物，以以达到治疗疗目的。2. 逆转录病毒毒载体的优优缺点最大的优点点为能准确确整合于宿宿主细胞的的染色体中中，所携带带的外源目目的基因及及有关序列列不会发生生重排，因因而能长期期稳定表达达。感染细细胞范围较较广，感染染率

34、比较高高，由于结结构基因均均被删除，因因此免疫原原性较低。对对感染细胞胞无毒性作作用。可附附加不同的的调控元件件来提高外外源基因的的表达效率率，并对之之进行调控控。局限性：逆逆转录病毒毒只能在核核膜尚未形形成时，才才能进入核核内，因此此它只能将将外源基因因转移至增增殖分裂的的细胞，而而对静止细细胞转录效效果不佳。由由于该病毒毒基因本身身不大，故故能容纳外外源基因的的大小有限限，应小于于8kb。逆逆转录病毒毒稳定性较较差，难耐耐受体外的的操作，在在纯化或浓浓缩过程常常使其感染染性降低。病病毒颗粒能能迅速被补补体破坏。因因为是随机机整合，所所以具有插插入突变的的危险，特特别是病毒毒制剂中污污染着R

35、CCR。（二）其他他病毒载体体1. 腺病毒感染人的腺腺病毒(aadenooviruus)有有50余种种血清型，能能感染多种种组织器官官，产生类类似感冒或或类似流感感症状，目目前多数采采用无致病病性的5型型及2型腺腺病毒作为为载体。构构建载体时时ITR及及包装信号号应保存，其其余的部分分有些可删删除，供外外源基因的的插入，插插入片段的的大小可达达kb。腺腺病毒载体体较稳定，能能耐受纯化化浓缩等操操作，可获获得高滴度度的病毒颗颗粒，感染染宿主细胞胞范围较广广，感染效效率高，既既能感染分分裂相细胞胞，也能感感染非分裂裂相细胞，但但腺病毒不不整合于宿宿主细胞染染色体，故故只能短暂暂表达外源源基因，最最

36、大的缺点点为引起机机体的免疫疫反应和毒毒副作用。. 腺相关病毒毒属微小病毒毒科，不致致病，为单单链DNAA约4.77 kb，腺腺相关病毒毒(adeeno-aassocciateed viirus)，作作为载体最最大的优点点能感染分分裂相和非非分裂相细细胞，并整整合于宿主主细胞染色色体，能长长期稳定表表达，无不不良反应，适适合于一些些遗传性疾疾病如甲型型和乙型血血友病的基基因治疗。但但腺相关病病毒载体的的制备因需需要辅助病病毒的参与与，有污染染的可能性性。. 其他慢病毒（如如HIV）、型单纯性性疱疹病毒毒、痘病毒毒和杆状病病毒等都被被研究发展展作为转移移基因的载载体。（三）脂质质体上述病毒载载体

37、最大的的特点是能能高效转移移外源目的的基因，但但是也存在在着许多的的局限性，特特别是免疫疫原性强和和可能造成成细胞突变变危险。因因此发展非非病毒载体体倍受基因因治疗研究究者的注意意。借助物物理、化学学方法或直直接将外源源基因导入入宿主细胞胞内。脂质体（llipossome）主要是由天然磷脂和胆固醇类衍生物组成类似生物膜的脂质双分子层包围水相形成的闭合囊泡。脂质体有两两类：一类类为阳离子子脂质体，表表面带正电电荷，由于于DNA带带负电，因因此借正电电荷的作用用，可以浓浓集和缩合合DNA，形形成脂质体体DNA复复合物（llipopplex）可可携带的基基因不受DDNA大小小的限制，见见图9。目前前

38、基因治疗疗所用的脂脂质体都是是阳离子脂脂质体。另另一类为带带负电脂质质体，表面面带负电，DDNA或其其他药物被被包埋在内内部水相中中。由于脂质体体具有类似似生物膜的的性质，因因此当脂质质体DNAA复合物与与细胞膜接接触后，通通过胞吞作作用（enndocyytosiis）而进进入胞内。脂质体载体体除上述介介导外源基基因转移不不受大小限限制外，最最大的优点点为无生物物源性，无无毒性，更更安全可靠靠。但是转转染效率很很低，而且且是短暂表表达。（四）裸DDNA裸DNA（nnakedd DNAA），即将外源基因构建于真核表达质粒，借助物理的或机械方法直接将其导入宿主组织细胞内。横纹肌和心肌摄取裸DNA的

39、效率较高。若外源基因表达产物可激发机体免疫反应，以防治某些疾病，可称为DNA疫苗（DNA vaccine），是一种非常有希望的新型疫苗。直接注射裸裸DNA转转染效率不不高，常借借助一些物物理方法。基因枪（ggene gun），通过高压放电产生强烈的冲击波（shock wave），作用于被金包埋的DNA微粒，使DNA微粒加速运动，即颗粒轰击（particle bombardment）而穿透组织细胞，此法不但可用于体外转移基因，而且已用于临床将表达IL-12质粒导入浅表肿瘤组织。矩形波电穿穿孔仪（ssquarre ellectrroporratorr）这种仪仪器能产生生低电压的的矩形波，使使细胞穿

40、孔孔，让DNNA进入，因因为产生的的仅是使细细胞穿孔的的矩形波，可可避免一般般电穿孔仪仪产生的高高电压造成成细胞损伤伤的缺点，电电压的范围围为5-5500，加加压间隔为为100毫毫秒-1秒秒。这种仪仪器可用于于体外基因因转移，也也可用于体体内组织器器官的基因因转移，据据报道对肌肌肉组织的的转移效率率比直接注注射DNAA高个数数量级以上上，是一种种很有前景景的基因转转移方法。四. 基因治疗的的临床试验验目前临床基基因治疗试试验的方案案已达9百多个，受受治疗的患患者已有数数千例表21-33可见当前前临床基因因治疗（ggene therrapy）或广义地称基因转移（gene transfer）试验，

41、有三种类型，即治疗性、基因标记及非治疗性试验。后者将腺病毒载体注射于健康自愿者的体内，观察机体对腺病毒载体的反应。这些方案的临床试验期（trial phases）极大多数为期临床试验，期者仅仅个方案。说明基因治疗临床试验尚处于未成熟阶段。（一）基因因标记目前常用的的基因标记记方法是将将含neooR基因的重重组逆转录录病毒载体体在体外转转导细胞，然然后回输至至病人体内内，可以很很方便地跟跟踪这种标标记细胞的的命运，用用来研究许许多其他方方法不能回回答的体细细胞移植的的生物学问问题。美国第一个个被批准基基因标记的的临床研究究计划是NNIH的RRosennbergg等的肿瘤瘤浸润淋巴巴细胞（ttum

42、orr inffiltrratinng lyymphoocytees, TTIL）基因标标记实验。他他将恶性黑黑色素瘤组组织或转移移的淋巴结结制成单细细胞悬液，在在IL-22的作用下下淋巴细胞胞可成倍增增殖而肿瘤瘤细胞及其其他类型细细胞则死亡亡。这种TTIL能特特异杀伤肿肿瘤细胞。先先在体外将将含有neeoR基因的逆逆转录病毒毒载体转导导TIL，该该载体能整整合至TIIL的基因因组，故子子代的TIIL也含有有neoR基因，能能在含抗生生素G4118的培养养液中生长长，便于筛筛选；也可可用PCRR检测neeoR基因是否否存在，以以跟踪回输输体内的TTIL的去去处。将这种基因因修饰过的的TIL注注

43、射于黑色色素瘤患者者，可以研研究TILL在体内各各组织器官官、血循环环细胞、淋淋巴结、肿肿瘤组织的的分布情况况；特别感感兴趣的是是观察TIIL是否能能靶向肿瘤瘤组织；同同时也可以以研究TIIL在体内内存活期的的长短；以以及了解这这种体外基基因修饰过过的TILL是否会自自主生长和和恶变？注注射后对人人体是否有有害？这些些问题的阐阐明可为基基因治疗打打基础。结结果发现基基因修饰过过的TILL在体外不不会自主增增殖，说明明没有恶变变。在注射射后的头33周，用PPCR可测测出外周血血存在着含含有neooR基因的单单核细胞，有有的长至660d尚可可测出。在在注射后33d活检的的肿瘤组织织也可测出出有基因

44、修修饰过的TTIL的存存在。有人人对其他细细胞如骨髓髓细胞、肝肝细胞和细细胞毒淋巴巴细胞等进进行标记研研究。（二）单基基因疾病遗传性单基基因疾病（mmonoggenicc disseasees）是基因治治疗的理想想侯选对象象，设计治治疗方案时时应考虑下下列几点因因素：对造成该该疾病有关关的基因应应有较详细细的了解，并并能在实验验室克隆适适合真核细细胞表达的的有关基因因的cDNNA序列，供供转导用。经有功能基因转导的体细胞，只要产生较少量原来缺少的基因产物就能矫正疾病。例如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏的严重联合免疫缺陷（SCID），由于淋巴细胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆积，可破坏免疫功能，

45、患儿很少活至成年。若淋巴细胞ADA恢复至正常水平的5%10%即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。血友病B，是由于凝血因子缺乏所致。现知只要因子水平达到正常的10% 20%就能缓解严重的血友病。对血友病A而言，只要因子达正常水平的5%就能缓解症状，血友病已开始基因治疗临床试验。即使导入基因过度表达，对机体应无不良作用。有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，但那有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。例如Parkinson症是脑黑质细胞（substantia nigra）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（dopamine），给病人注射多巴胺可减轻症状。动

46、物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。现在采用的以正常有功能的同源基因来增补体内的缺乏基因，因此要求增补的基因在病人寿命期间能稳定表达，或重复治疗，所以应考虑构建能长期持续稳定表达外源基因的载体，并考虑将外源基因转导干细胞，如造血干细胞以望回输体内后其子代细胞也含有外源基因。目前应用基基因治疗的的单基因疾疾病已有二二十多种。（三） 恶恶性肿瘤恶性肿瘤属属复杂基因因疾病(ccompllex ggenettic ddiseaases)，可能能涉及多种种基因的异异常，发病病过程是多多步骤的，至至今虽有不不少有关的的基因被鉴鉴定，但肿肿瘤发病的的分

47、子机制制尚未清楚楚，因此治治疗时应选选择何种靶靶基因不明明确，多数数是根据不不同的环节节，设计不不同的治疗疗策略，目目前临床恶恶性肿瘤的的基因治疗疗策略有十十余种之多多。见表221-4。. 免疫基因治治疗(immmunoogenee theeray)分体外转导导和体内转转导二种。体体外转导将将一些能刺刺激免疫反反应的细胞胞因子基因因，如IL-2、IIL-122、IFNN-等转导肿肿瘤细胞作作为基因工工程“瘤苗”，给肿瘤瘤患者注射射，宗旨为为提高肿瘤瘤细胞的免免疫原性，有有利于被机机体免疫系系统识别及及排斥；由由于转导细细胞因子基基因的肿瘤瘤细胞在体体内能持续续不断分泌泌细胞因子子，能增强强抗肿

48、瘤的的特异免疫疫和非特异异免疫反应应，在肿瘤瘤局部形成成一种较强强的抗肿瘤瘤免疫反应应微环境，并并能通过局局部免疫反反应，引发发全身的抗抗肿瘤免疫疫机能，此此策略已应应用于多种种恶性肿瘤瘤的临床试试验。本实实验室研究究了IL-2基因转转导的人肝肝癌和胃癌癌细胞“瘤苗”，后者已已被中国药药物管理局局批准用于于临床研究究。另一种种策略是将将细胞因子子基因或MMHC II类基因直直接体内注注射于肿瘤瘤局部，以以促发抗肿肿瘤免疫反反应。. 自杀基因系系统自杀基因（ssuiciide ggene）来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯性疱疹病毒的胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（gancilovir, GCV）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的DNA链，造成DNA链的断裂和抑制DNA聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。所以将HSV-tk基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者服用GCV药物，肿瘤细胞表达TK基因能使无毒的GCV转变成有毒的三磷酸GCV，达到杀伤肿瘤细胞的目的。. 抑癌基因 (tummor ssupprressiive ggene)抑癌基因pp53的突突变