放线菌新种分类鉴定.ppt

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1、放放放放线线菌新种分离菌新种分离菌新种分离菌新种分离鉴鉴定定定定1实验目的目的2实验方法方法3实验结果果4总结2011/12/2811、实验目的目的 本本实验通通过对分离得到的放分离得到的放线菌新种从形菌新种从形态学、学、生理生化反生理生化反应特征、和分子特征、和分子遗传分分类学方面学方面进行行鉴定，定，证明其是以前从未明其是以前从未发现的新种。的新种。2011/12/2822、实验方法方法2.1 分离方法分离方法2.3 鉴定方法定方法2.2 16SrRNA基因序列基因序列测定定2011/12/2832.1 分离方法分离方法近近年年来来出出现了了胞胞外外多多糖糖胶胶与与动孢溶溶液液相相结合合的

2、的分分离离方方法法、再再水水化化-离离心心 法法、极极高高频辐射射法法、噬噬菌菌体体定定向向分分离离法法和和蔗蔗糖糖梯梯度度离离心心法法等等用用于稀有放于稀有放线菌菌选择性分离的方法。性分离的方法。2011/12/2842.2 16SrRNA基因序列基因序列测定定放放线菌基因菌基因组的提取的提取16SrRNA16SrRNA基因基因扩增增胶回收胶回收连接接转化化测序研究序研究2011/12/285A电镜观察察B培养特征培养特征C生理生化特征生理生化特征2.3.1 表表观特征特征2011/12/286A.电镜取菌体后取菌体后,3%戊二戊二醛固定固定4h,0.1M磷酸磷酸缓冲液漂洗。冲液漂洗。酒精梯

3、度脱水，在酒精梯度脱水，在30%、50、70、80%、100依次脱依次脱水，其中水，其中100酒精酒精2次，每次次，每次10min。乙酸异戊脂置乙酸异戊脂置换，50%一次，一次，100%两次。两次。Eiko公司公司XD-1型二氧化碳型二氧化碳临界点干燥器干燥，界点干燥器干燥，Eiko公司公司IB-3型离子型离子镀金金仪喷金金镀膜。膜。JEOL公司公司JSM-840扫描描电镜观察。察。2011/12/287B.培养特征培养特征参照国参照国际链霉菌霉菌规划中有关放划中有关放线菌的培养特征描述所菌的培养特征描述所采用的采用的标准培养基准培养基进行培养特征行培养特征测定。定。所用培养基有所用培养基有:

4、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏、察氏琼脂、脂、马铃薯浸汁薯浸汁琼脂、脂、营养养琼脂脂，平板接种，平板接种，28培养培养7，14，21，28d后分后分别观察并察并记录基内菌基内菌丝、气生菌、气生菌丝的的生生长情况及可溶性色素。情况及可溶性色素。2011/12/288C.生理生化生理生化实验生理生化特性的生理生化特性的测定主要包括定主要包括:pH、盐浓度和温度耐受性，度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，明胶液化，淀粉水解，脲酶的的产生，牛奶生，牛奶胨化和凝固，硝酸化和凝固，硝酸盐还原，原，H2S的的产生，黑生，黑色素的色素的产生，唯一碳、氮源利用等生，唯一碳、氮源利用等试验。2011

5、/12/289a.pH、盐浓度和温度耐受性度和温度耐受性upH耐受耐受实验在高氏一号培养基中分在高氏一号培养基中分别加入加入pH缓冲液，空白培养基作阴性冲液，空白培养基作阴性对照，照，28培养，每周培养，每周观察一次，四周察一次，四周结束，重复束，重复2次。次。u温度耐受温度耐受实验将菌株接种在高氏一号培养基上，分将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在在4、10 、16 、20 、28、37、45培养，每周培养，每周观察一次，四周察一次，四周结束，重复束，重复2次。次。u盐耐受耐受实验高氏一号培养基内加入不同高氏一号培养基内加入不同浓度的度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15%，20

6、%)28培养，每周培养，每周观察一次，四周察一次，四周结束，重复束，重复2次。次。2011/12/2810b.明胶液化明胶液化取明胶培养基取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白管作穿刺接种，另有两支不接种作空白对照。于照。于28C培养箱中培养。培养箱中培养。培养培养2、7、10、14和和30天的天的试管，放入管，放入4C冰箱或置于冷冰箱或置于冷水中水中30min，然后，然后进行行观察。察。如明胶凝如明胶凝块部分或全部部分或全部变为可流通的可流通的液体液体，则明胶水解明胶水解阳性阳性。如明胶凝如明胶凝块呈呈固体固体，则明胶水解明胶水解阴性阴性。若菌体未生若菌体未生长，可能是不能在明胶培

7、养基上生，可能是不能在明胶培养基上生长。2011/12/2811c.淀粉水解淀粉水解将菌株点种在淀粉将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生脂平板上，待菌落生长良好良好时，在菌落周在菌落周围滴加碘液滴加碘液检测淀粉水解淀粉水解酶活性的活性的强弱。弱。滴加碘液后培养皿背景呈滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色黑色,菌落四周若不菌落四周若不变色，色，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不不变色色，表示淀粉水解表示淀粉水解阴性阴性；若；若变成成透明无色透明无色则为阳性阳性，说明明产生淀粉生淀粉酶水解淀粉。水解淀粉。2011/12/2812d.脲酶的的产生生e.牛奶凝固

8、与牛奶凝固与胨化化将待将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与察牛奶凝固与胨化化现象。象。若牛奶有凝若牛奶有凝块则为凝固，凝固，继续培养，凝固后有液体出培养，凝固后有液体出现，进一步水解一步水解成液体，成液体，则为胨化，一般先凝固后化，一般先凝固后胨化。化。有些有些细菌能菌能产生尿素生尿素酶，将尿素分解、，将尿素分解、产生生2个分子的氨，使培养基个分子的氨，使培养基变为碱性，酚碱性，酚红呈粉呈粉红色。尿素色。尿素酶不是不是诱导酶，因，因为不不论底物尿素是否存底物尿素是否存在，在，细菌均能合成此菌均能合成此酶。其活性最适。其活性最适pH为7.0。挑取挑取1824h待待

9、试菌培养物大量穿刺接种于菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培脂斜面，不要到达底部，培养养14d观察察结果，如果，如为阴性阴性应继续培养一下，作最培养一下，作最终判定，判定，变为粉粉红色色为阳性阳性。2011/12/2813将待将待测菌种接在硝酸菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，液体培养基中，置室温下培养，1、3、5d取取样测定。每株菌作复本，另两管作定。每株菌作复本，另两管作对照。照。培养液中加入格里氏培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈液各一滴，如呈现粉粉红色、色、玫瑰玫瑰红色色，表明硝酸，表明硝酸盐还原原阳性阳性，如无，如无红色出色出现，则加加1，2滴二苯胺滴二苯

10、胺试剂，如呈，如呈蓝色色，表示培养液中仍有硝酸，表示培养液中仍有硝酸盐存在，存在，硝酸硝酸盐还原属原属阴性阴性，若，若不呈不呈蓝色色，表示硝酸，表示硝酸盐和和亚硝酸硝酸盐都已都已还原成其他物原成其他物质，仍按，仍按阳性阳性结果果处理。理。f.硝酸硝酸盐还原原试验2011/12/2814g.H2S的的产生生某某些些细菌菌能能分分解解含含硫硫化化合合物物如如胱胱氨氨酸酸、甲甲硫硫氨氨酸酸而而产生生硫硫化化氢气气体体，若若于于培培养养基基中中加加入入柠檬檬酸酸铁铵或或醋醋酸酸铵，则与与硫硫化化氢作作用用生成生成硫化硫化亚铁或硫化或硫化铅（黑色）沉淀（黑色）沉淀。h.黑色素的黑色素的产生生将将供供试菌

11、菌株株接接种种在在酪酪氨氨酸酸培培养养基基斜斜面面管管上上，培培养养 7 d 和和 14 d 观察察结果，培养基被染成果，培养基被染成褐色或者黑色褐色或者黑色即即说明明该菌菌产生黑色素。生黑色素。2011/12/2815i.碳源利用和氮源利用（本碳源利用和氮源利用（本实验利用利用BIOLOG板）板）碳源：碳源：D-葡萄糖，蔗糖，葡萄糖，蔗糖，L-树胶胶醛糖，糖，D-果糖，果糖，D-木糖，鼠李糖，木糖，鼠李糖，I-肌醇，棉子糖，肌醇，棉子糖，D-甘露醇，甘露醇，纤维素。素。不加碳源的基不加碳源的基础培养基作培养基作为阴性阴性对照。照。氮源氮源:KNO3，NaNO2，尿素，尿素，(NH4)2SO4

12、，丝氨酸，烟氨酸，烟酰胺，酪氨胺，酪氨酸，酸，DL-天冬氨酸，天冬氨酸，L-甲硫氨酸，甲硫氨酸，DL-丙氨酸，丙氨酸，L-精氨酸，精氨酸，L(+)-谷氨谷氨酸，甘氨酸，酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺苯丙氨酸，腺嘌呤。呤。不同氮源按不同氮源按0.5%的的浓度加入，培度加入，培15天后，将各种氮源上的生天后，将各种氮源上的生长状况状况与不加氮源的基与不加氮源的基础培养基上的生培养基上的生长状况作比状况作比较。2011/12/2816A细胞壁化学胞壁化学组分分B磷酸磷酸类脂脂测定定C甲基甲基萘醌测定定D脂肪酸脂肪酸测定定2.3.2 化学分化学分类2011/12/2817A.细胞壁化学胞壁化学组分分放放

13、线菌的菌的细胞壁主要成分胞壁主要成分为肽聚糖，根据聚糖，根据肽聚糖分聚糖分子中子中肽链第第3位氨基酸的种位氨基酸的种类，种，种间肽桥和和邻近的四近的四肽交交联的位置来决定放的位置来决定放线菌菌细胞壁型的划分。胞壁型的划分。Lechevalier等（等（1976）根据放）根据放线菌菌细胞壁的化学胞壁的化学组分和全分和全细胞水解液糖型，将放胞水解液糖型，将放线菌菌归为9个主要个主要类群群和和4个糖型。个糖型。2011/12/2818胞壁类型主要组成代表属IL,L-DAP，甘氨酸，甘氨酸SterptomycesIIMeso-DAP，甘氨酸，甘氨酸MicromonosporaIIIMeso-DAPAc

14、tinomaduraIVMeso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖，阿拉伯糖，半乳糖NocardiaV赖氨酸，氨酸，鸟氨酸氨酸ActinomycesVI赖氨酸（天冬氨酸，半乳糖）氨酸（天冬氨酸，半乳糖）OerskoviaVIIDAB，甘氨酸，甘氨酸AgromycesVIII鸟氨酸氨酸BifidobacteriumIXMeso-DAP，多种氨基酸多种氨基酸Mycoplana放放线菌菌细胞壁的主要构成（胞壁的主要构成（Lechevalier，1976）2011/12/2819糖类型主要成分代表属、种A阿拉伯糖，半乳糖阿拉伯糖，半乳糖NocardiaB马杜拉糖杜拉糖ActinomaduraC无特征性糖无特征

15、性糖StreptomycesD木糖，阿拉伯糖木糖，阿拉伯糖MicromonosporaE半乳糖半乳糖Kutzneria viridogriseum放放线菌全菌全细胞的主要糖胞的主要糖类型（型（Lechevalier，1976）2011/12/2820全全细胞胞TLC分分析析实验流程：流程：2011/12/2821磷酸磷酸类脂位于放脂位于放线菌菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂脂组份是不同的，它是份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分属的重要特征之一，是化学分类项目中不可目中不可缺少的分缺少的分类指征。磷酸指征。磷酸类脂的种脂的种类繁多，但用于分

16、繁多，但用于分类的指征并不多。的指征并不多。用于分用于分类指征的磷酸指征的磷酸类脂只有五种：脂只有五种：磷脂磷脂酰乙醇胺（乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE）磷脂磷脂酰甲基乙醇胺（甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME）磷脂磷脂酰胆碱（胆碱（phosphatidyl choline,PC）磷脂磷脂酰甘油（甘油（phosphatidyl glycerol,PG）含葡萄糖胺的未知含葡萄糖胺的未知结构磷酸构磷酸类脂（脂（phospholipids of unknown structure containing glucosa

17、mine,GluNu）B.磷酸磷酸类脂脂测定定2011/12/2822称取称取1g湿菌体于湿菌体于带螺口的螺口的40 ml离心管中。离心管中。加入加入15ml甲醇。甲醇。100水浴水浴10 min，自然冷却。，自然冷却。加入加入10 ml氯仿和仿和6 ml 0.5%NaCl。用力用力摇匀匀10 min，静止可看到分，静止可看到分层。8000 rpm，离心，离心10 min。到入分液漏斗静止分到入分液漏斗静止分层，取下，取下层。30-40旋旋转蒸干。蒸干。分两次各加入分两次各加入200l氯仿仿/甲醇（甲醇（2:1）冲洗器壁。）冲洗器壁。液体移入液体移入EP管（管（约100-200l）,8000

18、rpm，离心，离心10 min，去沉淀。，去沉淀。4保存保存备用。用。细胞磷脂的提取胞磷脂的提取2011/12/2823实验流程：流程：2011/12/2824C.甲基甲基萘醌测定定大多数大多数细菌含有甲基菌含有甲基萘醌或泛或泛醌，或两者均有。包，或两者均有。包括放括放线菌在内的革菌在内的革兰氏阳性氏阳性细菌只含甲基菌只含甲基萘醌。放放线菌及有冠菌及有冠军的甲基的甲基萘醌异戊异戊烯侧链长度和度和氢饱和度和度变化相当大，多化相当大，多为部分部分饱和，含有和，含有7-12个异戊个异戊烯单位。位。放放线菌目中不同菌属的甲基菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。型如下表所示。2011/12/2825

19、放放线菌目中甲基菌目中甲基萘醌类型型类型型萘醌种种类Eubacteria（异戊（异戊烯单位无位无氢化）化）IaMK-7Bmk-9Mycobacterium（主要是（主要是8或或9个异戊个异戊烯单位上被位上被2或或4个个氢化）化）IIaMK-8(H2)bMK-8(H4)cMK-9(H2)dMK-9(H4)Saccharomonospora（4氢化的多化的多烯萘醌）IIIaMK-8(H4),MK-9(H4)bMK-9(H4),MK-10(H4)Streptomyces（具有同一（具有同一链长，但，但氢饱和度不同的和度不同的萘醌）IVaMK-9(H2),MK-9(H4),MK-9(H6)bMK-9(

20、H4),MK-9(H6),MK-9(H8)cMK-10(H4),MK-9(H6)2011/12/2826菌体的收集制菌体的收集制备待待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗水洗涤两次，菌体于两次，菌体于-80冷冷冻3d，冷，冷冻干燥机抽干菌干燥机抽干菌体，体，冻干菌体干菌体4干燥器保存干燥器保存备用。用。醌的提取及的提取及纯化化2011/12/2827D.脂肪酸脂肪酸测定定放放线菌菌细胞中脂肪酸的胞中脂肪酸的链长、双、双键位置和数量及取代基位置和数量及取代基团具具有分有分类学意学意义，是一，是一项重要的分重要的分类特征。特征。脂肪酸脂肪酸组份一

21、般份一般较为复复杂，分，分别归属属3种种类型：型：直直链饱和与不和与不饱和、分枝和复和、分枝和复杂形式的脂肪酸。形式的脂肪酸。脂肪酸分析脂肪酸分析应在在标准化的条件下准化的条件下进行，因行，因为不同不同组分的相分的相对含量因菌含量因菌龄和培养条件的不同而异。和培养条件的不同而异。脂肪酸定性分析脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分；脂肪酸定量分析可析可为种和种和亚种分种分类提供有用的基本提供有用的基本资料。料。2011/12/2828 基因型分基因型分类AG+C%含量分析含量分析BDNA-DNA分子分子杂交交C16srRNA基因序列分析及基因序列分析及进化化树

22、的构建的构建2011/12/2829A.G+C%含量分析含量分析DNA 碱基碱基组成比例（成比例（G+C mol%）是十分典型的基因指征之一，）是十分典型的基因指征之一，一般一般认为 G+C mol%在种内相差不会超在种内相差不会超过 3%，在属内不会超，在属内不会超过 10%。大量分析大量分析结果表明：放果表明：放线菌属于高菌属于高 GC 含量的微生物，并且含量的微生物，并且 G+C%变化范化范围小，最多不会超小，最多不会超过 30%。由于。由于 G+C%在不同物在不同物种中均是比种中均是比较恒定的，因此可作恒定的，因此可作为诸多分多分类指征中不可或缺的一指征中不可或缺的一个，常常作个，常常

23、作为属的分属的分类鉴定定标准之一。准之一。2011/12/2830HPLC实验：实验条件：条件：1.0ml/min 37C柱子：柱子：C18反相柱反相柱溶溶剂：12%甲醇甲醇 20mM磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1）20mM磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1）配制：）配制：三乙胺（三乙胺（99%）用水稀）用水稀释，用，用85%磷酸磷酸调pH至至5.1，即，即0.5M磷酸三乙胺磷酸三乙胺40ml 0.5M磷酸三乙胺（磷酸三乙胺（pH5.1）与）与750ml glass-distilled water混合，再混合，再加入加入120mlHPLC-grade甲醇，再加入水至甲醇，再加入水至总体体积

24、为1L。不用柱子不用柱子时，流速减至，流速减至0.1ml/min当当仪器超器超过3天不使用天不使用时，柱子先用水清洗，再用，柱子先用水清洗，再用70%甲醇清洗。甲醇清洗。2011/12/2831B.DNA-DNA分子分子杂交交DNA-DNA分子分子杂交可以在基因交可以在基因组水平上研究微生物水平上研究微生物间的的区区别与与联系，用于种水平的分系，用于种水平的分类学研究和新种的确立。学研究和新种的确立。1987 年，国年，国际系系统细菌学委菌学委员会会规定：定：DNA 同源性同源性70%或者或者杂交分子的交分子的热解解链温度差温度差 Tm5作作为细菌种的界限。菌种的界限。在放在放线菌分菌分类中，

25、中，DNA-DNA杂交已被确定交已被确定为建立心中的建立心中的必要必要标准之一。准之一。2011/12/2832DNA杂交法的基本原理是用交法的基本原理是用DNA解解链的可逆性和碱基配的可逆性和碱基配对的的专一一性，将不同来源的性，将不同来源的DNA在体外加在体外加热解解链，并在合适的条件下，使互，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配的碱基重新配对结合成双合成双链DNA，然后根据能生成双，然后根据能生成双链的情况，的情况，检测杂合百分数。合百分数。如果两条如果两条单链DNA的碱基的碱基顺序全部相同，序全部相同，则它它们能生成完整的双能生成完整的双链，即，即杂合率合率为100%。如果两条。如果两

26、条单链DNA的碱基序列只有部分相同，的碱基序列只有部分相同，则它它们能生成的能生成的“双双链”仅含有局部含有局部单链，其，其杂合率小于合率小于100%。由此，。由此，杂合率越高合率越高，表示两个，表示两个DNA之之间碱基序列的碱基序列的相似性越高相似性越高，它，它们之之间的的亲缘关系也就越近。关系也就越近。2011/12/2833C.16srRNA基因序列分析及基因序列分析及进化化树的构建的构建将所得到序列利用将所得到序列利用BlastBlast软件在软件在GenBankGenBank，NCBINCBI等等数据库中进行相似性搜索，选取同源性比较高的数据库中进行相似性搜索，选取同源性比较高的典型菌株的典型菌株的 16SrRNA16SrRNA序列作为参比对象，然后用序列作为参比对象，然后用MEGA 4MEGA 4软件构建供试菌与参比菌之间软件构建供试菌与参比菌之间的系统进的系统进化树。化树。2011/12/2834