第十九章 平面色谱法1.ppt

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1、Chrmatgraphycreatinga centralscience第十九章 平面色谱法(planar Chromatography)版权所有：新乡医学院基础医学院化学教研室Copyright 2007 Xinxiang Medical College.All rights reserved.主讲主讲:袁建梅袁建梅E-mail:Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）掌握吸附剂和展开剂的选择与性质掌握薄层色谱法的定性和定量分析方法掌握纸色谱的基本原理熟悉平面色谱的分类及色谱参数了解高效薄层色谱法和薄层扫描法Chrmat graphycr

2、eatinga centralscience分析化学（药学专业）平面色谱法：组分在以平面为载体的固定相和流动相之间吸附或分配平衡而进行的色谱方法。优点：操作简便，分析速度快，结果直观，分辨能力高，仪器价廉。应用：定性分析，定量分析。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）第一节 平面色谱法的分类和原理一、平面色谱法的分类薄层色谱法（TLC）纸色谱法（PC）薄层电泳法（TLE）Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）L0L1L2比移值Rf：组分迁移距离与流动相迁移距离之比。AB-.二、平面

3、色谱法参数（一）定性参数Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）Rf值在01之间；各组分Rf值相差越大，分离越好；Rf值是分离组分的特征常数，与固定相、流动相、操作条件有关；同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）相对比移值Rr：参考物可是试样中的组分，也可以是另外加入的物质；Rr值可大于1或小于1；Rr值可消除因操作条件不同而带来的误差；L(s)L(i)-被测物参考物Chrmat graphycreatinga centralscienc

4、e分析化学（药学专业）（二）相平衡参数1.分配系数和保留因子2.K、k与Rf的关系设R为单位时间内一个分子在流动相中出现的几率；设1-R为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率；Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）定时展开保留比Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）Rf为1时，k0，说明该组分在固定相上无保留；而当Rf趋于0时，k趋于无穷大，说明该组分完全被固定相保留；组分不同，K不同，Rf不同；测出Rf，已知Vm/Vs，则可测出K；实验条件固定，Vs和Vm固定，Rf由K决定，K只

5、与组分性质一定，即Rf只与组分性质决定，因此，Rf是定性参数2.K、k与Rf的关系Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（三）面效参数1.理论塔板数 n2.塔板高度 HChrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（四）分离参数1.分离度 R2.分离数 SNdXFW1 W2W1 W2ABd平面色谱分离度示意图Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）TLC是将固定相平铺于玻璃板、塑料或铝片等光洁表面上制成薄层板，在此薄层板上进行色谱分离的方

6、法。第二节 薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）通过与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，可以进行药品的鉴别、杂质的检查或含量的测定。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）溶剂前沿起始线A B 1cm1cmUVA B 展开(development)Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）分离能力强，斑点集中灵敏度高展开时间短试样预处理简单仪器简单，操作方便

7、特点：Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）一、薄层色谱法的主要类型（一）吸附薄层色谱法（二）分配薄层色谱法 1.正相薄层色谱法 2.反相薄层色谱法Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 颗粒小（粒度550m，200250目）；均匀 一般为白色；常用的固定相：硅胶：硅胶H、硅胶G、硅胶GF254 氧化铝：氧化铝G、氧化铝H、氧化铝HF254 聚酰胺等（一）吸附剂Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业

8、）1.硅胶吸附能力决定于硅醇基数，吸附活性取决于含水量。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）硅胶含水量（硅胶含水量（%）活性分级活性分级 氧化铝含水量（氧化铝含水量（%）03152538I0361015活性级别越大活性级别越大,含水量越多含水量越多,吸附能力越小吸附能力越小,活性越小活性越小活性活性活性级别活性级别Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）2.氧化铝 由氢氧化铝高温脱水制得。具有分离能力强、活性可以控制等优点。按制备条件不同，分为酸性、中性、碱性氧化铝。Acidic:-

9、Al-OHNeutral:-Al-OH +-Al-O-Basic:-Al-O-Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物质，色谱常用的是聚己内酰胺。利用酰胺基与化合物质子给体形成氢键而产生吸附。3.聚酰胺Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）吸附剂选择的基本原则：吸附剂选择的基本原则：分离弱极性物质，一般选用活性较强的吸附剂；分离弱极性物质，一般选用活性较强的吸附剂；分离强极性物质，一般选用活性较弱的吸附剂。分离强极性物质，一般选用活性较弱的吸附剂。Chr

10、mat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（二）展开剂常用的流动相极性顺序：水甲醇乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯三氯甲烷乙醚苯四氯化碳环己烷石油醚流动相：单一、二元、多元展开剂（1）被分离物质（2）固定相（硅胶、氧化铝活度级）（3）展开剂选择原则：综合考虑被分离组分性质、展开剂极性、吸附剂活度。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（一）薄层板的制备 软板、硬板、烧结玻璃板 硬板的制备：薄层板的选择 薄层板的涂布 薄层板的活化三、薄层色谱操作方法 固定相厚度可依据上样量的要求确定，越厚容量越大，但分离

11、效率越低。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（二）点样手动点样将样品溶液滴加到薄层板上的操作；溶解样品的溶剂，点样量，正确点样方法。自动点样仪Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（三）展开和展开剂的流速1.展开剂的流速 经典的TLC中流动相的驱动力仅为吸附剂的毛细作用。显然，由粗颗粒制成的薄层板，展开剂迁移速度较快；而颗粒均匀、细密的薄层板，展开剂移动速度较慢。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）2.展开单向线性展开双向

12、线性展开环形展开向心展开多次展开(1)(2)Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）边缘效应：指同一组分的斑点在薄层中部比在边缘的移动速度要慢的现象。使展开室中溶剂蒸气达到饱和；薄层两侧边缘固定相刮去12cm；采用特别狭窄的展开室；消除方法：Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（四）斑点的确定 生物自显影：光学检出法：组分本身有颜色或有荧光（紫外灯下观察）蒸气显色法：试样与一些物质的蒸气生成色斑或产生荧光 试剂显色法：选择适当的显色剂使之生成色斑又称生物抑酶检出，检测具有生物活性的组

13、分Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（一）定性分析定性依据：相同色谱条件下同一物质的Rf值相同。定性方法斑点Rf及Rr值显色特性原位扫描联用技术四、定性和定量分析Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（二）杂质检查1.杂质对照品比较法2.主成分自身对照法Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（三）定量分析2.目视定量法 根据斑点大小和颜色深浅估计样品组分的近似含量的方法。1.洗脱法 样品经薄层色谱分离后，收集样品斑点处的吸附

14、剂，然后用溶剂将斑点中的组分洗脱下来，再用适当方法进行定量测定。3.薄层扫描法Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）五、高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography，HPTLC）高效薄层色谱法是在薄层色谱的基础上，采用更细更均匀（粒度57m）的吸附剂制成的薄层板，因而提高了分离效果，比经典薄层色谱提高3倍，一次最多可完全分离40多种组分。是分离复杂物质的有效方法之一。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）7 78 86 65 5

15、3 34 42 21 1Two-dimension HPTLC High-performance thin layer chromatographyC/M/NH3 95:5:0.8C/A/M/HAc/H2O 8:1.5:0.25:0.25:0.2C:CHCl3；M:CH3OH；A:CH3COCH3Steroids 类固醇1.progesterone2.11-deoxycorticosterone3.11-dehydrocorticosterone4.estrone5.estrasiol6.11-deoxycortisol7.hydrocortisone8.corticosteroneChrma

16、t graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）（一）薄层色谱扫描法基本原理以一定强度波长的光照射薄层板上被分离组分的斑点，测定斑点对光吸收的强度或发出荧光强度，进行定量分析的方法。六、薄层扫描法简介测定波长与参比波长的选择 测定波长：被测组分的最大吸收波长；参比波长：吸收峰临近基线处的波长。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）薄层扫描方法透射法 空白薄层透光率：T0i0/I0 斑点透光率：Ti/I0 被测组分斑点吸光度：Alg(T/T0)=(T0/T)特点：光强度大，但受薄层厚度、均匀度影响较大，应

17、用少。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）薄层扫描方法反射法 空白薄层反射率：R0j0/I0 斑点反射率：Rj/I0 被测组分斑点吸光度：Alg(R/R0)=lg(R0/R)特点：重现性好，基线稳定，受薄层厚度、均匀度影响较小，光强度小，应用多。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）散射参数的选择非线性关系的校正选择合适的散射参数定量分析方法外标一点法外标两点法Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）样品分析饮料中咖啡因测定谱图

18、，咖啡因的信号在23.2 mm。顶部是色谱图，旁边是咖啡因的光谱。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）定性鉴定 样品用量少、分离方便、分离时间短、检出灵敏度高。药品的质量控制和杂质检查化学反应进程的控制、反应副产物的检出以及中间体的分析。柱色谱法分离条件的探索七、薄层色谱的应用及实例Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）硝基卡因普鲁卡因还原判断合成反应进行的程度 1 2 3 4 硝基卡因和普鲁卡因的薄层色谱1.盐酸普鲁卡因对照品 2.硝基卡因3.还原2小时取样（硝基卡因斑点消失）4

19、.还原3小时Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）硫酸长春碱的杂质检验(中国药典2000版二部)色谱条件：固定相：硅胶GF254板展开剂：石油醚-氯仿-丙酮-二乙胺(12:6:1:1)检 测：紫外灯(254nm)照射硫酸长春碱中杂质的限度检查1硫酸长春碱样品 2.对照品12Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）药品中特殊杂质的检查杂质种类一般杂质：指在自然界中分布广泛，在多种药物的生产或贮存过程中容易引入的杂质。如水分，酸碱盐，重金属，残留溶剂等。特殊杂质：指在该药物的生产或贮存过程

20、中，根据药物的性质、生产方法和工艺条件，有可能引入的杂质。即：一般杂质在不同药物中共有。不同药物的特殊杂质不同。我国药典2005年版一部中薄层色谱鉴别方法1523 项。Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）我国药典2005年版一部中薄层色谱鉴别方法1523 项。1.杂质对照品法 适用于杂质已知并有杂质对照品的情况。方法 根据杂质限量，取供试品溶液和一定浓度的杂质对照品溶液，分别点于同一薄层板上展开，定位后进行检查。供 对药品中特殊杂质的检查Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）适用于

21、杂质的结构不能确定或无杂质对照品的情况.2.供试品自身对照法（高低浓度对照法）例：氢化可的松中“其他甾体”检查供试液：3mg/mL对照液：60g/mL(供试液稀释50倍)判断：供试液的杂质斑点数3个，且供试液的杂质斑点颜色对照液主斑点颜色。供 对Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）HPLC和和TLC比较比较Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）Chrmat graphycreatinga centralscience分析化学（药学专业）纸色谱法：以滤纸为载体，以吸附于纸上的水作固定相，属于分配色谱。第三节 纸色谱法（paper chromatography，PC）实验方法：滤纸选择点 样展 开定 位定 性定 量质地均匀，有一定的机械强度；纸纤维松紧适宜；纸质应纯，无明显的荧光斑点。常用的展开剂是含水的有机溶剂，如正丁醇、正戊醇、酚等。