兰州大学 -碱性磷酸酶结构与活性的研究及DNA化学酶、MoFeco的模拟合成.pdf

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1、兰州大学博士学位论文碱性磷酸酶结构与活性的研究及DNA化学酶、MoFeco的模拟合成姓名：陈凤娟申请学位级别：博士专业：化学 无机化学指导教师：曾正志20091201碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博士学位论文中文摘要生命体的一切物质变化和能量变化都是在酶的作用下进行的，因此酶学研究对于认识生命活动的本质和规律无疑是十分重要的。本论文介绍了酶学研究的进展，酶的催化机制、研究方法和分子酶学、功能酶学及应用酶学的研究现状。综述了碱性磷酸酶、限制性内切酶、固氮酶等的结构功能、研究概况及发展前景，提出了本论文的选题目的和意义。通

2、过I C P 、荧光光谱研究了不同p H 值及不同浓度时，C 0 2 + 离子对牛小肠碱性磷酸酶( c a l fi n t e s t i n ea l k a l i n ep h o s p h a t s a e ，C I P ) 活性中心Z n 2 + 和M 孑+ 离子的取代作用。实验发现，随着C 0 2 + 离子浓度的增加，C I P 活性中心的Z n 2 + 离子含量逐渐降低，直至被完全取代；M 孑+ 离子含量呈现先降低后又升高；以及随p H值升高，对z n 2 + 和M 孑+ 离子的取代作用增强等现象。通过C D 光谱研究了氯化钴取代C I P 活性中心金属离子对C I P 二

3、级结构的影响，首次得到了不同取代条件下C I P 平均二级结构含量。采用紫外光谱研究不同条件下C I P 的活性发现，随着Z n 2 + 离子逐渐被取代，C I P 的酶活性也逐渐降低。证实C I P 的酶催化作用主要由Z n 2 十离子承担，M 孑+ 离子则对C I P 二级结构的稳定性有着重要作用。通过荧光光谱、C D 光谱以及紫外可见光谱等研究了盐酸胍失活C I P 肽链的再折叠及活性恢复的动力学过程，观察了不同L a 3 + 离子浓度对再折叠以及活性恢复动力学过程的影响。实验显示，在p H 为8 0 条件下，C I P 肽链可以再折叠，同时有6 0 7 0 活性可以恢复。通过再折叠动力

4、学常数以及活性恢复常数的计算表明，随着口+ 离子浓度的增加，二级结构的恢复及C I P 酶活性的恢复都出现逐渐加快的现象，表明失活C I P 再折叠过程与活性恢复过程具有一致性。为研究蛋白质结构与功能关系提供一定的理论依据。采用分子自组装方法，合成了三种三元混合配体的配合物，单晶测定表明其化学组成分别为：【M n ( N - m e t h y l - i m i d a z o l e ) 2 ( 1 比l , 3 - N 3 ) 2 ， C u ( D M A P ) 2 ( S C N ) E ( D M F ) 2 】和 C u ( D M A P ) 2 ( S C N ) 2 。通

5、过紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、粘度分析和循环伏安等方法，研究了生理条件下，配合物与D N A 的相互作用和对P B R 3 2 2 质粒体D N A 的切割作用。结果表明，锰配合物与D N A 以沟面模式结合，对P B R 3 2 2I V碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州人学博士学位论文质粒体D N A 有一定的切割作用；铜配合物均与D N A 以插入模式结合，对P B R 3 2 2质粒体D N A 有较好的切割作用。2 0 0 2 年获得分辨率为1 1 6A 固氮酶活性中心M o F e - c oX 射线晶体衍射图，

6、其电子密度图显示M o F e C O 中心存在一个P 区元素，该元素可能是C 、N 、O 或者B 。根据这一实验结果，本文开展了中心原子为N 的铁钼辅基( F e M o c o ) 的模拟合成研究，已合成了一系列的F e - z - N - ( C O ) x 、F e - a - N ( C O ) x S 簇C p -M o ( C O ) x 、C p M o ( C O ) x S 簇化合物，为进一步模拟合成F e M o C , O 奠定了基础。关键词：牛小肠碱性磷酸酶，钴离子，二级结构，活性，再折叠，活性恢复，铜配合物，锰配合物，D N A ，机理，D N A 限制性内切酶，紫

7、外可见吸收光谱，荧光光谱，圆二色谱，粘度，循环伏安，F c M o c 0V碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、g o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博上学位论文A b s t r a c tA l lo ft h em a t e r i a la n de n e r g yc h a n g eo ft h el i f ew e r ec a r r i e do u tu n d e rt h ea c t i o no ft h e 廿l z y m e ，a n dt h e r e f o r et h er e s e a r c ho fe

8、n z y m o l o g yi su n d o u b t e d l yi m p o r t a n tf o ru n d e r s t a n d i n gt h en a t u r eo ft h e l i f e T h i s t h e s i si n v e s t i g a t e st h ep r o g r e s so ft h ee n z y m e , t h ee n z y m e Sc a t a l y t i cm e c h a n i s m ，r e s e a r c hm e t h o d s a n dm o l e

9、 c u l a re n z y m o l o g y , f u n c t i o n sa n da p p l i c a t i o no fc n z y m o l o g y A no v e r v i e wo ft h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fa l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，r e s t r i c t i o nc n d o n u c l e a s ea n dn i t r o g e n a s e C o b a l ti so n eo fe s s

10、 e n t i a lm i c r o e l e m e n t si nm a n yb i o l o g i c a lp r o c e s s e sa f f e c t i n gt h ea c t i v i t yo fm a n ye n z y m e s O u ri n v e s t i g a t i o n sr e v e a lt h a tZ n 2 + a n dM 9 2 + ，w h i c ha r ei nt h ea c t i v es i t eo fn a t i v ec a l fi n t e s t i n ea l k

11、a l i n ep h o s p h a t a s e ( c I P ) ，C a nb er e p l a c e db yC 0 2 + i ns o l u t i o nd i r e c t l y T h ee f f e c to fC 0 2 + c o n c e n t r a t i o no nt h es u b s t i t u t er e a c t i o nw a se x a m i n e dO V e rt h er a t i oo f C 0 2 + c I P f r o m0 ：1t o8 ：1 T h eq u a n t i t

12、 yo fZ n 2 + i nC I Pw a sd e c r e a s e dd u r i n gt h ew h o l ec o u r s e ，b u tt h eM 矿十w a sc h a n g e di n r e g u l a r l y As e r i e so fa c t i v es i t em o d e l so fC I Pw h i c hs h o w i n gt h er e a c t i o nm e c h a n i s mw e r ep r o p o s e d C o m p a r a t i v es t u d yo

13、 ft h ep He f f e c t i o no nt h er e a c t i o ns h o w e dt h a tt h el o wp HW a sf a v o r a b l ef o rC 0 2 + r e p l a c i n gM g + T ou n d e r s t a n dh o wt h er e a c t i o na f f e c tt h ee n z y m e ，w ea l s os o l v e dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fC I Pf o rt h ef i r s

14、 tt i m ea f t e rr e a c t e dw i t hC 0 2 + i nd i f f e r e n tc o n d i t i o nb yt h eC Ds p e c t r a C 1 PW a se x t e n s i v e l yd e n a t u r e di n3 Mg u a n i d i n eh y d r o c h l o r i d e ( G d n H C l )s o l u t i o nf o r2h T h i sr e s e a r c hi n v e s t i g a t e dt h ec o u r

15、 s e so fb o t ht h er e f o l d i n ga n dt h er e a c t i v a t i o ni nt h ea b s e n c ea n dp r e s e n c eo fL a 3 + i o n sb yt h ef l u o r e s c e n c e ，U V ，a n dC Ds p e c t r a U n d e rs u i t a b l er e n a t u r a t i o nc o n d i t i o n s ，a b o u t6 0 - 7 0 o ft h ea c t i v i t y

16、W a sr e c o v e r e di nt h ea b s e n c ea n dp r e s e n c eo fd i f f e r e n tL a 3 + c o n c e n t r a t i o n s T h e r er e f o l d i n ga n dt h er e a c t i v a t i o np r o c e s s e sw e r em o n o p h a s i ca f t e rd i l u t i o ni np r o p e rs o l u t i o n s 谢mo rw i t h o u tL a 3

17、 + T h eL a 3 + a f f e c t e db o t ht h er e a c t i v a t i o na n dt h er e f o l d i n gc o u r s e so fu n f o l d e dC I P Ac o m p a r i s o no fr a t ec o n s t a n t sf o rt h er e f o l d i n go fu n f o l d e dC I Pw i mt h o s ef o rr e c o v e r yo fe n z y m ea c t i v i t ya td i f f

18、 e r e n tV l碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州人学博士学位论文L a 3 + c o n c e n t r a t i o n ss h o w e dt h a tt h e yw e r es y n c h r o n i z e d B o t ho ft h et w op r o c e s s e ss p e e d e du pd u et oi n c r e a s i n gt h ec o n c e n t r a t i o n so fL a 3 + i o n s T h i

19、sr e s u l ti sv e r yi m p o r t a n tf o rt h es t u d yo ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fp r o t e i n A c c o r d i n gt ot h em e t h o r do fs e l f - a s s e m b l e d ，t h r e en e wk i n d so fc o m p l e x e s M n ( N - m e t h y l i m

20、 i d a z o l e ) 2 ( I t 1 ，3 - N 3 ) 2 ， C u ( D M A P ) 2 ( S C N ) 2 ( D M F ) 2 】a n d【C u ( D M A P ) 2 ( S C N ) 2 】w e r es y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yt h eX - R a yd i f f r a c t i o na n a l y s i s I n v e s t i g a t e dt h e i rD N A - b i n d i n ga c t i v i t

21、 yb yU V ，C D ，f l u o r e s c e n c es p e c t r a ,v i s c o m e t r i ct i t r a t i o na n dv o l t a m e t r i cs t u d i e s T h er e s u l t ss h o wt h a tt h eM n - c o m p l e xb o n dt oC TD N Ab yag r o o v em o d ea n dt h ec o m p l e xo fc o p p e rb o n dt h eC TD N Aw i t ham o d eo

22、 fi n t e r c a l a t i o n T h ea b i l i t yt oc l e a v a g eD N Ao ft h e s ec o m p l e x e sW e r er e s e a r c h e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d ，a n dt h er e s u l ts h o wt h a tb o t ho ft h ec o m p l e x e sc a l lc l e a v a g eD N A T h ec o m p l e x

23、o fc o p p e ri sb e t t e rt h a nM n c o m p l e x T h i sm e t h o do fD N Ac l e a v a g ew h i c hr e a c t i o nc o n d i t i o nW a st e n d e ra n ds i m i l a rt op h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o ni sb e n e f i c i a lt of u r t h e rd e v e l o pt h en e wt e c h n i q u eo fD N A

24、c l e a v a g e Ah i g h - r e s o l u t i o n ( 1 1 6A ) X - r a ys t r u c t u r eo ft h en i t r o g e n a s em o l y b d e n u m i r o n( M o F e ) p r o t e i nr e v e a l e de l e c t r o nd e n s i t yf r o mas i n g l eN ，O ，o rCa t o m ( d e n o t e dX )i n s i d et h ec e n t r a li r o np

25、 r i s m a n e ( 6 F e ) o ft h e M o F e 7 S g ：h o m o c i t r a t e F e M o - c o f a c t o r( F e M o c o ) A c c o r d i n gt ot h i sr e s u l t ，as e r i e so fF e - 2 - N - ( C O ) x 、F e - z - N - ( C O ) x Sc l u s t e r sw i t ht h ec e n t e ra t o mo fNa n dC p M o - ( C O ) x 、C p - M

26、o 一( C O ) x - Sw e r es y n t h e s i z e dw h i c hp r e p a r e df o r t h ef u r t h e rr e s e a r c ho fF e M o c os y n t h e s i s K e y w o r d s ：C a l fi n t e s t i n ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，C o b a Ri o n ，S e c o n d a r ys t r u c t u r e , A c t i v i t y ,R e f o l d

27、i n g ，R e a c t i v a t i o n ，C o p p e rc o m p l e x ，M a n g a n e s ec o m p l e x ，D N Ab i n d i n gm e c h a n i s m ，D N Ac l e a v a g e ，U l t r a v i o l e ts p e c t r u m ，F l u o r e s c e n c es p e c t r u m ，C i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r u m ，V i s c o m e t r i ct i

28、 t r a t i o n , V o l t a m e t r i cs t u d i e s ，S t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ，F e M o c oV I I碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博士学位论文心E A PC m“ I r i sS e rA r gA s pA 1 aH i sG l u1 1 ：l rp - N P PD N AE BD M A _ PU V - V i sC DC pI RN M R缩写列表碱

29、性磷酸酶大肠杆菌碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶三羟甲基氨基甲烷丝氨酸精氨酸天冬氨酸丙氨酸组氨酸谷氨酸苏氨酸对硝基苯酚磷酸酯二钠盐小牛胸腺脱氧核糖核酸溴化乙锭N ，N ，- 二甲基甲酰氨紫外可见吸收光谱圆二色谱环戊二烯红外光谱核磁共振原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：匪亟净E l 期：

30、关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：) 盗旦绉导师签日期俨彭碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8

31、兰州大学博士学位论文第一章绪论1 1 酶学及其研究发展历史1 1 1 酶及酶学简介新陈代谢是生命活动的基础，而构成新陈代谢的一系列复杂而有规律的物质变化和能量变化都是在酶的催化下进行的。生物的生长、发育、繁殖、运动等一切生命活动都与酶的催化过程紧密相关。可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。因此，酶学研究对于人类认识生命活动的本质和规律，无疑具有十分重要的作用。酶是一种具有生物活性的蛋白质，有单纯酶和结合酶两种。单纯酶只含蛋白质，不含其它物质，其催化活性仅由蛋白质的结构决定。结合酶则由单纯蛋白质和辅基组成，辅基是结合酶催化活性中不可缺少的部分。酶学是研究酶的性质、酶的结构、酶的作用规律

32、和作用原理、酶的生物学功能及酶的应用的科学【l 】。现代生命科学的兴起，有赖于生物化学的发展；而生物化学发展，以酶蛋白质核酸的研究为主流。直至当代，遗传工程的诞生，则是以限制性内切酶的发现为开端。酶的本质是催化剂。与一般无机物或低分子有机催化剂相比，有以下特性 2 】：催化效率高，酶催化反应的速率，比一般催化剂高1 0 7 1 0 1 3 倍；酶催化专一性强，一种酶只能催化某一种或某一类反应，如淀粉酶只对淀粉的水解起催化作用；酶在机体内受到严格的调控，只能在体温条件下温和地进行。酶对环境极为敏感；而且需要随着环境和身体情况的变化而随时自动地进行精密地调节机体内不同反应体系的酶，采取不同方式进行

33、调控；酶是蛋白质，具有蛋白质的性质。酶也有它们自身的特性，酶是生物催化剂，脱离生物机体后仍具有活性。国际酶学委员会( I E C ) 规定，按酶促反应的性质，可把酶分成六大类：1 水解酶类指催化底物发生水解反应的酶类。例如、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶等。2 裂解酶类( 1 y a s c s ) 指催化一个底物分解为两个化合物或两个化合物合成为一碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、- l o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博士学位论文个化合物的酶类。例如柠檬酸合成酶、醛缩酶等。3 氧化还原酶类指催化底物进行氧化还原反应的酶类。例如，乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、

34、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等。4 转移酶类指催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类。如转甲基酶、转氨酸、己糖激酶、磷酸化酶等。5 合成酶类指催化两分子底物合成为一分子化合物，同时还必须偶联有A T P的磷酸键断裂的酶类。例如，谷氨酰胺合成酶、氨基酸：t R N A 连接酶等。6 异构酶类指催化各种同分异构体之间相互转化的酶类。例如，磷酸丙糖异构酶、消旋酶等。本论文所重点研究的碱性磷酸酶活性中心金属离子对该酶结构与活性的影响、以及D N A 切割酶、固氮酶活性中心的模拟。1 1 2 酶学研究发展史1 7 7 3 年，意大利科学家斯帕兰扎尼设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让

35、鹰吞下去。过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。但是什么，他不清楚。1 8 3 6 年，德国科学家施旺从胃液中提取出了消化蛋白质的物质。解开胃的消化之谜。1 9 2 6 年，美国科学家萨姆钠从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。2 0 世纪3 0 年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋自质。2 0 世纪8 0 年代，美国科学家泰勒和奥特曼发现少数R N A 也具有生物催化作用。酶学研究目前沿着两个方向发展，一是从1 8 9 4 年开始的酶的应用研究。发展了固定化酶技术，并将它们投入了

36、不同规模的生产。另一方面，则是从事理论研究。另外一些学者则更侧重于酶的生物学研究，酶工程学的任务是要解决如何有效地进行酶的生产，进一步开发固定化酶技术与酶反应器。深入地揭示酶结构与功能的关系，催化与调节机制；揭示酶与生命活动的关系，进一步设计酶、改造酶；在基因水平上进行酶的调节和控制是酶的分子生物学的研究任务。例如：H i l l 和M e y c r h o f 等确立了糖酵解系统；K r c b s 等建立了三羧酸循环；J a c o b 、L w o f f2碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州人学博士学位论文和M o n

37、 o d 提出了酶合成调节机制操纵子学说；A r b e r t 、S m i t h 和N a t h a n s 对限制性内切核酸酶的作用及应用作了奠基的工作【3 1 。1 2 酶催化原理1 2 1 催化功能的结构基础理解酶的催化原理，首先应该从酶的结构分析入手，因为其特殊的功能必定是由其特殊的物理结构决定的。酶的分子结构的基础是其氨基酸的序列，它决定着酶的空间结构和活性中心的形成以及酶催化的专一性。如哺乳动物中的磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸残基序列几乎完全相同，说明相同的一级结构是酶催化同一反应的基础。又如消化道的糜蛋白酶，胰蛋白酶和弹性蛋白酶都能水解食物蛋白质的肽键，但三者水解的肽键有各自

38、的特异性，糜蛋白酶水解含芳香族氨基酸残基提供羧基的肽键，胰蛋白酶水解赖氨酸等碱性氨基酸残基提供羧基的肽键，而弹性蛋白酶水解侧链较小且不带电荷氨基酸残基提供羧基的肽键。这三种酶的氨基酸序列分析显示4 0 左右的氨基酸序列相同，都以丝氨酸残基作为酶的活性中心基团，三种酶在丝氨酸残基周围都有G l y - A s p S e r - G l y - P r o 序列，X 线衍射研究提示这三种酶有相似的空间结构，这是它们都能水解肽键的基础。而它们水解肽键时的特异性则来自酶的底物结合部位上氨基酸组成上有微小的差别所致。对酶结构的研究包括以下几个方面。酶的相对分子质量：酶的化学本质是蛋白质，研究蛋白质的结

39、构首先应了解其相对分子质量。测定方法有S D S 聚丙烯酰胺胶电泳法、胶过滤法、超离心法等。酶的氨基酸组成：酶的氨基酸组成分析包括三个基本程序：组成分离与分析、水解、氨基酸组成分析。酶的一级结构：一级结构是指构成酶蛋白肽链氨基酸的组成和排列顺序。经典的测定程序包括以下几步：肽链片段化、肽链片段的分离纯化、肽链片段的序列分析、酶总序列确定、二硫键定位。近年来，随着D N A 序列分析研究的发展，目前主要是通过D N A 的序列分析来确定特定蛋白质或酶的结构。酶的二、三级结构：所谓二、三级结构是指蛋白质或酶分子在不同水平上构建的三维结构。其中二级结构是指肽链相邻区段，借助氢键等沿轴向方向建立起来的

40、折叠和螺旋；二级结构的测定主要借助旋光色散( o p t i c a lr a t a t o r y3碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博士学位论文d i s p e r s i o n ，O R D ) 和圆二色性( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，C D ) 技术；三级结构是指在二级结构的基础上，肽链进一步地折叠与盘绕，这样在多肽链中原来相距较远的序列也有可能集中到一个区域内，三级结构则可借助分光光度法( s p e c t r o p h o t o m e t r y ) ，更

41、有效的则是X 衍射技术( X - r a yc r y s t a l l o g r a p h y ) 。酶的四级结构：二聚体以上的酶具有四级结构。大多数酶都是由多个亚基组成的寡聚体，亚基间的联结排列就是蛋白质的四级结构。X 衍射分析表明，亚基排列的一般规律是能最大地增加亚基间的接触位点数。多亚基存在的意义能为酶的催化活性提供调节基础：为酶提供多种催化功能；增加酶的稳定性。酶的活性中心：酶活性中心的一些化学基团为酶发挥催化作用所必需。但在活性中心以外的区域，尚有不和底物直接作用的必须基团，这些基团与维持整个酶分子的空间构象有关，间接地对酶的催化活力发挥其必不可少的作用。对需要辅助因子的酶来

42、说，辅助因子也是活性中心的组成部分。酶催化反应的特异性实际上决定于酶活性中心的结合基团、催化基团及其空间结构。酶属生物大分子，分子质量至少在1 万以上，大的可达百万。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。一个值得注意的问题是酶所催化的反应物即底物，却大多为小分物质它们的分子质量比酶要小几个数量级。酶的活性中心只是酶分子中的很小部分，酶蛋白的大部分氨基酸残基并不与底物接触。组成酶活性中心的氨基酸残基的侧链存在不同的功能基团，如- N H 2 、C O O H 、S H 、O H 和咪唑基等，它们来自酶分子多肽链的不同部位。有的基团在与底物结

43、合时起结合基团的作用，有的在催化反应中起催化基团的作用。但有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团。它们通过多肽链的盘曲折叠，组成一个在酶分子表面、具有三维空间结构的孔穴或裂隙，以容纳进入的底物与之结合并催化底物转变为产物，这个区域即称为酶的活性中心。1 2 2 酶反应历程与方式酶反应的进行首先要求酶和底物结合形成酶底物中间络合物，然后酶再催化底物进行转化，分出产物，同时酶恢复原状并参加下轮催化。由于中间络合物的形成，酶和底物的结构都将发生有利于反应的变化，因而反应能高速地进行 6 1 。4碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F

44、e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博士学位论文络合物的形成是专一性决定的过程，也是变分子间反应为分子内反应的过程，同时又是一个诱导契合过程。l 、酶底物络合物最初酶底物络合物是一个假设的理论，但随着检测技术的不断完善，已有多种方法可以检测到此种中间状态的络合物，为酶催化机理提供了理论证据。( 1 ) 动力学方法包括稳态前动力学分析和稳态动力学分析。稳态动力学测定有三类方法：温度跃迁法、快速扫描法、压力跃迁法和快速流管法。( 2 ) x 衍射分析法该方法除了能够提供大量酶结构、活性中心各基团的相对位置以及活性中心组成等有关信息外，还能指示酶与底物结合方式以及伴随底物结合可能引起的酶和

45、底物在构象上的变化。是最有价值的一种方法之一。( 3 ) 迁移性态检测法该方法的原理是酶与底物形成络合物后，它们的电学性质、分子大小不同于原来的酶，从而得到区分。包括凝胶过滤法、电泳法、透析平衡法与沉降法。( 4 ) 光学方法其原理是酶与底物结合形成络合物后能引起微环境的变化，从而导致酶分子上的发色基团的光吸收与荧光特性发生相应的改变。包括旋光色散法、圆二色性法吸收光谱法。( 5 ) 磁共振方法其原理是金属酶中的金属、底物的正电子在酶与底物结合后，可能产生磁共振性质的变化。包括核磁共振与顺磁共振法。2 、酶反应历程与反应方式的特点( 1 ) 酶的作用方式酶和底物以两种不同的方式参加反应：为底物

46、的进一步转化提供场所；本身直接介入转化。可以利用旋光转向法或同位素交换法来分析来确定酶究竟以哪种方式参与反应。( 2 ) 酶与底物多点结合5碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、L t o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博士学位论文酶在发挥其催化作用时，酶和底物间必定有多点结合，酶与含有不对称碳原子的化合物作用时，都能表现出高度的立体专一性。同时通过x 衍射分析也进一步证明了这一点。( 3 ) 酶底物络合物的形成与分解酶催化反应过程包括两个部分即：络合物形成和分解。如下式：E + s 喜E s 与E + P丘1 - 11 2 3 酶的专一性目前有各种关于酶的作用专

47、一性机制学说。其共同点是：酶要表现作用专一性必须通过它和底物结合。酶表现作用专一性的基础是酶的活性中心，不仅要求结合基团与催化基团的存在，而且要求它们有特定的构象分布。1 、“诱导契合”与酶的柔顺性学说吲K o s h l a n d 提出了诱导契合学说。他认为，酶和底物在接触之前，两者并不是完全契合的，只有当底物和酶的结合部位结合之后，产生了相互诱导，酶的构象发生了微妙变化，结合基团和催化基团转入了有效的作用位置，酶与底物才完全契合，酶才能高效的催化反应。至今已有大量实验事实支持此种学说。另外，各种光谱分析、x 衍射分析以及核磁共振分析表明，游离酶和酶底物络合物在结构上往往不同，即伴随着底物

48、与酶的结合，酶的构象可能发生某些变化。证明，酶在一定程度上是柔顺可变的。2 、酶的“锁和钥匙”与刚性学说F i s h e r 早在1 8 9 0 年，就提出了“锁和钥匙”学说来解释酶的作用专一性。该学说的特点是：其前提是酶分子具有确定的结构与构象，并具有一定的刚性。这一学说有相当的事实支持，至今仍是很好的催化理论。他认为酶和底物间存在着互补的结构特征，只有那些符合这种特征要求的底物才能和酶结合，并被酶催化转化。如图1 1 所示，这种关系可以形象地描述为“一把钥匙开一把锁”。6碱性磷酸酶结构与活性的研究及D N A 化学酶、M o F e c o 的模拟合成2 0 0 8 兰州大学博士学位论文

49、底物酶酶一底物络台物图1 1 “锁和钥匙“ 学说示意图F i g u r e1 1T h es c h e m a t i cf i g u r eo f “ l o c ka n dk e y “ t h e o r y3 、过渡态与扭曲学说该学说综合了前两种学说的特点，过渡态学说，认为：任何一个化学反应的进行都必须经过活性中间络合物阶段或者说过渡态阶段，而且，反应的速度与过渡态底物的浓度成比例；酶的活性中心对过渡态底物有更好的互补性，即酶和过渡态底物有更强的结合力。扭曲理论与“锁和钥匙”有相通之处，过渡态理论则和诱导契合学说有相通之处。由于获得了大量的过渡态底物类似物，过渡态学说得到了有力的支持。1 2 4 酶的催化机制酶的催化机理和一般化学催化剂基本相同，也是先和反应物( 酶的底物) 结合成络合物，通过降低反应的能来提高化学反应的速度，在恒定温度下，化学反应体系中每个反应物分子所含的能量虽然差别较大，但其平均值较低，这是反应的初态。S ( 底物) 一P ( 产物) 这个反应之所以能够进行，是因为有相当部分的S 分子已被