RNA干扰技术原理及应用ppt课件.ppt

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1、为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能RNAi的发现的发现19951995年年，Guo Guo S S等等试试图图阻阻断断秀秀丽丽新新小小杆杆线线虫虫（C.elegansC.elegans）中的）中的par-1par-1基因的表达。基因的表达。设计：设计：反义反义RNA RNA 特异性地阻断特异性地阻断par-1par-1基因的表达；基因的表达；正义正义RNA RNA 以期观察到基因表达的增强。以期观察到基因表达的增强。结果结果:二二者者都都同同样样地地切切断断了了par-1par-1基基因因的的表表达达途途径径。这这是是

2、与与传传统统上上对对反反义义RNARNA技技术术的的解解释释不不相相符符合合。该该研研究究小小组组一一直直没没能能给给这这个个意意外外以以合合理理解释。解释。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能RNAi的提出的提出直直到到1998年年2月月，Fire A和和Mello C才才首首次次揭揭开开这这个个悬悬疑之谜。疑之谜。他他们们将将体体外外转转录录得得到到的的单单链链RNA纯纯化化后后注注射射线线虫虫时时发发现现，基基因因抑抑制制效效应应变变得得十十分分微微弱弱；而而经经过过纯纯化化的的双双链链RNA却却正正好好相相反反，

3、能能够够高高效效特特异异性性阻阻断断相相应应基基因的表达。因的表达。他他们们证证实实，Guo S博博士士遇遇到到的的正正义义RNA抑抑制制基基因因表表达达的的现现象象，以以及及过过去去的的反反义义RNA技技术术对对基基因因表表达达的的阻阻断断，都都是是由由于于体体外外转转录录所所得得RNA中中污污染染了了微微量量双双链链RNA而引起。而引起。该该小小组组将将这这一一现现象象称称为为RNA干干扰扰（RNA interference，简称简称RNAi）。）。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能RNAi广泛存在于自然界广泛存在

4、于自然界随后，随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。生物中。这种存在揭示了这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进很可能是出现于生命进化的早期阶段。化的早期阶段。随着研究的不断深入，随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。也越来越为人们所重视。1、RNAi 机制机制 为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻

5、全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能体外实验结果的提示体外实验结果的提示体体外外实实验验表表明明：RNAi反反应应中中，加加入入的的dsRNA被被切切割割为为21-23核核苷苷酸酸长长的的RNA片片段段，后后者者会会使使目目的的mRNA被切割为被切割为21-23核苷酸长的片段。核苷酸长的片段。从从已已经经发发生生RNAi的的果果蝇蝇S2细细胞胞中中，Hammond等等人人部部分分纯纯化化了了一一种种核核酸酸酶酶，该该核核酸酸酶酶具具有有序序列列特特异异性性，它它仅降解与引起仅降解与引起RNAi的的dsRNA具有同源序列的具有同源序列的mRNA。那那么么这这种种核核酸酸酶酶是是如如何何

6、确确定定哪哪些些mRNA该该降降解解而而哪哪些些不该呢？不该呢？由由于于在在纯纯化化该该核核酸酸酶酶时时，可可以以共共分分离离出出21-23核核苷苷酸酸长长的的dsRNA片片段段，这这暗暗示示该该核核酸酸酶酶对对mRNA的的切切割割有有可可能能是是以以这这些些片片段段作作模模板板指指导导进进行行的的。根根据据以以上上的的实实验验结果，人们提出一种结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。作用的简单模型。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能RNAi作用的简单模型作用的简单模型当当dsRNA导导入入细细胞胞后后，被被一一种种

7、dsRNA特特异异的的核核酸酸内内切切酶酶识识别别，切切割割成成21-23核核苷苷酸酸长长的的小小片片段段，这这些些片片段段可可与与该该核核酸酸酶酶的的dsRNA结结合合结结构构域域结结合合，并并且且作作为为模板识别目的模板识别目的mRNA。识识别别之之后后，mRNA与与dsRNA的的有有义义链链发发生生链链互互换换，原原先先dsRNA中中的的有有义义链链被被mRNA代代替替，从从酶酶-dsRNA复复合合物物中中释释放放出出来来，而而mRNA则则处处于于原原先先的的有有义义链链的的位位置。置。核核酸酸酶酶在在同同样样位位置置对对mRNA进进行行切切割割，这这样样又又产产生生了了21-23核核苷

8、苷酸酸长长的的dsRNA小小片片段段，与与核核酸酸酶酶形形成成复复合合物物，继继续续对对目目的的mRNA进进行行切切割割，从从而而使使目目的的基基因因沉沉默，产生默，产生RNAi现象。现象。通通过过遗遗传传分分析析的的方方法法，目目前前已已从从线线虫虫中中已已分分离离到到RDE-2,RDE-3和和Mut-7等等RNAi相关的基因。相关的基因。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能RNAi研究的一般技术路线研究的一般技术路线2、siRNA 的设计的设计为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大

9、会精神,充分发挥中小学图书室育人功能何为何为siRNAssiRNAs越越来来越越多多的的研研究究人人员员开开始始采采用用小小分分子子干干扰扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA即即为为能能够够以以同同源源互互补补序序列列的的mRNA为为靶靶目目标标并并将将其其降降解解而而介介导导RNA干干扰扰途途径径的的短短片片断断双链双链RNA分子。分子。如如何何设设计计有有效效的的siRNA一一直直是是当当前前RNAi研研究究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。的热点话题，不同的实验室有不同的结果。为深

10、入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能一般设计原则一般设计原则（1）从从mRNA的的AUG起起始始密密码码开开始始，寻寻找找“AA”二二连连序序列列，并并记记下下其其3端端的的19个个碱碱基基序序列列，作作为为潜潜在在的的siRNA靶靶位位点点。有有研研究究结结果果显显示示GC含含量量在在30%50%左左右右的的siRNA要比那些要比那些GC含量偏高的更为有效。含量偏高的更为有效。Tuschl等等 建建 议议 不不 要要 针针 对对 5和和 3端端 的的 非非 编编 码码 区区（untranslatedregions，UTRs

11、）。这这些些地地方方有有丰丰富富的的调调控控蛋蛋白白结结合合区区域域，而而这这些些UTR结结合合蛋蛋白白或或者者翻翻译译起起始始复复合合物物可可能能会会影影响响siRNP核核酸酸内内切切酶酶复复合合物物结结合合mRNA从而影响从而影响siRNA的效果。的效果。（2）将将潜潜在在的的序序列列和和相相应应的的基基因因组组数数据据库库（人人，或或者者小小鼠鼠，大大鼠鼠等等等等）进进行行比比较较，排排除除那那些些和和其其他他编编码码序序列列/EST同同源的序列。例如使用源的序列。例如使用BLAST（3）选选出出合合适适的的目目标标序序列列进进行行合合成成。通通常常一一个个基基因因需需要要设设计多个靶序

12、列的计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的，以找到最有效的siRNA序列。序列。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能负对照负对照一个完整的一个完整的siRNA实验应该有负对照。实验应该有负对照。作作 为为 负负 对对 照照 的的 siRNA应应 该该 和和 选选 中中 的的siRNA序序 列列 有有 相相 同同 的的 组组 成成，但但 是是 和和mRNA没有明显的同源性。没有明显的同源性。通通常常的的做做法法是是将将选选中中的的siRNA序序列列打打乱乱，同同样样要要检检查查结结果果以以保保证证它它和和其其他他基基因因

13、没没有同源性。有同源性。3、制备、制备siRNAs的方的方法法 为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（1）化学合成）化学合成尽尽管管化化学学合合成成是是最最贵贵的的方方法法，但但是是却却是是最最方方便便的的研研究究人人员员几几乎乎不不需需要要做做什什么么工工作作。许许多多公公司司都都可可以以根根据用户要求提供高质量的化学合成据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主主要要的的缺缺点点包包括括价价格格高高，定定制制周周期期长长，特特别别是是有有特特殊殊需求的。需求的。由由于于价价格格比比其其他他方方法法高高，为为一一个个

14、基基因因合合成成34对对siRNAs的的成成本本就就更更高高了了，比比较较常常见见的的做做法法是是用用其其他他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：最适用于：已经找到最有效的已经找到最有效的siRNA的情况下，需要的情况下，需要大量大量siRNA进行研究；进行研究；不适用于：不适用于：筛选筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是等长时间的研究，主要原因是价格因素价格因素为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（2）体外转录）体外转录 相相对对化化学学合合成成法法而而言言成成本本

15、比比较较低低，是是一一种种性性价价比比高高的的筛选筛选siRNAs的好方法。的好方法。更重要的是能够更快的得到更重要的是能够更快的得到siRNAs。值值得得一一提提的的是是体体外外转转录录得得到到的的siRNAs只只要要较较低低的的浓浓度就可以达到化学合成度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。较高浓度得到的效果。不不足足之之处处：实实验验的的规规模模受受到到限限制制，虽虽然然一一次次体体外外转转录录合合成成能能提提供供足足够够做做数数百百次次转转染染的的siRNAs，但但是是反反应应规模和量始终有一定的限制。规模和量始终有一定的限制。最最适适用用于于：筛筛选选siRNAs，特特别

16、别是是需需要要制制备备多多种种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。，化学合成的价格成为障碍时。不不适适用用于于：实实验验需需要要大大量量的的，一一个个特特定定的的siRNA。长长期研究。期研究。Figure.UseofChemicallySynthesizedandinVitroTranscribedsiRNAstargeting-ActintoInduceGeneSilencing.为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（3）用用RNaseIII消消化化长长片片断断双双链链RNA制备制备siRNA 其其他他制制备备s

17、iRNA的的方方法法的的缺缺陷陷是是需需要要设设计计和和检检验验多多个个siRNA序列以便找到一个有效的序列以便找到一个有效的siRNA。这这种种方方法法制制备备一一份份混混合合有有各各种种siRNAs“混混合合鸡鸡尾酒尾酒”就可以避免这个缺陷。就可以避免这个缺陷。这这个个方方法法是是选选择择通通常常是是2001000碱碱基基的的靶靶mRNA模模版版，用用体体外外转转录录的的方方法法制制备备长长片片断断双双链链dsRNA，然然后后用用RNase III(or Dicer)在在体体外外消消化化，得得到到一一众众siRNAs“混合鸡尾酒混合鸡尾酒”。在在除除掉掉没没有有被被消消化化的的dsRNA后

18、后，这这个个siRNA混混合合物物就可以直接转染细胞，方法和单一的就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。转染一样。由由于于siRNA混混合合物物中中有有许许多多不不同同的的siRNAs，通通常常能能够保证目的基因被有效地抑制。够保证目的基因被有效地抑制。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（3）用）用RNaseIII消化长片断双链消化长片断双链RNA制备制备siRNAdsRNA消消化化法法的的主主要要优优点点在在于于可可以以跳跳过过检检测测和和筛筛选选有有效效siRNA序序列列的的步步骤骤，为为研研究究人人

19、员员节节省省时时间间和和金金钱钱（注意：通常用（注意：通常用RNAseIII比用比用Dicer要便宜）。要便宜）。不不过过这这种种方方法法的的缺缺点点也也很很明明显显，就就是是有有可可能能引引发发非非特特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。最最适适用用于于：快快速速而而经经济济地地研研究究某某个个基基因因功功能能缺缺失失的的表表型型不不适适用用于于：长长时时间间的的研研究究项项目目，或或者者是是需需要要一一个个特特定定的的siRNA进行研究，特

20、别是基因治疗进行研究，特别是基因治疗 Ku-70 levels were reduced 86%in cells transfected with the siRNA cocktail,compared to non-transfected controls.为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（4）siRNA表达载体表达载体 多多数数的的siRNA表表达达载载体体依依赖赖3种种RNA聚聚合合酶酶III启启动动子子(polIII)中中的的一一种种，操操纵纵一一段段小小的的发发夹夹siRNA在在哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中

21、的的表表达达。包括的人源和鼠源的包括的人源和鼠源的U6启动子和人启动子和人H1启动子。启动子。之之所所以以采采用用RNApolIII启启动动子子是是由由于于它它可可以以在在哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中表表达达更更多多的的小小分分子子RNA，而而且且它它是是通通过过添添加加一一串串（3到到6个个）U来终止转录的。来终止转录的。使使用用这这类类载载体体，需需要要2段段编编码码短短发发夹夹RNA序序列列的的DNA单单链链，退退火火，克隆到相应载体的克隆到相应载体的polIII启动子下游。启动子下游。由由于于涉涉及及到到克克隆隆，这这个个过过程程需需要要几几天天的的时时间间，同同时时也也需需要要经经过

22、过测测序序以以保保证证克克隆隆的的序序列列是是正正确的。确的。不不过过幸幸好好载载体体容容易易大大量量扩扩增增，这这个个优优点点足足以以弥弥补补所所有有缺缺陷陷，特特别别是是当当载载体体在在实实验验中中确确实实有有效的时候。效的时候。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（4）siRNA表达载体表达载体 毫毫无无疑疑问问，siRNA表表达达载载体体的的优优点点在在于于这这是是众众多多方方法法中中唯唯一一可可以以进进行行长长期期研研究究的的方方法法带带有有抗抗生生素素标标记记的的载载体体可可以以在在细细胞胞中中持持续抑制靶基

23、因的表达，持续数星期甚至更久。续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即即使使是是对对转转染染带带有有筛筛选选标标记记质质粒粒的的细细胞胞进进行行瞬瞬时时筛筛选选，也也有有助助于于富富集集带带质质粒粒的的细细胞胞。这这也也可可以以帮帮助助解解决决一一些些难难转转染染的的细细胞胞由由于于转转染效率低造成的问题。染效率低造成的问题。开开始始研研究究逆逆转转录录病病毒毒和和其其他他病病毒毒载载体体用用于于siRNAsiRNA表表达达，其其优优势势在在于于可可以以直直接接高高效效率率感感染染细细胞胞进进行行基基因因沉沉默默的的研研究究，避避免免由由于于质质粒粒转转染效率低而带来的种种不便。染效率低而带

24、来的种种不便。最最适适用用于于：已已知知一一个个有有效效的的siRNA序序列列，需需要要维维持持较较长长时时间间的的基基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。的细胞。长期研究。不不适适用用于于：筛筛选选siRNA序序列列（其其实实主主要要是是指指需需要要多多个个克克隆隆和和测测序序等较为费时、繁琐的工作）等较为费时、繁琐的工作）为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能 Following transfection,the cells were selected wit

25、h hygromycin.Three weeks following selection,the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy.Green:GFP.Blue:DAPI stained nuclei.GFP levels were remarkably reduced(94%)in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1-U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to

26、those transfected with an empty siRNA expression vector.HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert.为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥

27、中小学图书室育人功能（5）siRNA表达框架表达框架 siRNA表表达达框框架架(siRNA expression cassettes，SECs)是是一一种种由由PCR得得到到的的siRNA表表达达模模版版，能能够够直直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这这个个方方法法最最早早是是由由Castanotto采采用用，包包括括一一个个RNApolIII启启动动子子，一一段段发发夹夹结结构构siRNA，一一个个RNApolIII终止位点。终止位点。和和siRNA表表达达载载体体不不同同的的是是，SECs不不需需要要载载体体克克隆隆、测测序序等等颇颇为

28、为费费时时的的步步骤骤，可可以以直直接接由由PCR得得到到，不不用用一天的时间。一天的时间。因因此此，SECs成成为为筛筛选选siRNA的的最最有有效效工工具具，甚甚至至可可以以用用来来筛筛选选在在特特定定的的研研究究体体系系中中启启动动子子和和siRNA的的最最适适搭配！搭配！为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（5）siRNA表达框架表达框架 如如果果在在PCR两两端端添添加加酶酶切切位位点点，那那么么通通过过SECs筛筛选选出出的的最最有有效效的的siRNA后后，可可以以直直接接克克隆隆到到载载体体中中构构建建si

29、RNA表达载体。表达载体。构构建建好好的的载载体体可可以以用用于于稳稳定定表表达达siRNA和和长长效效抑抑制制的的研究。研究。这这个个方方法法的的主主要要缺缺点点是是PCR产产物物很很难难转转染染到到细细胞胞中中。如如果果有有适适合合的的新新型型转转染染试试剂剂能能提提高高SEC的的转转染染效效率率的的话话，那那问问题题就就可可以以解解决决了了。另另外外，没没有有克克隆隆到到载载体体中中的的PCR片断并不适于大规模制备。片断并不适于大规模制备。最最适适用用于于：筛筛选选siRNA序序列列，在在克克隆隆到到载载体体前前筛筛选选最最佳启动子；佳启动子；不不适适用用于于：长长期期抑抑制制研研究究。

30、（如如果果克克隆隆到到载载体体后后就就可可以了）以了）。72 hours post-transfection,the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody.Non-transfected cells(NT)as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA(scramble)demonstrate wild-type levels of

31、 c-FOS.The relative level of reduction in gene expression was quantified and is provided in the bar graph.Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters.siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6(Mo-U6),human U6(Hu-U6),and human H1(Hu-H1)promoters and encodin

32、g a c-fos-specific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells.为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能制备制备siRNA5种不同方法的比较种不同方法的比较为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能制备制备siRNA5种不同方法的比较（续）种不同方法的比较（续）为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能4.转染细胞转染细胞s

33、iRNAs需需要要进进入入细细胞胞后后才才能能对对蛋蛋白白的的表表达达进进行行抑抑制制，因因此此将将其其高高效效地地转转入入细细胞胞也也是是研研究究成成功与否的关键步骤。功与否的关键步骤。例如，一个例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制对某个特定基因表达的抑制效率是效率是90%，但是其转染效率只有，但是其转染效率只有10%，那么，那么总的抑制率只有总的抑制率只有9%。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。想。但但是是有有专专门门的的RNA转转染染试试剂剂，其其原原理理也也是是基基于于脂质体技术，可用于多种真核细胞的脂质体技术，可用于多种真核细

34、胞的RNAi研究。研究。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能5.RNAi的效果分析的效果分析可从可从mRNA和蛋白质两方面进行。和蛋白质两方面进行。mRNA：RT-PCR；定定量量PCR；Northern 杂杂交交等。等。蛋白质：蛋白质：Western杂交；杂交；ELISA；免疫荧光等。免疫荧光等。细细胞胞的的代代谢谢过过程程，生生理理生生化化系系数数等等表表型型参参数数的变化是的变化是RNAi效果最终和最大的体现。效果最终和最大的体现。6 6、RNAiRNAi技术的应用技术的应用 为深入学习习近平新时代中国特色社会主义

35、思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（1）在功能基因组中的应用）在功能基因组中的应用 在在功功能能基基因因组组研研究究中中，需需要要对对特特定定基基因因进进行行功功能能丧丧失失或降低突变，以确定其功能。或降低突变，以确定其功能。由由于于RNAi具具有有高高度度的的序序列列专专一一性性，可可以以特特异异地地使使特特定定基基因因沉沉默默，获获得得功功能能丧丧失失或或降降低低突突变变，因因此此RNAi可可以以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。将将功功能能未未知知的的基基因因的的编编码码区区（外外显显子子

36、）或或启启动动子子区区，以以反反向向重重复复的的方方式式由由同同一一启启动动子子控控制制表表达达。这这样样在在转转基基因因个个体体内内转转录录出出的的RNA可可形形成成dsRNA，产产生生RNA干干涉涉，使使目目的的基基因因沉沉默默，从从而而进进一一步步研研究究目目的的基基因因的的功功能，这种技术即为能，这种技术即为RNAi技术。技术。根根据据所所选选用用序序列列的的不不同同，可可将将其其分分为为编编码码区区RNAi和和启启动子区动子区RNAi技术技术。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能编码区编码区RNAi技术技术自自

37、19981998年年在在线线虫虫中中发发现现RNAiRNAi现现象象以以来来，以以基基因因编编码码区区为为靶靶序序列列的编码区的编码区RNAiRNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。技术已用于线虫功能基因组的研究。最最初初这这种种技技术术是是通通过过注注射射或或浸浸泡泡等等方方法法直直接接导导入入到到线线虫虫的的性性腺腺或或早早期期胚胚胎胎中中。这这些些方方法法虽虽然然可可以以关关闭闭目目的的基基因因的的表表达达，产产生生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。突变表型，但这种表型变化却不能遗传。这这种种早早期期的的RNAiRNAi技技术术可可以以用用于于研研究究与与胚胚胎胎发发育育有有关关的的基

38、基因因的的功功能能，但但由由于于细细胞胞分分裂裂造造成成dsRNAdsRNA的的稀稀释释，使使得得这这种种方方法法在在研研究究成体的基因功能时有一定的局限性。成体的基因功能时有一定的局限性。为为弥弥补补早早期期RNAiRNAi技技术术的的上上述述不不足足，TavernarakisTavernarakis等等对对RNAiRNAi技技术术进进行行了了改改进进，将将目目的的基基因因的的靶靶序序列列以以反反向向重重复复的的方方式式，由由热热激激启动子控制在转基因生物中表达。启动子控制在转基因生物中表达。热热激激处处理理后后，反反向向重重复复序序列列在在细细胞胞内内开开始始转转录录，其其产产物物会会形形

39、成成具发夹环结构的具发夹环结构的dsRNAdsRNA，从而产生，从而产生RNAiRNAi，使目的基因沉默。，使目的基因沉默。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能编码区编码区RNAi技术技术这这种种改改进进的的RNAiRNAi技技术术与与传传统统的的RNAiRNAi技技术术相相比比，具具有有明明显的优点：显的优点：首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析；首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析；其其次次dsRNAdsRNA可可以以被被诱诱导导产产生生，RNAiRNAi能能够够在在发发育育特特定定阶阶段段出出现现，从从

40、而而使使研研究究发发育育早早期期必必需需基基因因在在发发育育晚晚期期的的功功能成为可能；能成为可能；另另外外，当当用用细细胞胞特特异异性性启启动动子子控控制制dsRNAdsRNA的的表表达达时时，可可以研究特定基因在不同器官中的功能。以研究特定基因在不同器官中的功能。KennerdellKennerdell J.J.R.R.和和CarthewRCarthewR.W.W.用用GAL4/UASGAL4/UAS系系统统控控制制dsRNAdsRNA在在果果蝇蝇中中的的表表达达，实实现现了了诱诱导导性性或或细细胞胞特特异异性性控制控制RNAiRNAi的发生。的发生。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义

41、思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能编码区编码区RNAi技术技术随随着着应应用用RNAi技技术术研研究究线线虫虫功功能能基基因因组组工工作作的的开开展展，研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。加加州州理理工工大大学学的的ChuangC.F.和和MegerowitzE.M.使使用用此此技技术术研研究究了了拟拟南南芥芥的的AG,CLV3,AP1,PAN四四个个开开花相关基因。花相关基因。结结果果表表明明使使用用RNAi技技术术可可以以产产生生功功能能丧丧失失或或降降低低突突变变体体，其其表表型型与与以以前

42、前通通过过其其它它方方法法鉴鉴定定的的突突变变体体类类似似。RNA原原位位杂杂交交表表明明，RNAi突突变变体体的的目目的的mRNA显显著著降降低。低。该该结结果果说说明明RNAi技技术术亦亦可可以以成成为为植植物物功功能能基基因因组组研研究究中的有力工具。中的有力工具。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能启动子区启动子区RNAi技术技术M.F.Mett等等证证明明含含有有启启动动子子区区的的dsRNA在在植植物物体体内内同同样样被被切切割割成成21-23核核苷苷酸酸长长的的片片段段，这这种种dsRNA可可使使内内源源相

43、相应应的的DNA序序列列甲甲基基化化，从从而而使使启启动动子子失失去去功功能，使其下游基因沉默。能，使其下游基因沉默。由由于于多多基基因因家家族族的的各各成成员员之之间间高高度度同同源源，因因而而使使用用编编码码区区RNAi技技术术很很难难将将各各个个成成员员区区分分开开来来研研究究，而而多多基基因因家家族族内内的的启启动动子子序序列列通通常常比比编编码码区区变变化化大大，采采用用启启动动子子区区RNAi技技术术有有望望将将多多基基因因家家族族的的各各个个成成员员区区分开来研究。分开来研究。这这样样综综合合编编码码区区RNAi技技术术和和启启动动子子区区RNAi技技术术的的信信息即可更全面地了

44、解多基因家族地各成员的功能。息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。RNAiRNAi现现象象存存在在的的广广泛泛性性远远远远超超过过人人们们的的预预期期，对对此此问问题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能启动子区启动子区RNAi技术技术与与其其它它几几种种进进行行功功能能丧丧失失或或降降低低突突变变的的技技术术相相比比，RNAiRNAi技技术术具具有有明明显显的的优优点点，它它比比反反义义RNARNA技技术术和和同同源源共共抑抑制制

45、更更有有效效，更更容容易易产产生生功能丧失或降低突变。功能丧失或降低突变。而而且且通通过过与与细细胞胞特特异异性性启启动动子子及及可可诱诱导导系系统统结结合合使使用用，可可以以在在发发育育的的不不同同时时期期或或不不同同器器官官中中有有选选择择地地进进行行，与与T-DNAT-DNA技技术术造造成成的的功功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。作作为为一一种种新新的的、强强有有力力的的研研究究工工具具，RNAiRNAi在在功功能能基基因因组组学学领领域域呈呈现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题之一。现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引

46、人注意的话题之一。相相对对于于基基因因敲敲除除技技术术(knockout)(knockout)，RNAiRNAi具具有有快快速速、有有效效、容容易易操操作作和和序序列列特特异异性性强强等等优优点点，被被称称为为基基因因抑抑制制(knockdown)(knockdown)技技术术，是是研究特定基因功能的有效方法。研究特定基因功能的有效方法。因因此此，在在某某种种程程度度上上可可以以替替代代操操作作复复杂杂和和费费用用昂昂贵贵的的基基因因敲敲除除技技术。术。与与基基因因芯芯片片等等高高通通量量基基因因筛筛选选技技术术相相结结合合，在在哺哺乳乳动动物物细细胞胞基基因因组学功能研究中将起重要作用，其应

47、用前景不亚于组学功能研究中将起重要作用，其应用前景不亚于PCRPCR技术。技术。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能（2）在基因治疗中的应用在基因治疗中的应用 治疗治疗HIV感染感染由由于于RNAi是是机机体体中中古古老老而而天天然然的的抗抗病病毒毒机机制制，HIV病病毒毒感感染染是是我我们们亟亟待待解解决决的的问问题题，将将RNAi技技术术应应用用于于艾艾滋病治疗是顺理成章之事。滋病治疗是顺理成章之事。针针对对HIV病病毒毒研研究究有有Jacque等等设设计计的的抑抑制制HIV1长长末末端端重重复复序序列列、附附件件基

48、基因因vif和和nef表表达达的的siRNA，Lee等等针针对对rev转转录录子子设设计计的的siRNA及及Novina等等针针对对HIV病病毒毒gag基基因因设设计计的的siRNA，其其基基本本策策略略都都是是选选择择HIV病病毒毒或宿主细胞基因为靶点或宿主细胞基因为靶点。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能治疗治疗HIV感染感染然然而而，RNAi治治疗疗HIV，应应用用于于临临床床，有有几几个个重重要要问问题题必须解决：必须解决：、作作用用靶靶点点的的选选择择，siRNA对对序序列列要要求求非非常常严严格格，1个个碱

49、碱基基的的错错配配，将将大大大大降降低低siRNA基基因因表表达达抑抑制制作作用用。如如果果HIV逆逆转转录录酶酶有有较较高高的的错错配配率率(1/1000个个核核苷苷酸酸每每个个复复制制循循环环)，就就可可能能迅迅速速导导致致所所谓谓siRNA逃逃逸逸突突变变的的出出现现。感感染染个个体体中中HIV序序列列的的多多样样性性，为为siRNA的的设计和合成增加了难度。设计和合成增加了难度。、如如何何有有效效导导入入siRNA.DNA质质粒粒、逆逆转转录录病病毒毒载载体体、腺腺病病毒毒载载体体和和脂脂质质体体等等在在培培养养细细胞胞株株中中有有良良好好的的导导入入效果，但在原代细胞中效果较差。效果

50、，但在原代细胞中效果较差。、增增强强siRNA在在细细胞胞中中的的稳稳定定性性.为为了了防防止止细细胞胞内内RNA酶酶对对siRNA的的降降解解，可可以以用用DNA质质粒粒和和病病毒毒载载体将体将siRNA以发夹以发夹(hairpins)的形式导入细胞内。的形式导入细胞内。为深入学习习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神,贯彻全国教育大会精神,充分发挥中小学图书室育人功能治治疗疗肝炎病毒感染肝炎病毒感染Jude Lieberman等已经成功地利用等已经成功地利用RNAi技术治愈了实技术治愈了实验鼠的肝炎。验鼠的肝炎。他他们们干干扰扰的的目目标标是是“凋凋亡亡相相关关蛋蛋白白质质（FA