遗传与分子生物学实验 (32).pdf

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1、DNA的纯化及鉴定 核酸的纯度与质量 获得高质量核酸的重要性：DNA分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高纯度、高质量的DNA是非常重要的前提。核酸的纯化：根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染，并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。核酸的鉴定：浓度、纯度、完整性 背景知识背景知识 核酸纯化应达到的要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。背景知识背景知识 核酸浓度检测 定磷法 DNA和RNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷量为

2、9.4%，DNA的平均含磷量为9.9%，因此可从样品中测得的含磷量来计算DNA或RNA的含量。定糖法 RNA含核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对DNA和RNA进行定量测定。紫外吸收法 核酸紫外吸收峰位于260 nm处，测定OD260值可以计算核酸浓度。A2601时，样品中双链DNA浓度为50 g/ml，单链DNA或RNA浓度为40 g/ml。DNA(g/l)=A26050稀释倍数/1000 RNA(g/l)=A26040稀释倍数/1000 背景知识背景知识 核酸的鉴定 核酸纯度的检测 核酸的纯度用A260/A280比值表示。OD260/OD280 1.8 为DNA纯品 OD2

3、60/OD280 1.82.0 为RNA纯品 背景知识背景知识 核酸的鉴定 核酸完整性检测 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。背景知识背景知识 核酸的鉴定 DNA纯化基本原理 实验原理实验原理 苯酚抽提法 苯酚作为蛋白变性剂，可同时抑制DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与 DNA 联结键已断，蛋

4、白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是可使提取的DNA保持天然状态。紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度 原理 DNA或RNA链上碱基的苯环结构（共轭双键）在紫外光区具有较强的吸收，其吸收峰在260 nm处。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染时，会影响DNA吸收光的准确测定。蛋白质在280 nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230 nm处。因此，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280 和OD230计算其比值来衡量样

5、品的纯度。浓度的计算 1 OD260=50 g/mL dsDNA 1 OD260=40 g/mL ssDNA/RNA 纯度的计算 DNA纯品的OD260/OD280 约为1.8，OD260/OD230 2.0 OD260/OD2801.8说明含有RNA污染；OD260/OD2801.6 说明有残余的蛋白质、酚等存在；OD260/OD2302.0 说明盐和小分子污染。实验原理实验原理 琼脂糖凝胶电泳法分离鉴定核酸的常规方法 实验原理实验原理 原理 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速度有差异而分离。这种技术是基因

6、操作的一种方法。核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。结果观察 制备凝胶时先加入少量荧光染料（EB），其分子可插入双链DNA的碱基对之间，可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置（红色荧光条带），也可在经凝胶成像系统中直接拍照。(1)可分辨的核酸分子的大小范围：50 30,000 bp 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,00030,000 0.7%800 12,000 1.0%500 10,000 1.2%400 7,000 1.5%200 3,000 2.0%50 2,0

7、00 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶电泳(2)影响电泳中DNA迁移速率的因子 1.DNA分子大小：迁移速率 U与DNA分子碱基对数目N 的对数值 logN 成反比。2.电场强度：泳动速率与电场强度成正比。3.琼脂糖浓度：logU=logU0Krt U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。4.质粒DNA构象：一般：CCL OC 5.染料：EtBr 会降低迁移率 6.缓冲液：TAE、TBE、TPE 7.琼脂糖种类 (3)常用DNA分子量标准 实验材料和试剂 实验材料 粗纯的DNA溶液 实验所需试剂 RnaseA母液 酚:氯仿:异戊醇(25:

8、24:1)氯仿:异戊醇(24:1)其它试剂：3 mol/L NaAc、TE缓冲液、无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、TBE电泳缓冲液 材料和试剂材料和试剂 实验仪器 移液器 离心机 不同型号的eppendorf管 紫外分光光度计 实验仪器 灌胶模具 电泳仪 电泳槽 凝胶成像系统 实验流程 待纯化DNA溶液 抽提 上层溶液 离心洗涤 乙醇沉淀 干燥溶解 DNA溶液 OD值测定 凝胶电泳 实验方法 1.加入加入RNase至终浓度至终浓度10 g/mL，37反应反应1小时小时（或或4过夜过夜）。2.酚酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇（25:24:1）抽提蛋白质：加入等体积酚：氯仿：抽提蛋白质：加入等体积酚：氯

9、仿：异戊醇异戊醇，轻轻充分混匀轻轻充分混匀，15000 rpm，离心离心 5 min，取上清取上清。3.氯仿氯仿:异戊醇异戊醇（24:1）抽提蛋白质：加入等体积氯仿抽提蛋白质：加入等体积氯仿:异戊醇轻轻异戊醇轻轻充分混匀充分混匀，15000 rpm，离心离心10 min，取上清取上清。可根据需要重复可根据需要重复23次次，直至离心时发现水相与有机相界面干净为止直至离心时发现水相与有机相界面干净为止。4.加入加入 1/10 体积的体积的 3M NaAc(pH=5.2)和和 2 倍体积的无水乙醇倍体积的无水乙醇，混匀混匀，-20放置放置1030 min。5.15000 rpm，离心离心10分钟分钟

10、，去上清去上清。6.70乙醇洗涤乙醇洗涤DNA沉淀沉淀，重复重复 2次次。7.风干风干DNA。8.100 L TE 溶解。溶解。9.取取2 L DNA溶液采用超微量蛋白核酸分析仪溶液采用超微量蛋白核酸分析仪（BioDrop）测定测定OD260，OD280，以及以及OD230，并计算并计算 OD260/OD280，OD260/OD230比值比值。10.取取10 L DNA溶液溶液，1%琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：120V，12小时小时，凝胶成像系统上记录和分析结果凝胶成像系统上记录和分析结果。11.剩余剩余DNA溶液溶液 4保存保存。实验步骤 实验过程实验过程 1.除RNA(一）DNA的纯化

11、 待纯化样品 RnaseA溶液至终浓度10 g/ml 混匀 37 温箱 1 小时 分层 待纯化样品 等体积 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)颠倒混匀 15000 rpm 离心10分钟 实验步骤 2.抽提去除蛋白质 核酸 变性蛋白 有机溶剂 取上清 2ml离心管 等体积 氯仿:异戊醇(24:1)混匀，离心 操作要点：1）取苯酚时注意要取下层酚相，注意观察其颜色；2）离心要注意平衡；3）取上清注意不要取到蛋白层。弃上清 取上清 2ml离心管 1/10体积3 M 乙酸钠,2倍体 积无水乙醇 颠倒混匀 DNA沉淀-20C静置 1030分钟 实验步骤 操作要点：1）沉淀DNA用乙醇或异丙醇都可以。异丙

12、醇沉淀的效率要高于无水乙醇，但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀，且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去；2）弃上清时注意不要把沉淀一起摒弃。3.乙醇沉淀核酸 15000 rpm，离心10分钟 1.5ml离心管 70%乙醇（重复2次）风干 1.5ml离心管 100 uLTE 实验步骤 操作要点：1）70%乙醇加入后需将核酸沉淀彻底悬浮起来，并颠倒混匀；2）自然晾干DNA，让乙醇充分挥发。4.核酸洗涤、脱盐、溶解(二）OD值测定 1.5ml离心管 混匀 20 L DNA 180 L蒸馏水 测定OD260，OD280，OD230 操作要点：1）注意使用分光光度计时一定要用对照调零；2）取拿比色皿时，手指

13、只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面；3）比色皿中的液体最好不要超过容积的2/3；4）更换待测溶液时，分光光度计的盖子要及时盖上，保持里面黑暗环境。操作要点：实验步骤(三）琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性 凝胶制备 点样 电泳 观察拍照 实验步骤 20 mL 0.5TBE 0.2 g琼脂糖 三角锥形瓶 煮沸，溶解 1.凝胶制备 操作要点：1）用于制胶的缓冲液和电泳缓冲液必须相同；2）总液体量不宜超过三角锥形瓶的50%；3）琼脂糖必须充分熔解，加热时若胶液沸腾发泡，停止加热；4）溴化乙锭是一种致癌物，高温易挥发，见光易分解，戴手套操作；5）倒胶时不要太快，不能产生气泡，凝胶厚度一般

14、在3-5 mm之间。凝固后，拔梳子 冷却至 5060C 加EB至 0.5mg/L 混匀，倒胶板 将凝胶置于 电泳槽 实验步骤 2.点样 10 L DNA+2 L载样 缓冲液 混匀 小心加入 样品槽 1.载样缓冲液作用 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于上样操作；形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。2.载样缓冲液组分及性质 包含溴酚蓝和二甲苯氰FF。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍；在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约300 bp的线性双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与长4kb的DNA相同。实验步骤 3.电泳 接通电源，切记靠近

15、加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个 电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。1.常用电泳缓冲液 Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）2.不同电泳缓冲液比较 TAE的缓冲容量最低，TBE和TPE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。实验步骤 凝胶成像系统观察拍照。4.观察拍照 实验步骤 问题一：DNA提取量少 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤

16、时DNA丢失 1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 2.植物要研磨充分 3.增加沉淀的时间，或低温沉淀 4.小心操作 原 因 对策 常见问题分析 问题二：OD260/OD280、OD260/OD230值不佳 1.OD260/OD280值大于1.8：含RNA的残留 2.OD260/OD280值小于1.6:含蛋白质、苯酚污染 3.OD260/OD230值小于2.0:有盐离子、小分子残留 1.加大RnaseA用量或延长消化时间 2.重新纯化去蛋白，增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）3.增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）原 因 对策 常见问题分析 问题三：DNA电泳条带模糊和不规则的DNA带迁移 1.DNA降解 2.样品中含盐量太高和含杂质蛋白 3.电泳缓冲液使用多次，造成离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降 4.电泳时电压和温度过高 1.实验整个操作尽量轻柔、避免外源核酸酶污染以及DNA反复冻融 2.重新纯化 3.换用新鲜的电泳缓冲液 4.降低电泳电压，电泳过程中防止温度过高 对策 原 因 常见问题分析 结果与分析 1.计算DNA的得率和纯度。（DNA浓度g/ml所测OD260值50稀释倍数）2.记录电泳结果（点样孔位置，Marker，样品DNA），估算所提取的植物基因组DNA的大小。