遗传与分子生物学实验 (11).pdf

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1、 遗传与分子生物学实验（B B模模块块-基因克隆与表达自主实验）成相应实验内容。遇到实际问题，请向指导教师及助教咨询。课上不再讲述实验原理及实验步骤。课上不再讲述实验原理及实验步骤。上课时你将亲自操作，完完成预习报告(当堂上课前交给助教，占每次实验课成绩的50%)。公告：公告：请在课前结合课件、相关资料及慕课视频认真自学，并第五周 外源DNA在大肠杆菌中的高效表达第四周 感受态细胞的制备与DNA的转化第三周 质粒DNA片段的胶回收与连接第二周 质粒DNA的酶切及DNA片段从凝胶中分离第一周第一周 质粒质粒DNA提取与浓度检测提取与浓度检测目的基因目的基因 载体载体 体外连接体外连接重组子（杂合

2、重组子（杂合DNADNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNADNA基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线目的基因在原核细胞中目的基因在原核细胞中表达表达 提取质粒提取质粒DNA+酶切酶切第第一一周周 质质粒粒DNA提提取取与与浓浓度度检检测测遗传与分子生物学实验（B B模模块块-基因克隆与表达自主实验）【实验目的】【实验目的】1.掌握质粒DNA提取（碱裂解法）的工作原理及实验操作步骤(手工提取法+试剂盒法）；2.掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理及实验操作步骤（配胶+上样+电泳+拍照）；3.掌握DNA浓度(及纯度)的检测方法(分光光度计法+凝胶

3、电泳粗略估计法）。【实验原理】【实验原理】质粒质粒(Plasmid)主要存在于细菌细胞中，独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的环状双链DNA分子。常含一些对宿主有利的基因，如抗生素抗性基因等。质粒的复制：严紧型复制（1几个）松弛型复制（20个以上）克隆载体克隆载体(Vector)用于携带外源DNA，并能使其在细菌中复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。克隆载体的结构：克隆载体的结构：1.启始复制子（ori,Origin of replication)；2.多克隆位点(MSC,Multiple cloning site)；3

4、.筛选基因（多为抗生素，如Ampicillin、Kanamycine 抗性基因)；4.标记基因(如LacZ、GFP 基因)。质粒：共价、闭合、环状的小分子量DNA去除其它物质：基因组DNA，蛋白质，RNA等 n碱裂解法的基本原理及步骤碱裂解法的基本原理及步骤1.碱性环境0.2N NaOH及及1%SDS使细菌裂解，同时，变性基因组DNA和质粒DNA。2.快速中和碱性及高盐条件下，质粒DNA可迅速复性，呈可溶状态，留在上清中(也会有RNA，因其分子量小)；而基因组基因组DNA无法及时复性，与部分部分蛋白质蛋白质等杂质形成絮状沉淀，可通过离心去除。3.再用酚/氯仿进一步去除质粒DNA中残存的蛋白残存

5、的蛋白；经酒精沉淀质粒DNA(注意，RNA也会被沉淀)。4.溶解质粒DNA的溶液中含RNase，去除去除RNA。n提取质粒提取质粒DNA的思路的思路质粒质粒DNA的提取的提取DNA凝胶电泳凝胶电泳n琼脂糖由半乳糖及其衍生物等中性物质构成，不带电荷。它透明无紫外吸收，多用作电泳支持物进行平板电泳。n琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶nDNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。n琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广(0.2-20kb)。利用脉冲电泳，可分离高达107bp的DNA片段。D

6、NA凝胶电泳凝胶电泳n核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度%0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA/kb 5-601-200.8-10 0.5-70.4-6 0.2-4 0.1-n影响迁移率的因素影响迁移率的因素nDNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压(一般5V/cm)、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。n琼脂糖凝胶电泳缓冲液琼脂糖凝胶电泳缓冲液n常用的有TAE(Tris-乙酸盐缓冲液)和TBE(Tris-硼酸盐缓冲液)。新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。电泳缓冲液在多次使用后，离子强度降低，pH值上升，

7、缓冲性能下降，可能产生DNA条带模糊和不规则迁移的现象。DNA凝胶电泳凝胶电泳n上样缓冲液上样缓冲液n核酸染料核酸染料nEB溴化乙锭：灵敏度高，可检出10ng的DNA,可加到样品或凝胶中。注意：EB是诱变剂，使用时要戴手套；EB废液要经处理后才能丢弃。n4S Red Plus:新型低毒（不能穿过细胞膜），高灵敏度染料，加入凝胶中，价格较昂贵。(在本实验中采用)n作用：增加DNA样品的密度，使其沉入加样孔内；使样品带有颜色，便于上样；含有电泳指示剂，预测电泳进程。n成分:蔗糖/甘油等(增加密度)；溴酚蓝/二甲苯青(分别蓝紫色和天青色，分别指示小片段和大片段)。n质粒质粒DNA三种构型三种构型在电

8、泳时迁移率不同在电泳时迁移率不同电泳方向电泳方向n分光光度计法分光光度计法：通过测定260nm的吸收峰来对DNA/RNA进行定量，适用于测定比较纯的样品(OD260=1相当于纯双链DNA 50ng/L、纯单链DNA/RNA 40ng/L、寡核苷酸20ng/L)。纯纯DNA:OD260/OD2801.8(1.9，表明有RNA污染;1.6，表明有蛋白质、酚等污染)；纯RNA:1.9 OD260/OD280 2.0时表明可能有异硫氰酸残存)DNA浓度测定浓度测定方法方法n电泳粗略估测电泳粗略估测DNA浓度浓度：通过凝胶电泳，将DNA样品与已知浓度的标准分子量marker条带相比较。虽然不能对DNA质

9、量进行精确定量分析，但可通过与相近的条带进行比较估算出大概数据。标准分子量DNA markerDNA 样品样品DNA marker每一条带为每一条带为50 ng小条带约为小条带约为30-35 ng大条带约大条带约为为100 ng【实验材料】【实验材料】n 载体载体质粒:pBluesrcipt(分子量约2.9 kb)n目的片段目的片段质粒:pBluesrcipt上含插入 片段(分子量约1.0 kb)（下周将用EcoRI/BamHI双酶切两个质粒）【实验分组】【实验分组】1.质粒质粒DNA提取提取：二人一组，一人用手工提取法提取质粒DNA，另一人用试剂盒提取质粒DNA，二人彼此学习。（160mL菌

10、液,已由助教提前准备好）2.DNA电泳电泳：每人一个DNA样品，9-10人一组上样，需配制4-5块浓度为0.9%的琼脂糖凝胶（如每块胶可至少上10个DNA样品,尽量用小胶板，便于学生分头上样）。助教指导学生配胶（前三周都需要用到琼脂糖凝胶），每周可由不同学生来完成，登记参与配胶学生姓名，适当给予加分。3.DNA浓度检测浓度检测：每人各自检测（分光光度计检测DNA浓度由王勤老师完成）。【实验时间安排】【实验时间安排】1.提取质粒DNA(手工提取法约2小时+试剂盒法0.5小时）2.用试剂盒法提取质粒DNA结束后/手工提取法提取质粒DNA的等待时间,来配制琼脂糖凝胶(20分钟)3.上样后跑电泳期间吃

11、午饭4.用观胶仪拍照，根据DNA分子量marker条带的亮度（上样5L,每个条带为50ng DNA），粗略估计提取质粒DNA的浓度（上样2LDNA样品）5.用微量分光光度计检测质粒DNA的浓度与纯度（取1LDNA样品）6.在盛有DNA样品的离心管壁上做好标记（班级、姓名、质粒DNA、手工提/试剂盒、浓度、时间）保存在-20冰箱，以备下星期酶切用。【实验步骤】【实验步骤】n手工提取法手工提取法：碱裂解1.5 mL菌液+苯酚/氯仿+酒精沉淀+RNase处理n试剂盒法试剂盒法：碱裂解5 mL菌液+吸附柱及其它溶液碱裂解法碱裂解法提取提取质粒质粒DNA溶液溶液IGET缓冲液：50mmol/L葡萄糖,1

12、0mmol/L EDTA,25mM Tris-HCl pH8.0溶液溶液II0.2mol/L NaOH,1%SDS溶液溶液III乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸,28.5mL H2OTE缓冲液或水缓冲液或水（+20g/ml RNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA,pH8.0100%乙醇，70乙醇碱裂解法中使用到的溶液：碱裂解法中使用到的溶液：1.取1.5 ml过夜培养菌液倒入微量离心管中，10000rpm，离心2min。2.吸去上清液，仅留细菌沉淀。3.【悬浮细菌】【悬浮细菌】将细菌沉淀悬浮于100 l溶液

13、中，充分混匀。4.【碱【碱裂解细菌裂解细菌/变性变性DNA】加200 l溶液(0.2 N NaOH+1 SDS新鲜配制)，颠倒几次离心管，轻柔混匀轻柔混匀，放冰上2 min。5.【中和碱【中和碱/复性质粒复性质粒DNA】加入150 l溶液(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒离心管数次混匀。（注意：在加入溶液II 和III后，不要剧烈振荡，以免打断DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！）6.12000rpm,室温离心5 min,将450 l上清转至另一离心管。质粒质粒DNA手工提取手工提取法法-1n 更多内容，详见“手工提取质粒DNA-B1（学生用）”7.【酚氯仿去除蛋白】【酚氯仿去除蛋白】加入等体积

14、（450 l）酚：氯仿，反复混匀，12000rpm，离心5min。（注意：A.苯酚有腐蚀性，取酚/氯仿溶液时，要小心！防止溅落在身体部位。要吸取下层溶液，酚/氯仿上面盖有一层Tris水溶液,可隔绝空气防止酚被氧化；B.此步离心之后，质粒DNA存在于上层溶液中。为避免酚/氯仿混入DNA中，可以先吸除管下方的酚/氯仿，再离心一次后，取上清就很容易了，也可以稍微多取一些含DNA的上清液）8.将350l上清小心转移到新离心管中，注意不要吸入酚/氯仿。（注意：酚/氯仿残留会干扰后面的酶切反应）9.【酒精沉淀酒精沉淀DNA/RNA】向上清中加入2倍体积倍体积的预冷无水乙醇,混匀后,-20放置5-10min

15、。10.12000rpm离心5min,吸去上清液。质粒质粒DNA手工提取手工提取法法-211.用移液器轻轻加入1 ml 70%乙醇，通过转动离心管来洗涤质粒DNA(/RNA)沉淀。（注意：此时DNA(/RNA)沉淀有可能脱落管壁，在去除上清时要小心避免丢失）12.吸去上清液后，再短暂离心，并尽量吸干管内残余液体，空气干燥DNA(/RNA)沉淀2-5min。（注意：DNA(/RNA)沉淀干燥后会变透明；酒精残留会干扰后面的酶切反应，要确保酒精已经挥发）13.【去除去除DNA样品中样品中RNA】加30l 10mM TE缓冲液（含有20 g/ml的胰RNA酶），使DNA完全溶解，37温浴10min，

16、降解DNA中混有的RNA。14.【检测检测DNA样品浓度样品浓度】琼脂糖凝胶电泳（不建议用分光光度计法，请思考原因）检测质粒DNA浓度，上样2l DNA样品。质粒质粒DNA手工提取手工提取法法-3收集收集菌体菌体裂解裂解离心离心取上清取上清裂解细菌，变性DNA中和碱，质粒DNA复性生工生工试剂盒提取试剂盒提取质粒质粒DNA快速操作流程快速操作流程吸附柱工作原理：吸附柱工作原理：高盐、低高盐、低pH值值条件下，硅基材料吸附膜专一吸附吸附DNA；而在低盐、高低盐、高pH值值条件下，洗脱洗脱DNA。从凝胶中回收DNA片段适用范围从几十适用范围从几十bp到几十到几十Kb。回。回收效率不等。收效率不等。

17、吸附吸附DNA洗脱洗脱DNA洗脱洗脱DNA吸附吸附DNA融胶融胶去除杂质去除杂质去除残去除残存酒精存酒精纯化DNA样品洗涤洗涤洗脱洗脱DNA（去取吸附柱吸附膜上残留的酒精，不可省略！）（去取质粒DNA中混有的少量蛋白质）（建议加至少50l的洗脱液）n 更多注意事项，详见“生工质粒DNA提取试剂盒使用说明”pdfn将2L质粒DNA样品与8L 1X 上样缓冲液混合均匀,上样后进行凝胶电泳（100V,40分钟）。n用微量分光光度计检测质粒DNA的浓度与纯度（取1LDNA样品）。n用观胶仪拍照，根据标准分子量DNAmarker条带的亮度(如上样5L,每个条带为50ng DNA)，粗略估计质粒DNA的浓

18、度。DNA凝胶电泳凝胶电泳DNA浓度浓度/纯度纯度测定测定n配制0.8%琼脂糖凝胶（添加1 X 4S Red plus核酸染料）1.记录观胶仪上观察到凝胶电泳实验结果。2.估计两种方法提取的质粒DNA 的浓度(纯度，如果可能），并计算所得质粒DNA的总量。3.分析实验结果的成因。【问题与讨论】【问题与讨论】1.两种提取质粒DNA的方法的异同点？2.两种DNA浓度检测方法的异同点和适用条件？【结果与分析】【结果与分析】1.菌体老化2.碱裂解不充分3.菌体中无质粒4.溶液使用不当1.请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养2.可减少菌体用量或增加溶液的用量3.不要频繁转接，每次接种时应接种单菌

19、落。检查抗生素使用浓度是否正确。4.溶液在温度较低时可能出现浑浊，置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液。原因原因对对策策质粒质粒DNA提取常见问题提取常见问题n问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？1.不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.加入RNaseA室温放置一段时间3.加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。n问题二：质粒DNA纯度不高，如何解决？原因原因对对策策1.混有蛋白2.混有RNA3.混有基因组DNA质粒质粒DNA提取常见问题提取常见问题

20、1.DNA降解2.电泳缓冲液陈旧3.所用电泳条件不合适4.DNA上样量过多5.DNA样含盐过高6.有蛋白污染7.DNA变性1.避免核酸酶污染2.电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液3.电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4.减少凝胶中DNA上样量5.电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6.电泳前酚抽提去除蛋白7.电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNADNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析n问题一：DNA条带模糊 原因原因对对策策1.电泳条件不合适2.

21、DNA变性1.电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液2.以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热n问题二：不规则DNA条带迁移DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 原因原因对对策策1.DNA的上样量不够2.DNA降解3.DNA走出凝胶4.所用光源不合适EB或其它染料染色的DNA1.增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低2.避免DNA的核酸酶污染3.缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4.应用短波长（254nm）的紫外光源n问题三：DNA条带弱或无条带DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 原因原因对对策策1.小DNA带走出凝胶2.分子大小相近的DNA带不易分辨3.DNA 变性4.DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适1.缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2.增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3.电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA4.在脉冲凝胶电泳上分析n问题四：缺失DNA条带DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析 原因原因对对策策