遗传与分子生物学实验 (20).pdf

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1、 遗传与分子生物学实验（B B模模块块-基因克隆与表达自主实验）第一周 质粒DNA提取与浓度检测第二周 质粒DNA的酶切及DNA片段从凝胶中分离第三周 质粒第三周 质粒DNA片段的胶回收与连接片段的胶回收与连接第四周 感受态细胞的制备与DNA的转化第五周 外源DNA在大肠杆菌中的高效表达公告：公告：请在课前结合课件、相关资料及慕课视频认真自学，并完成预习报告(助教课上检查，占每次实验课成绩的50%)。课上课上不再讲述实验原理及实验步骤，可能会有小测检验预习情况。不再讲述实验原理及实验步骤，可能会有小测检验预习情况。上课时你将亲自操作，完成相应实验内容。遇到实际问题，请向指导教师及助教咨询。目的

2、基因目的基因 载体载体 体外连接体外连接重组子（杂合重组子（杂合DNADNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNADNA基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线目的基因在原核细胞中目的基因在原核细胞中表达表达 提取质粒提取质粒DNA+酶切酶切遗传与分子生物学实验（B B模模块块-基因克隆与表达自主实验）第第三三周周 质质粒粒DNA片片段段的的胶胶回回收收与与连连接接【实验目的】【实验目的】1.掌握DNA酶切酶切片段从琼脂糖凝胶中回收片段从琼脂糖凝胶中回收的注意事项及实验操作步骤；2.熟练掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的实验操作步骤（配胶+上样+电泳+

3、拍照）；3.复习DNA浓度的检测方法；4.掌握DNA片段体外连接反应片段体外连接反应的注意事项。从凝胶中分离回收从凝胶中分离回收DNA片段片段n将将DNA片段从凝胶中切出后的回收方法片段从凝胶中切出后的回收方法：n电洗脱法(透析袋中进行,经济节省,回收效率高)n低熔点(65C)琼脂糖凝胶法nDEAE纤维膜插片法n玻璃奶法（在高盐状态下，氧化硅周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷与硅颗粒特异结合）n柱式柱式DNA胶回收法胶回收法(操作方便,快捷,纯度高)本实验本实验n应用应用：在生物技术实验中，PCR反应获得的目的片段、酶切后所得特定DNA序列、分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电

4、泳将目的片段与其它DNA分开，再通过一定方法将目的DNA从凝胶中分离出来，得到纯化的目的DNA，以用于后续实验(如，分子杂交、重组子构建、序列分析等)。【实验原理】【实验原理】n柱式柱式DNA胶回收试剂盒胶回收试剂盒优点优点:快速，半小时可完成全过程；不使用苯酚/氯仿，更安全；获得DNA片段纯度高，可用于酶切、连接反应、测序等；用途广，可用于DNA的浓缩、去盐及去除杂质（如引物，未标记上的核苷酸以及小的DNA片段）。吸附柱工作原理：吸附柱工作原理：高盐、低高盐、低pH值值条件下，硅基材料吸附膜专一吸附吸附DNA；而在低盐、高低盐、高pH值值条件下，洗脱洗脱DNA。从凝胶中回收DNA片段适用范围

5、从几十适用范围从几十bp到几十到几十Kb。回。回收效率不等。收效率不等。吸附吸附DNA洗脱洗脱DNA洗脱洗脱DNA吸附吸附DNA融胶融胶去除杂质去除杂质去除残去除残存酒精存酒精纯化DNA样品DNA体外连接反应体外连接反应注意事项注意事项-1n催化两个双链DNA片段相邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸酸脂键。n常用的DNA连接酶：大肠杆菌的DNA连接酶 T4噬菌体的DNA连接酶(可连接任意DNA平末端)nDNA连接酶连接酶nDNA连接酶酶活性单位定义：0.01个Weiss单位能在16，30min内将HindIII完全酶切的(粘性末端)1g入DNA片段完全连接 1个Weiss单位能在16，30mi

6、n内将HaeIII完全酶切的(平末端)1g入DNA片段完全连接n DNA片段片段末端性质影响连接效率末端性质影响连接效率nDNA片段的粘性末端连接效率高，平末端连接效率要低很多。因而在末端浓度，酶浓度选择上有差异。DNA体外连接反应体外连接反应注意事项注意事项-2n DNA片段浓度对片段浓度对连接效率的连接效率的影响影响nDNA一端与另一端的连接反应速度由互相匹配的DNA末端的浓度决定,不论末端位于同一DNA分子(分子内连接)还是位于不同分子(分子间连接)。n连接反应中应有足量的载体DNA。对于3kb的载体质粒，连接反应中应含有5-10ng/l载体DNA。n目的DNA末端浓度与载体DNA末端浓

7、度之比(摩尔比)在1:1-3:1之间：如果目的DNA末端浓度比载体的低得多，有效连接产物将会很少;而目的DNA浓度过高，会形成目的DNA片段多分子串联。n 载体DNA自身环化问题(由于酶切不完全)n 设置对照检测载体自连情况 对照：连接反应中加等量载体DNA和连接酶，不加目的片段DNA。如果转化后有带抗性的菌落，说明载体有自连。n 连接反应的检测连接反应的检测n需将连接反应转化宿主菌，通过筛选阳性克隆来确定连接反应是否成功。DNA体外连接反应体外连接反应注意事项注意事项-3n 更多注意事项，详见“DNA体外连接反应注意事项”pdfn为抑制载体自身连接，通常选择对载体DNA进行碱性磷酸酶处理，除

8、去其5末端的磷酸基，防止其自身环化。(当采用单酶切载体时,此步是必不可少的)n DNA连接酶最适反应温度为37，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是12-16过夜。【实验材料】【实验材料】n 载体载体质粒:pBluesrcipt(分子量约2.9 kb)载体上，经EcoRI/BamHI双酶切，电泳后胶回收纯化2.9kb 载体载体片段片段；n目的片段目的片段质粒:pBluesrcipt(分子量约2.9 kb)载体上含插入 片段(分子量约1.0 kb)，经EcoRI/BamHI双酶切，电泳后胶回收纯化1.0 kb目的片段目的片段。n用T4噬菌体DNA连接酶将两端均含有EcoRI/Ba

9、mHI酶切粘性末端的2.9kb 载体片段与1.0 kb目的片段连接起来质粒DNA双酶切产物 载体片段目的片段【实验分组】【实验分组】1.DNA片段胶回收片段胶回收：二人一组，每人进行一个胶回收(将两个人从胶中切得的载体片段/目的片段胶条汇合在一起，分别做胶回收，最后共同获得载体DNA(2.9kb)和目的片段(1.0kb)。2.DNA电泳电泳：每人一个DNA胶回收样品，8人一组上样，需配制5块浓度为0.8%的琼脂糖凝胶（每块胶有8个样品孔,可以上8个DNA胶回收样品）。3.DNA片段体外连接反应片段体外连接反应：每人设置两个连接反应（仅载体/载体和目的片段的连接）。【实验时间安排】【实验时间安排

10、】1.用生工胶回收试剂盒回收载体及目的片段（分别获得载体和目的片段）(40-45分钟)；2.配制浓度为0.8%的琼脂糖凝胶(10-15分钟)；3.上样后跑电泳期间吃午饭(40-45分钟)；4.用观胶仪检测电泳结果，并拍照(分组依次进行，约20分钟)；5.估测胶回收DNA样品浓度(约10-20分钟)；6.于标记好的离心管中设置两个连接反应(约15-20分钟)。称重称重溶胶溶胶转移转移n生工胶回收试剂盒回收生工胶回收试剂盒回收DNA片段快速操作流程片段快速操作流程切胶切胶【实验步骤】【实验步骤】（以上步骤上周已完成，本周从以下步骤开始）洗涤洗涤洗脱洗脱DNA（去取吸附柱吸附膜上残留的酒精，不可省略

11、！）（去取回收DNA片段中混有的少量蛋白质）（建议加至少30l的洗脱液）n 更多注意事项，详见“生工质粒DNA提取试剂盒使用说明”pdfn用移液枪头混匀各溶液，台式离心机上离心10秒。16反应16小时。反应结束后，置于-20冰箱保存。建议连接反应体系n在标记好的离心管中依次加入以下各试剂:无菌水、10连接酶buffer、胶回收DNA样品、T4连接酶(注意酶最后加，且在冰上操作)n设置设置DNA片段体外连接反应及载体自连对照片段体外连接反应及载体自连对照n胶回收结束后，取5l胶回收DNA样品，加入5l 2 上样缓冲液，上样到0.8%琼脂糖凝胶上，电泳(100V,30分钟)。观胶仪拍照，估测DNA样品浓度。载体载体DNA50ng X1 l(根据电泳估测浓度加)目的片段目的片段 50-80ng 0 l/X2 l(根据估测浓度加)10 连接酶buffer 1 l ddH2O Y l T4连接酶 1 l(5U)总体积 10 l 生产商提供的使用说明中建议的用量和反应条件【结果与分析】【结果与分析】1.记录紫外观胶仪上观察到DNA片段(载体DNA及目的片段)经胶回收纯化后的结果。2.计算实验中所使用胶回收试剂盒的DNA回收率。1.为何本实验中载体片段未经过去磷酸化处理？2.DNA片段从凝胶中回收的回收率与哪些因素有关？3.体外DNA连接反应应注意哪些问题？【问题与讨论】【问题与讨论】