(16.4.1)--重组体的筛选鉴定及克隆基因的表达.pdf

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1、DNA重组技术重组体的筛选鉴定及克隆基因的表达 第一部分 DNA重组技术 重组体的筛选鉴定 遗传标志筛选法 序列特异性筛选法 亲和筛选法 重组体的筛选鉴定遗传标志筛选法 遗传标志筛选法：载体上通常携带可供重组体筛选的遗传标志，据此可对含重组DNA的宿主细胞进行筛选。抗生素抗性标志 基因的插入失活/插入表达 标志补救 噬菌体的包装特性 遗传标志 重组体的筛选鉴定遗传标志筛选法 利用抗生素抗性标志筛选：含有载体的转化菌可以在含有相应抗生素的培养基上生长，而不含有载体的非转化菌则不能生长。但转化菌中转入的是否是含有目的DNA的载体，还需进一步鉴定。重组体的筛选鉴定遗传标志筛选法 利用基因的插入失活筛

2、选：如将外源基因插入抗药性标志基因中，使标志基因失活，转化菌将失去抗药表型，只能在无该抗生素的培养基中生存。重组体的筛选鉴定遗传标志筛选法 利用标志补救筛选：当载体上的标志基因在有缺陷宿主细胞中表达时，宿主细胞通过与标志基因表达产物互补弥补自身的相应缺陷，从而在相应选择培养基中存活。可用于初步筛选含有载体的宿主细胞。组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 组氨酸合成 DNA 重组体的筛选鉴定遗传标志筛选法 互补筛选（蓝白筛选）：一种标志补救筛选 重组体的筛选鉴定遗传标志筛选法 利用噬菌体的包装特性筛选：只有当DNA长度达到其野生型长度的75%-105%时，方能

3、包装形成有活性的噬菌体颗粒，进而在培养基上呈现清晰的噬斑。不含外源DNA的单一噬菌体载体DNA因其长度太小不能包装成活性的噬菌体颗粒，故不能感染细菌形成噬斑。重组体的筛选鉴定序列特异性筛选法 序列特异性筛选法：根据目的片段的特定序列进行筛选 RE酶切法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法 提取阳性克隆DNA适当的RE消化琼脂糖凝胶电泳 提取阳性克隆DNA设计引物PCR扩增结合序列分析证实 序列特异性筛选 菌落影印至硝酸纤维素膜裂解细菌核酸探针杂交检测探针 最准确鉴定目的DNA的方法 重组体的筛选鉴定序列特异性筛选法 菌落原位杂交筛选重组体：重组体的筛选鉴定亲和筛选法 亲合法筛选重组体 前提：重

4、组DNA转入宿主细胞后能够表达出其编码产物。原理：抗原-抗体反应，配体-受体反应。方法：类似菌落原位杂交。检测靶分子为吸附于纤维膜上的蛋白质，检测探针为其特异性抗体。第二部分 DNA重组技术 克隆基因的表达 原核表达体系 真核表达体系 DNA重组技术克隆基因的表达 基因转录 mRNA翻译 翻译后加工 转录后加工 DNA重组技术克隆基因的表达 表达载体的构建 表达体系 的建立 宿主细胞的建立 表达产物的分离纯化 原核表达体系 真核表达体系 DNA重组技术克隆基因的表达 原核表达体系（E.coli 是当前应用最多的原核表达体系）含大肠杆菌适宜的选择标志 含有合理设计的MCS 含适当的翻译控制序列

5、具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子 举例：pET系列表达载体pET28a质粒 ori Lac I KanR P T7 OLac MCS TT SD 乳糖操纵子结构 pET-28a(+)(5369bp)DNA重组技术克隆基因的表达 原核表达体系的缺点:缺乏转录后加工机制 对于真核基因，E.coli表达体系只能表达经逆转录合成的cDNA编码产物 缺乏适当的翻译后加工机制 真核基因的表达产物在E.coli表达体系中往往不能被正确的折叠或糖基化修饰 外源基因表达的蛋白质易形成不溶性包含体 很难用E.coli表达体系表达大量的可溶性蛋白 DNA重组技术克隆基因的表达 真核表达体系（酵母、昆虫、哺

6、乳动物细胞）Poly(A)n加尾信号 在真核细胞中表达的抗性基因 启动子 在原核细胞中表达的抗性基因 ori 细菌质粒的一部分 从而使真核表达质粒能在原核细胞中复制。MCS pRc/CMVpRc/CMV 5.5kb 举例：真核质粒载体pRC/CMV质粒 真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA的poly A加尾信号或染色体整合位点等。DNA重组技术克隆基因的表达 真核表达体系的优势:具有转录后加工机制 转录后mRNA的剪接、加poly A尾等 具有翻译后加工机制 蛋白质的糖基化修饰、乙酰化修饰等 外源基因表达的蛋白质易一般不形成包含体 表达的蛋白一般不易被降解 真核表达体系的缺点:操作技术难、费时、费钱 感谢您的耐心观看