遗传与分子生物学实验 (22).pdf

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1、实验十七实验十七 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒 DNA 转化转化 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。一、实验目的一、实验目的 1、通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒 DNA 转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。2、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。二、实验原理二、实验原理 转化(Transformat

2、ion)是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R，M)，它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后

3、的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但 CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15%的无菌甘油于-70保存(半年)，因此 CaCl2 法为使用更广泛。DNA 分子转化分以下几步：1吸附：双链 DNA 分子吸附于受体菌表面；2转入：双链 DNA 分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；3自稳：外源质粒 DNA 分子在细胞内复制成双链；4

4、表达：供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。转化子转化子筛选筛选方法方法：1.抗生素筛选法：由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过 Amp抗性来筛选转化子，如受体细胞没有转入质粒，则在含 Amp 的培养基上不能生长，能在 Amp 培养基上生长的受体细胞(转化子)已导入了质粒。质粒在菌体内扩增后，可将其提取出来，进行电泳、酶切等进一步鉴定。2.互补筛选法：现在使用的许多载体（如 PUC 系列）含有一个大肠杆菌DNA 的短区段，其中含有半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头 146 个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码半乳糖苷酶端氨基酸的序列。当外源基

5、因插入时，二者溶为一体后，有半乳糖苷酶表达，在生色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-D半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使 lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。3.直接 DNA 电泳法：利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大的特性，直接从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量来确定。4.酶切验证法：根据已知的外源 DNA 序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA 带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否

6、符合预计的结果。5.菌落 PCR 验证法：通过煮沸细菌菌落而获得细菌内的 DNA，再通过 PCR检测是否能在模板序列上扩增出预期 DNA 片断。6.质粒 DNA 测序法：从细菌中提取质粒 DNA,对其进行测序。7.Southern 印迹法：从细菌中提取 DNA（或质粒载体），再和与转化外源DNA 序列互补的 DNA 或 RNA 探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交,显示出杂交信号。本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞，并用 CaCl2 处理，使其处于感受态，然后与质粒共保温，实现转化。三、三、实实验验材料材料 1.材料 E.coli DH5 菌株，Amp；pBS 质粒

7、 DNA（购买或实验室自制），eppendorf 管。2.设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。3.试剂(1).LB 液体和固体培养基：LB 液体：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，氯化钠 10g，加水 750mL，调pH 至 7.5，补齐到 1000mL。高温高压灭菌后备用。LB 固体：LB 液体加 1.5%琼脂糖，高温高压灭菌后倒板备用。(2).Amp 储存液（50mg/ml）。(3).含 Amp 的 LB 固体培养基：将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入 Amp 储存液，使终浓度为 50ug

8、/ml，摇匀后铺板。(4).0.1mol/L CaCl2 溶液：称取 0.54g CaCl2(无水，分析纯)，溶于 50mL重蒸水中，定容至 100mL，高压灭菌。(5)含 15%甘油的 0.1mol/L CaCl2：称取 0.54g CaCl2(无水，分析纯)，溶于 50mL 重蒸水中，加入 15mL 甘油，定容至 100mL，高压灭菌。四、实验四、实验步骤步骤（一）（一）感受态细胞的制备感受态细胞的制备（CaCl2 法法）受体菌的培养：将受体菌在无 AMP 的 LB 培养板上划线，37 度培养 16 小时，从此板上挑取新活化的 E.coli DH5 单菌落，接种于 5ml LB 液体培养基

9、中，37下振荡培养 12 小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于100ml LB液体培养基中，37、300rpm培养2-3小时至OD600=0.5左右。1.将 1.5ml 培养液转入离心管中，冰上放置 10 分钟，然后于 4下 4000rpm 离心 2 分钟。2.弃去上清，倒置离心管 1min，用 1mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液轻轻悬浮起细胞.冰上放置 2 分钟后，4下 4000rpm 离心 2 分钟。3.弃去上清，加入 1mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置 10 分钟后，4下 4000rp

10、m 离心 2 分钟，弃上清。4.用 150ul 0.1M CaCl2 悬浮细胞，即成感受态细胞悬液。在接下来的转化实验中，两个人一组，将两人制备的感受态细胞悬液合并在一起，共计 300ul 感受态细胞悬液,分装于 3 个离心管中，用于三个转化实验。（注）在以上的感受态细胞制备步骤 4 中，也可以用含有 15%甘油的 0.1M CaCl2悬浮细胞，分装后快速冷冻在液氮中，可存放于-70冰箱中至半年。感受态感受态细胞细胞制制备备注意事项：注意事项：1、所用器具的洁净程度，这一点非常重要。2、培养基的装量：培养基的装量关系到菌体生长过程中是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体做不出效率高的感受态的。

11、建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。3、培养基的 pH 值。不单指配置或灭菌后的 pH 值，还包括整个摇瓶结束后的pH 值。一般来说，接种前的 pH 值在 6.8-7.2，等菌摇好后，pH 值不要低于6.0，最好在 6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。4、培养后的 OD 值。当 OD 值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调 OD 不得大于 0.6、0.8 等等。5、培养温度。较低的温度培养有利于感受态的形成，因此菌液培养时可在 25、18等较低的温度下培养。6、液氮速冻也会使感受态的

12、效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。7、试剂、微量离心管、枪头等需要预冷。（二）（二）转化转化步骤步骤 1.两人一组，取 3 个 1.5ml Eppendorf 管各加入 100l 新鲜制备的感受态细胞,分别加入 a.DNA 片段从凝胶中分离和连接实验中所获得的 10l DNA 连接溶液，b.1l质粒 DNA 提取实验中所获得的质粒 DNA（浓度已知）,做为正对照组，用于计算转化率（=平板上菌落数稀释倍数转化反应原液总体积/涂板菌液体积/ugDNA），c.1ul 无菌双蒸水,做为负对照组，用以检查制备感受态细胞的过程中是否有杂菌的污染。轻轻将溶液混和混匀，将离心管置于冰

13、上分钟。于水浴秒。冰浴分钟。各加入 2l 液体培养基（不含 Amp）,混匀后 37振荡培养30-60 分钟，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。取l 涂布于含 Amp(100g/ml)琼脂糖平皿，培养小时，观察结果。转化注意事项转化注意事项：1.细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于 4的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。2.质粒的质量和浓度：用于转化的质粒 DNA 主要是超螺旋态 DNA。转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下

14、，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。3.试剂的质量：所用的试剂，如 CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或 AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，枪头等经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染。注意注意 本实验方法也适用于其它 E.coli 受体菌株的不同的质粒 DNA 的转化，但它们的转化效率并不一定相同。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩，才能较准确的计算转化率。五五、结果与分析结果与分析 1.计算转化率（=平板上菌落数稀释倍数转化反应原液总体积/涂板菌液体积/ugDNA）。2.根据转化率和阴性对照分析实验结果。3.根据本实验结果分析影响转化率的因素有哪些？4.抗性法筛选和互补筛选原理是什么？