遗传与分子生物学实验 (36).pdf

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1、实验实验十二十二 细胞转染实验细胞转染实验 一、一、实验目的实验目的 学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法脂质体介导的转染。二、实验原理实验原理 脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。可用于外源物质进入细胞的载体。阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将 DNA 分子包裹，形成 DNA/脂质复合体。其能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜融合或细胞的内吞作用，也可通过直接渗透作用，将 DNA传递进入细胞。三、实验材料实验材料与试剂与试剂 1、材料、材料：（1）CV-1 细胞或 293 细胞；（2）携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的哺乳动物细胞表达质

2、粒 pN31-EGFP；（3）24 孔细胞培养板；（4）经无菌处理的 0.5mL Eppendorf 离心管。2、试剂、试剂：（1）脂质体转染试剂；（2）DMEM 基础培养基；（3）DMEM 完全培养基（10%胎牛血清，链霉素/青霉素）；（4）细胞胰酶消化液（0.25%Trypsin）3、仪器、仪器：（1）二氧化碳培养箱；（2）超净工作台；（3）倒置荧光显微镜。四、实验步骤实验步骤 1、待转染细胞的准备待转染细胞的准备（所有步骤均在超净工作台中完成，确保进行无菌操作）：（1）取贴壁接近 90%的 CV1 或 293 细胞，弃去原培养皿中的培养基，加入 1mL Versene 液洗细胞一次，弃去

3、 Versene 液，再加入 1mL 0.25%Trypsin 消化2 分钟（37，5%CO2)。（2）加入 1 mL 的 DMEM 完全培养基终止反应。（3）用吹管多次吹吸，使细胞完全分散开。（4）用 DMEM 完全培养基重悬细胞，计数，在 24 孔细胞培养板的每个孔中加入 2*105 个细胞。（5）细胞摇匀后将细胞培养板转入 5%CO2 培养箱中培养，准备用于第 2天转染。2.脂质体转染实验脂质体转染实验（所有步骤均在超净工作台中完成，确保进行无菌操作）：（1）脂质体/DNA 复合物的制备：A.在一无菌 0.5 mL 离心管 A 中，将 20 L pN31-EGFP 质粒(2 g)稀释于

4、80 L 无血清 DMEM 培养基中，轻轻混匀。B.在另一无菌的 0.5 mL 离心管 B 中，在 20 L 脂质体稀释于 80 L无血清 DMEM 培养基中，轻轻混匀。C.脂质体稀释液（B 管）滴加到表达质粒稀释液（A 管）中，滴加后用移液器轻轻混匀。D室温孵育 30 min。（2）孵育期间，将提前铺好 CV1 细胞的 24 孔细胞培养板从 CO2 培养箱中取出，在超净工作台中，弃去原培养基，用 0.5 mL 无血清 DMEM 培养基轻轻洗 1 次，弃去无血清培养基，再加入 0.5 mL 完全 DMEM 培养基。（3）将步骤（1）C 的 200 L 脂质体/表达质粒复合物滴加到培养板的孔中并轻轻摇动以均匀混合。（4）放置 37 5%CO2 培养箱培养 48 小时。3.转染结果观察转染结果观察：在倒置荧光显微镜通过蓝光激发观察细胞中报告基因 EGFP 的表达情况，拍照并评估转染效率。五、五、结果分析结果分析 1.在哺乳动物细胞转染实验中为提高转染效率需要注意哪些问题？2.简述脂质体转染实验的原理