遗传与分子生物学实验 (10).pdf

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1、质粒 DNA 小量提取（碱裂解法，手工提取）-学生用1.取 1.5 ml 过夜培养菌液倒入微量离心管中，10000rpm，离心 2min。2.吸去上清液，仅留细菌沉淀。3.【悬浮细菌悬浮细菌】将细菌沉淀悬浮于 100 l 溶液中，充分混匀。4.【碱碱裂解细菌裂解细菌/变性变性 DNADNA】加 200 l 溶液(0.2 N NaOH+1SDS 新鲜配制)，颠倒几次离心管，轻柔混匀内容物，放冰上 2 min。5.【中和碱中和碱/复性质粒复性质粒 DNADNA】加入 150 l 溶液(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒离心管数次混匀。（注意：在加入溶液 II 和 III 后，不要剧烈振荡，以免打断 DNA

2、(包括质粒 DNA 和基因组DNA)！）6.12000rpm，室温离心 5 min，将 450 l 上清转至另一离心管中。7.【酚氯仿去除蛋白酚氯仿去除蛋白】加入等体积（450 l）酚：氯仿，反复混匀，12000rpm，离心5min。（注意：A.取酚/氯仿溶液时，要吸取下层溶液，酚/氯仿上面盖有一层 Tris 水溶液,可隔绝空气防止酚被氧化；B.此步离心之后，质粒 DNA 存在于上层溶液中。为避免酚/氯仿混入 DNA 中，可以先吸除管下方的酚/氯仿，再离心一次后，取上清就很容易了，也可以稍微多取一些含 DNA 的上清液）8.将 350l 上清小心转移到新离心管中，注意不要吸入酚/氯仿。（注意：

3、酚/氯仿残留会干扰后面的酶切反应）9.【酒精沉淀酒精沉淀 DNA/RNADNA/RNA】向上清中加入 2 倍体积的预冷无水乙醇,混匀后,-20放置5-10min。10.12000rpm 离心 5min,吸去上清液。11.用移液器轻轻加入 1 ml 70%乙醇，通过转动离心管来洗涤质粒 DNA(/RNA)沉淀。（注意：此时 DNA(/RNA)沉淀有可能脱落管壁，在去除上清时要小心避免丢失）12.吸去上清液后，再短暂离心，并尽量吸干管内残余液体，空气干燥 DNA(/RNA)沉淀2-5min。（注意：DNA(/RNA)沉淀干燥后会变透明；酒精残留会干扰后面的酶切反应，要确保酒精已经挥发）13.【去除去除 DNADNA 样品中样品中 RNARNA】加 30l 10mM TE 缓冲液（含有 20 g/ml 的胰 RNA 酶），使 DNA 完全溶解，37温浴 10min，降解 DNA 中混有的 RNA。14.【检测检测 DNADNA 样品浓度样品浓度】琼脂糖凝胶电泳（不建议用分光光度计法，请思考原因）检测质粒 DNA 浓度，上样 2l DNA 样品。