核酸分离检测.ppt

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1、第五章第五章核酸的分离与核酸的分离与检测检测一、核酸的分离、提取通则一、核酸的分离、提取通则核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。除其他分子污染。分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。个主要步骤。1.细细胞裂解胞裂解 机械作用：机械作用：低渗、超声、微波、低渗、超声、微波、冻冻融裂解和融裂解和颗颗粒破碎粒破碎等。不

2、适于高分子量等。不适于高分子量长链长链核酸的分离。核酸的分离。化学作用：化学作用：一定一定pH和和变变性条件下，性条件下，细细胞破裂，蛋白胞破裂，蛋白变变性沉淀，核酸性沉淀，核酸水相。水相。变变性条件：性条件：加加热热、表面活性、表面活性剂剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40等等)、强强离子离子剂剂(异硫异硫氰氰酸胍、酸胍、盐盐酸胍等酸胍等)。pH环环境：境：强强碱碱(NaOH)或或缓缓冲液冲液(TE、STE等等)。金属离子螯合金属离子螯合剂剂(EDTA等等)螯合螯合Mg2+、Ca2+，抑制核酸，抑制核酸酶酶活性。活性。酶酶作用：作用：溶菌溶菌酶酶或蛋白或蛋白酶酶(蛋

3、白蛋白酶酶K、植物蛋白、植物蛋白酶酶或或链链酶酶蛋白蛋白酶酶)破裂破裂细细胞。降解与核酸胞。降解与核酸结结合的蛋白合的蛋白质质，促，促进进核酸的分离。核酸的分离。联联合使用合使用：细细胞、待分离核酸胞、待分离核酸类类型及后型及后续实验续实验目。目。2.酶酶处处理理 裂解液中加入蛋白裂解液中加入蛋白酶酶（蛋白（蛋白酶酶K或或链链酶酶蛋白蛋白酶酶），降解蛋白，降解蛋白质质；灭灭活核酸活核酸酶酶（DNase和和RNase）加入加入DNase和和RNase去除不需要的核酸。去除不需要的核酸。防止核酸的降解和变性防止核酸的降解和变性 防止防止过过酸、酸、过过碱碱对对磷酸二磷酸二酯键酯键的破坏（一般在的破

4、坏（一般在pH4-10下下进进行）行）;避免避免剧剧烈烈搅搅拌；拌；防止核酸防止核酸酶酶（DNase,RNase）的作用。）的作用。抑制抑制DNase：可加可加柠柠檬酸檬酸钠钠、EDTA等金属螯合等金属螯合剂剂；或加去；或加去污剂污剂十二十二烷烷基硫酸基硫酸钠钠（SDS）；或加蛋白）；或加蛋白变变性性剂剂。抑制抑制RNase：实验实验器皿高温，或高器皿高温，或高压灭压灭菌，不能高菌，不能高压灭压灭菌的用菌的用具用具用0.1%二乙基焦碳酸二乙基焦碳酸盐盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）处处理。理。加加强强的蛋白的蛋白变变性性剂剂如如硫硫氰氰酸胍酸胍、异硫异硫氰氰酸胍酸胍等。

5、等。加核糖核酸加核糖核酸酶酶阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasin）等）等RNase的抑的抑制制剂剂。质粒质粒DNA的提取的提取碱裂解法碱裂解法溶液溶液I：50mM葡萄糖，葡萄糖，25，10mMEDTA，pH8.0Tris-ClpH；葡萄糖；葡萄糖大肠杆菌悬浮；大肠杆菌悬浮；EDTA金属离子螯合剂。金属离子螯合剂。溶液溶液II：0.2NNaOH，1%SDSNaOH碱碱裂解细胞，控制时间，温柔混合裂解细胞，控制时间，温柔混合；SDS结结合蛋合蛋白。白。溶液溶液III：3M醋酸钾醋酸钾，2M醋酸醋酸醋酸钾醋酸钾PDS沉淀；沉淀；醋酸醋酸中和碱。中和碱。3.核酸的分离与核酸的分离与纯纯化化 高电荷磷酸骨架

6、比蛋白质、多糖、脂肪等其他生高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。物大分子物质更具亲水性。根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。度离心等方法。酚提取酚提取/沉淀法沉淀法 经经典方法是典方法是酚酚:氯氯仿抽提法仿抽提法。裂解裂解细细胞；离心分离含核酸水相；等体胞；离心分离含核酸水相；等体积积酚酚:氯氯仿仿:异戊醇异戊醇(25:24:1体体积积)混合液抽提，漩混合液抽提，漩涡涡振振荡荡混匀混匀(小分子量核酸小分子量核酸)/颠颠倒混匀倒混匀(高分子量核酸高分子量核酸)，离心分，离心分离；疏水性的蛋白离；疏水性的蛋

7、白质质有机相，核酸有机相，核酸上上层层水相。水相。缓缓冲液冲液饱饱和酚和酚蛋白蛋白变变性；性；氯氯仿增加有机相比重，仿增加有机相比重，防止酚流入水相；异戊醇可减少操作防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过过程中程中产产生的生的气泡，下气泡，下层层的界面更清晰的界面更清晰。核酸核酸盐经盐经有机溶有机溶剂剂沉淀沉淀浓缩浓缩酚、酚、氯氯仿抽提后用乙醇沉淀仿抽提后用乙醇沉淀水相加水相加pH5.05.5，终浓终浓度度0.3MNaAc或或KAc（钠钠离子中和核酸磷酸骨架离子中和核酸磷酸骨架负电负电荷，在酸性荷，在酸性环环境境中促中促进进核酸疏水复性），加核酸疏水复性），加22.5倍体倍体积积乙醇，乙醇，沉淀核

8、酸。沉淀核酸。离心收集，离心收集，70%乙醇漂洗核酸沉淀除乙醇漂洗核酸沉淀除盐盐分。分。其他可用于沉淀核酸的有机溶其他可用于沉淀核酸的有机溶剂剂：异丙醇、聚乙异丙醇、聚乙二醇二醇(PEG)等；等；盐类盐类：10.0mol/L醋酸醋酸铵铵、8.0mol/L的的氯氯化化锂锂、氯氯化化镁镁和低和低浓浓度的度的氯氯化化锌锌等。等。分离沉淀分离沉淀DNA层析法层析法 利用物利用物质质些理化性些理化性质质差异建立的分离分析方法。差异建立的分离分析方法。包括吸附包括吸附层层析、析、亲亲和和层层析、离子交析、离子交换层换层析等。析等。商品商品试剂试剂盒，分离和盒，分离和纯纯化同步化同步进进行。行。一定离子一定

9、离子环环境下，核酸被境下，核酸被选择选择性地吸附到硅土、性地吸附到硅土、硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。结结合至合至固相固相载载体的核酸可用低体的核酸可用低盐缓盐缓冲液或水洗脱。冲液或水洗脱。核酸核酸质质量好、量好、产产量高、成本低、快速、量高、成本低、快速、简简便、便、节节省人力以及易于省人力以及易于实现实现自自动动化。化。Promega质粒纯化系统质粒纯化系统以磁性颗粒为基础：采用磁性技以磁性颗粒为基础：采用磁性技术高通量纯化直接用于转染及其术高通量纯化直接用于转染及其它生物学实验的质粒。它生物学实验的质粒。以膜为基础：采用硅化膜纯化柱，以膜为基础：

10、采用硅化膜纯化柱，可用离心法进行纯化。可用离心法进行纯化。以树脂为基础：利用树脂，真空以树脂为基础：利用树脂，真空法。法。DNA在高盐条件下对硅树脂、膜在高盐条件下对硅树脂、膜的高亲和力。的高亲和力。全自动核酸分离纯化系统全自动核酸分离纯化系统 RocheMagNAPure96 MagNAPureLC2.0二、核酸含量的测定二、核酸含量的测定 核酸是由磷酸、戊糖、碱基所核酸是由磷酸、戊糖、碱基所组组成的核苷酸成的核苷酸的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以只要只要测测定三者中任何一定三者中任何一处处成分的含量，就可推成分的含量，就可推算出核酸的含量。常

11、用的核酸算出核酸的含量。常用的核酸测测定方法有定方法有：紫外吸收法紫外吸收法、定磷法、定糖法、定磷法、定糖法RNA的定量的定量测测定：地衣酚法定：地衣酚法DNA的定量的定量测测定：二苯胺法定：二苯胺法紫外吸收法中紫外吸收法中DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于:50g/ml双双链链DNA40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸分光光度计分光光度计Biophotometer NanophotometerSingleandmultiwavelengthmeasurementbinedwithkineticmethods.Thefullwavelen

12、gthscan(190nm-1100nm)allowscurveinterpretationforattainmentofmoredetailedscientificknowledgeoverwholespectrum.samplesizeaslowas0.5uL.ThermoScientificNanoDrop2000c(March2,2009)ThermoScientificNanoDrop2000and2000cSpectrophotometers.Theseeasy-to-use,UV-Visinstrumentsenablea5-secondmeasurementtimeofDNA,

13、RNAandproteinsonasamplesizeaslowas0.5uL.核酸纯度鉴定核酸纯度鉴定A260/A280DNA纯纯品品:A260/A280=1.8RNA纯纯品品:A260/A280=2.0电电泳泳核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 当前核酸研究中最常用的方法，常用于当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测检测核酸核酸的分子量、的分子量、纯纯度、度、结结构构变变化、序列分析等化、序列分析等 种种类类：琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳（水平泳（水平电电泳）泳）聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳（垂直泳（垂直电电泳，泳，分辨率可达分辨率可达1bp常用于常用于测测序）序）核酸样品的保存核酸样品的保

14、存 DNA：DNA样样品溶于品溶于pH8.0的的TE，4或或-20保存；保存；长长期保存期保存样样品中可加入品中可加入1滴滴氯氯仿。仿。RNA：RNA样样品溶于品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸或双蒸灭灭菌菌水中，水中，-70保存保存;长长期保存可以沉淀形式期保存可以沉淀形式贮贮于乙醇中于乙醇中;在在RNA溶液中，加溶液中，加1滴滴0.2mol/LVRC(氧氧钒钒核糖核核糖核苷复合物苷复合物)冻贮冻贮于于-70,可保存数年。可保存数年。三、核酸的检测三、核酸的检测PCR：常：常规规PCR、RT-PCR、荧荧光定量光定量PCR杂杂交：膜交：膜杂杂交（交（SouthernBlot、

15、NorthenBlot）、）、组组织样织样品原位品原位杂杂交交1.荧荧光定量光定量PCR（realtimePCR）1996，美国，美国Appliedbiosystems公司推出：在公司推出：在PCR反反应应体系中加入体系中加入荧荧光基光基团团，利用，利用荧荧光信号光信号积积累累实实时监测时监测整个整个PCR进进程。程。克服了克服了终终点点PCR法法进进入平台期或叫入平台期或叫饱饱和期后定量和期后定量的的较较大大误误差，差，实现实现DNA/RNA的精确定量。的精确定量。目前确定目前确定样样品中品中DNA(或或cDNA)拷拷贝贝数最敏感、最数最敏感、最准确的方法。准确的方法。灵敏度和特异性高、能灵

16、敏度和特异性高、能实现实现多重反多重反应应、自、自动动化程化程度高、无度高、无污污染、染、实时实时和准确。和准确。与常与常规规PCR的区的区别别常常规规PCR：PCR结结束后束后对终对终点点产产物物进进行定量分析。行定量分析。实时实时定量定量PCR：实时检测实时检测PCR扩扩增，在增，在扩扩增的指数增的指数期期对对起始模板起始模板进进行定量。行定量。两个重要概念两个重要概念荧荧光域光域值值（threshold）：）：是在是在荧荧光光扩扩增曲增曲线线上人上人为设为设定的一个定的一个值值，它可以，它可以设设定在定在荧荧光信号指数光信号指数扩扩增增阶阶段任意位置上段任意位置上，一般，一般荧荧光域光域

17、值值的的设设置是基置是基线线荧荧光信号的光信号的标标准偏差的准偏差的10倍。倍。Ct值值（Cyclesthreshold）：每个反：每个反应应管内的管内的荧荧光光信号到达信号到达设设定的域定的域值时值时所所经历经历的循的循环环数数.Ct值值与模板与模板DNA的起始拷的起始拷贝贝数成反比数成反比。荧荧光定量光定量PCR化学原理化学原理非特异性非特异性荧荧光光标记标记：SYBRGreen特异性特异性荧荧光光标记标记：TaqMan SYBRGreenI荧荧光染料的作用原理光染料的作用原理 SYBRGreenI：结结合于双合于双链链DNA小沟。小沟。PCR反反应应体系中，体系中，SYBR荧荧光染料特异

18、性地光染料特异性地掺掺入入DNA双双链链后，后，发发射射荧荧光信号，而不光信号，而不掺掺入入链链中的中的SYBR染染料分子不会料分子不会发发射任何射任何荧荧光信号。光信号。优优点：与所有双点：与所有双链链DNA结结合，不必因合，不必因为为模板不同模板不同而特而特别别定制定制通用性；价格相通用性；价格相对较对较低；一个低；一个PCR产产物可以与多分子的染料物可以与多分子的染料结结合，灵敏度很高。合，灵敏度很高。缺点：能与非特异性双缺点：能与非特异性双链链DNA（如引物二聚体）如引物二聚体）结结合。需要熔解曲合。需要熔解曲线线分析。分析。SYBRGreen熔解曲熔解曲线线分析分析TaqMan探探针

19、针法法TaqMan探探针针是一种寡核苷酸探是一种寡核苷酸探针针，设计为设计为与目与目标标序列上游和下游引物序列上游和下游引物间间的序列配的序列配对对。荧荧光基光基团团连连接在探接在探针针的的5末端，而淬末端，而淬灭剂则灭剂则在在3末端。当末端。当探探针针保持完整保持完整时时，3端猝端猝灭灭基基团团抑制抑制5发发射基射基团团的的荧荧光光发发射。在射。在PCR的退火期。探的退火期。探针针模板模板发发生特异生特异性性杂杂交。延伸期引物在交。延伸期引物在Taq酶酶作用下延伸，到达探作用下延伸，到达探针处针处，Taq酶酶有有53外切核酸外切核酸酶酶活性，切割探活性，切割探针针，荧荧光光发发射基射基团远团

20、远离猝离猝灭灭基基团团，荧荧光信光信释释放。随着放。随着扩扩增循增循环环数的增加，数的增加，荧荧光基光基团团不断不断积积累。即累。即荧荧光光强强度与度与扩扩增增产产物的数量呈正比关系。物的数量呈正比关系。优优点点：特异性高、重复性好、阴性：特异性高、重复性好、阴性结结果确果确定、引物定、引物设计设计相相对简单对简单公司网站公司网站缺点：只是用于一个靶基因，成本高。缺点：只是用于一个靶基因，成本高。定量方法定量方法绝对绝对定量：确定定量：确定样样品中某一核酸序列的拷品中某一核酸序列的拷贝贝数。数。相相对对定量：定量：样样品中某一核酸序列相品中某一核酸序列相对对与与对对照照样样本中同一核酸序列的表

21、达。本中同一核酸序列的表达。绝对定量绝对定量 通通过标过标准品定量准品定量绝对绝对定量的定量的标标准准样样品：已知拷品：已知拷贝贝数的数的质质粒粒DNA，做系列稀做系列稀释释。标标准准样样品的种品的种类类：含有和待：含有和待测样测样品相同品相同扩扩增片段增片段的克隆的克隆质质粒、含有和待粒、含有和待测样测样品相同品相同扩扩增片段的增片段的cDNA、PCR的的产产物物相对定量相对定量通过内标定量通过内标定量内内标标（EndogenousControl）通常是）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因靶基因表达的相靶基因表达的相对对量以靶基因相量以靶基因相对对其内其内标标的的CT

22、表示：表示：CT=靶基因靶基因CT-GAPDHCT 不同不同样样本靶基因表达的差异以本靶基因表达的差异以CT表示，由最高表示，由最高CT与其他各与其他各CT分分别别相减而得。相减而得。靶基因表达的相靶基因表达的相对对倍数以倍数以2-CT表示。表示。阶阶段段P311平均平均CTGAPDH平均平均CTCTCTE14.523.650.2916.490.077.160.25-0.65E16.523.010.4916.590.256.420.24-1.39E18.524.460.8818.010.656.450.22-1.36P524.790.6219.430.145.360.48-2.45P1123.

23、500.9518.920.704.570.25-3.44P1424.180.8919.420.864.760.11-3.25P3027.320.6019.510.257.810.280实时实时PCR显显示示P311在肺在肺发发育不同育不同阶阶段的表达段的表达 小鼠肺小鼠肺发发育不同育不同阶阶段段P311mRNA的表达的表达 Bio-RadiQ5TM荧荧光定量光定量PCR仪仪ABIPrism7500型型荧荧光定量光定量PCR仪仪2.核酸核酸杂杂交交膜膜杂杂交交SouthernBlotDNANorthernBlotRNAWesternBlotProtein组织组织切片切片杂杂交交InsituHyb

24、ridizationDNA/RNAImmunohistochemistryProtein主要杂交模式：主要杂交模式：膜杂交膜杂交原理：核酸原理：核酸变变性和复性性和复性杂杂交在持膜上交在持膜上进进行行核酸印迹核酸印迹杂杂交交 分分类类：DNA印迹印迹杂杂交（交（Southernblot）RNA印迹印迹杂杂交（交（Northernblot）核酸杂交的基本过程核酸杂交的基本过程制制备样备样品品待待检测组织样检测组织样品：品：动动、植物器官、植物器官、组织组织，培养，培养细细胞，胞，细细菌，病毒等菌，病毒等核酸：分离提取核酸：分离提取DNA（RNA）酶酶切：限制性内切切：限制性内切酶酶消化消化DNA

25、电电泳：凝胶泳：凝胶电电泳分离泳分离酶酶切切DNA混合物混合物DNA变变性：性：获获得得单链单链DNA转转膜膜：将核酸：将核酸样样品品转转移到支持膜上移到支持膜上(硝酸硝酸纤维纤维素膜、素膜、尼尼龙龙膜膜)限制性内切限制性内切酶酶消化消化DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳变性、转膜变性、转膜制备探针制备探针 探探针针（probe）:互互补补于靶基因于靶基因顺顺序的序的单链单链DNA或或RNA片段，通常片段，通常带带有有标记标记物如：物如：放射性同位素、放射性同位素、荧荧光化合物或半抗原地高光化合物或半抗原地高辛等，以辛等，以检测检测目的基因。目的基因。杂杂 交交杂杂 交交 炉炉杂交原理杂交原理

26、漂洗、检测漂洗、检测检测结果检测结果Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析SouthernBlot：基因的有无：基因的有无遗传遗传病、感染性疾病等病、感染性疾病等+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析电电泳泳方方向向限制性片段限制性片段长长度多度多态态性性菌落原位菌落原位杂杂交交筛筛选选目地基因目地基因斑点杂交斑点杂交 Norther

27、nBlot：基因表达的半定量分析：基因表达的半定量分析原位原位杂杂交交 应应用用已已知知碱碱基基顺顺序序并并带带有有标标记记物物的的核核酸酸探探针针与与组组织织、细细胞胞中中待待检检测测的的核核酸酸进进行行杂杂交交，再再用用与与标标记记物物相相应应的的检检测测系系统统，通通过过放放射射自自显显影影、组组织织化化学学或或免免疫疫组组织织化化学学方方法法在在被被检检测测的的核核酸酸原原位位形形成成带带颜颜色色的的杂杂交交信信号号，在在显显微微镜镜或或电电子子显微镜下进行细胞内定位的技术。显微镜下进行细胞内定位的技术。1）原位）原位杂杂交的分交的分类类根据所用探根据所用探针针和靶核酸的不同：和靶核酸

28、的不同：DNA-DNA杂杂交、交、DNA-RNA杂杂交、交、RNA-RNA杂杂交交根据探根据探针针的的标记标记物是否直接被物是否直接被检测检测：直接法直接法放射性同位素、放射性同位素、荧荧光及某些光及某些酶酶标记标记探探针针间间接法接法半抗原半抗原标记标记探探针针，免疫，免疫组织组织化学法化学法对对半抗原定位半抗原定位DNA-DNA杂杂交交 灵敏度灵敏度较较低。低。主要用于外源性基因主要用于外源性基因检测检测（病毒的（病毒的检测检测）。）。杂杂交交时时需需先先在在高高温温80-95短短时时处处理理，使使DNA探探针针及及细细胞胞内内靶靶DNA变变性性，解解离离成成单单链链，迅迅速速置置于冰上冷

29、却。然后置于于冰上冷却。然后置于3742杂杂交交过过夜。夜。宫颈宫颈息肉息肉HPVDNA探探针针原位原位杂杂交交人人类类染色体端粒染色体端粒DNA的的荧荧光原位光原位杂杂交交DNA-RNA杂杂交交 灵灵敏敏度度高高（cDNA中中无无内内含含子子、高高度度重复序列；无靶基因自身复性）重复序列；无靶基因自身复性）cDNA探探针针制制备备困困难难RNA-RNA杂杂交交避避免免了了应应用用双双链链DNA探探针针在在杂杂交交反反应应中中存存在在的的两条两条链链之之间间的复性和第二条的复性和第二条链链的的竞竞争性争性杂杂交交问题问题cRNA-RNA杂杂交交体体较较DNA-DNA、cDNA-RNA稳稳定定，

30、在在杂杂交交后后可可用用RNA酶酶除除去去未未结结合合的的探探针针，因此特异性更因此特异性更强强。灵敏度灵敏度较较高高RNA原位原位杂杂交交检测检测和分析的主要和分析的主要为为内源性基内源性基E18.5lung-VEGF2）RNA原位核酸原位核酸杂杂交方法交方法uDNA-RNA杂杂交交uRNA-RNA杂杂交交原位杂交技术的基本方法原位杂交技术的基本方法 杂杂交交前前准准备备：取取材材、固固定定、玻玻片片和和组组织织切切片片处处理理（增（增强强探探针针的穿透性、减低背景染色、的穿透性、减低背景染色、RNase等）等）杂杂交：一定温度下，探交：一定温度下，探针针与靶与靶RNA的的结结合合杂杂交后交

31、后处处理：去除未理：去除未杂杂交探交探针针显显示示：放放射射自自显显影影和和非非放放射射性性标标记记的的组组织织化化学学或或免疫免疫组织组织化学反化学反应显应显示示杂杂交交结结果果取材取材新新鲜组织鲜组织、细细胞；尽快冷胞；尽快冷冻冻或固定或固定杂杂交前所有用具交前所有用具RNasefree固定固定 目目的的：保保持持细细胞胞形形态态结结构构，最最大大限限度度地地保保存存细细胞内胞内RNA水平；使探针易于进入细胞或组织。水平；使探针易于进入细胞或组织。最最常常用用多多聚聚甲甲醛醛（4%）固固定定组组织织，因因其其不不会会与与蛋蛋白白质质产产生生广广泛泛的的交交叉叉连连接接，不不会会影影响响探探

32、针针穿穿透入细胞或组织。透入细胞或组织。醋酸、酒精的混合液和醋酸、酒精的混合液和Bouins固定剂固定剂包埋、切片包埋、切片 石石蜡蜡切切片片：固固定定组组织织用用PBS冲冲洗洗后后，经经梯梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。冰冰冻冻切切片片：组组织织固固定定后后，30%蔗蔗糖糖处处理理过过夜，夜，OCT包埋、切片，包埋、切片，-80保存备用。保存备用。OCT-optimumcuttingtemperaturepound聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物性混合物在冰冻切片时支撑组织，以在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少

33、皱增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。折及碎裂。漂片时可溶于水，不增加背漂片时可溶于水，不增加背景染色。景染色。全自动脱水机（全自动脱水机（TissueProsessing）石蜡组织包埋机（石蜡组织包埋机（Embedding）包埋用具包埋用具包埋后的组织蜡块包埋后的组织蜡块石蜡切片机（石蜡切片机（Microtome）展片机展片机冰冰冻冻切片机切片机（Cyrostat）探针的制备探针的制备 特异性特异性cDNA探针：探针：制备困难制备困难cRNA探针：探针：以以cDNA为模板，体外转录获得，单为模板，体外转录获得，单链探针，链探针，cRNARNA杂交体稳定；杂交体稳定；RNase敏感敏感人工合成寡

34、核苷酸探针人工合成寡核苷酸探针：DNA合成仪合成，不需合成仪合成，不需要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长错配，过短错配，过短特异性差特异性差探针长度：探针长度：500碱基碱基探针标记方法探针标记方法末端标记法：末端标记法：将标记物导入线型将标记物导入线型RNA的的5端或端或3端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带的标记分子较少。的标记分子较少。体外转录法：体外转录法：模板模板线性化质粒线性化质粒DNA/PCR产物产物（含（含T7、T3或或SP6启动子），启动子），RNA聚合酶，聚合酶，NTP（一种标记带标记

35、）所有的（一种标记带标记）所有的RNA就被标记。就被标记。末端标记法末端标记法碱性磷酸碱性磷酸酶酶T4多聚核苷酸激多聚核苷酸激酶酶T4多核苷酸激多核苷酸激酶酶是一种磷酸化是一种磷酸化酶酶，可将，可将ATP的的g-磷酸基磷酸基转转移至移至DNA或或RNA的的5末端。末端。体外转录基因克隆载体体外转录基因克隆载体体外转录标记体外转录标记标记物标记物同位素同位素 非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素 直直接标记、间接标记接标记、间接标记地高辛标记技术地高辛标记技术Digoxigenin（DIG），源于从洋

36、地黄类植物中提），源于从洋地黄类植物中提取的类固醇。洋地黄花和叶片为取的类固醇。洋地黄花和叶片为Digoxigenin在自在自然界中的唯一来源，抗然界中的唯一来源，抗DIG的抗体不会与其他的的抗体不会与其他的生物物质结合，高特异性。生物物质结合，高特异性。灵敏度高。灵敏度高。DIG检测灵敏度接近同位素而无放射检测灵敏度接近同位素而无放射性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比生物素则没有样本内源干扰之苦。生物素则没有样本内源干扰之苦。地高辛的结构地高辛的结构StructureofAlkali-liableDigoxigenin(DIG)-dUTPAP

37、（碱性磷酸（碱性磷酸酶酶）标记标记抗抗-DIG抗体抗体检测检测碱性磷酸酶显色试剂碱性磷酸酶显色试剂 BCIP/NBTBCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚基基-磷酸磷酸盐盐NBT(四四唑唑硝基硝基蓝蓝)是是碱性磷酸碱性磷酸酶酶最佳的底物最佳的底物组组合之一。合之一。在碱性磷酸在碱性磷酸酶酶的催化下，的催化下，BCIP会被水解而会被水解而产产生生强强反反应应性的性的产产物，物，该产该产物与物与NBT发发生反生反应应，形成不，形成不溶性的深溶性的深蓝蓝色至色至蓝蓝紫色化合物。紫色化合物。相关设备相关设备杂交炉杂交炉杂交杂交

38、脱蜡脱蜡：二甲苯脱蜡：二甲苯脱蜡，逐级梯度酒精，逐级梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)清洗，蒸馏水洗。清洗，蒸馏水洗。固定固定通透通透：蛋白酶（蛋白酶：蛋白酶（蛋白酶K/proteinaseK，链霉蛋白，链霉蛋白酶酶/pronase和胃蛋白酶和胃蛋白酶/pepsin)消化包围靶消化包围靶RNA的的蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号。过度消蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号。过度消化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、导化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、导致标本从载玻片上的脱落。致标本从载玻片上的脱落。再固定再固定酸酸酐处酐处理：防止探理：防止探针针与与组织组织中碱性蛋白之中碱性蛋白之间间的的静静电结电结合，以降低背景合，以降低背景 脱水脱水预杂预杂交交：阻断玻片和：阻断玻片和标标本与探本与探针针的非特异性的非特异性结结合减低背景合减低背景杂杂交：探交：探针变针变性，性，过过夜，温度、湿度夜，温度、湿度洗洗涤涤：SSC缓缓冲液洗除未冲液洗除未杂杂交探交探针针显显色：抗体（色：抗体（anti-dig-ap碱性磷酸碱性磷酸酶酶）孵）孵育，底物育，底物显显色；复燃（色；复燃（苏苏木精、快木精、快绿绿）脱水、封片脱水、封片