氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验.ppt
《氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验.ppt(60页珍藏版)》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、第第7章章 氨基酸、多肽、蛋白质和氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验酶类药品检验氨基酸类药物含量测定常用的方法氨基酸类药物含量测定常用的方法1.酸碱滴定法酸碱滴定法示例示例1:谷氨酸的:谷氨酸的含量测定含量测定示例示例2:赖氨酸片:赖氨酸片中赖氨酸的测定中赖氨酸的测定2.非水溶液滴定法非水溶液滴定法示例:酪氨酸的示例:酪氨酸的含量测定含量测定3.定氮法定氮法示例:天门酰氨示例:天门酰氨片的含量测定片的含量测定赖氨酸片中赖氨酸的测定中赖氨酸片中赖氨酸的测定中w1)为什么要用为什么要用NaOH调节调节pH为为7.0?w2)加入甲醛溶液的作用?)加入甲醛溶液的作用?w3)是直接滴定还是其他的滴定方式
2、?)是直接滴定还是其他的滴定方式?非水溶液滴定法非水溶液滴定法w非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐,以及有机酸碱金属盐类药物的含量。盐或有机酸盐,以及有机酸碱金属盐类药物的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。w非水溶剂的种类非水溶剂的种类(1)酸性溶剂酸性溶剂有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱度,最常用的酸性溶剂为冰醋酸。度,最常用的酸性溶剂为冰醋酸。(2)碱性溶剂碱
3、性溶剂有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸度,最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。度,最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。定氮法定氮法w样品与浓硫酸共热样品与浓硫酸共热,含含氮氮有机物有机物即分解产生氨即分解产生氨(消化消化),氨又与硫酸),氨又与硫酸作用,变成作用,变成硫酸硫酸氨。经氨。经强碱强碱碱化使之分解放出碱化使之分解放出氨,借氨,借蒸汽蒸汽将氨蒸至酸将氨蒸至酸液中,根据此酸液被液中,根据此酸液被中中和和的程度可的程度可计算计算得得样品样品之氮含量。之氮含量。4.碘量法或溴量法碘量法或溴量法示例一:盐酸示例一:盐酸半胱氨酸水合物半胱氨酸水合物的测定的
4、测定示例一:示例一:L-胱胱氨酸的测定氨酸的测定5.HPLC法法示例一:三氨示例一:三氨基酸注射液基酸注射液-341示例二:六氨示例二:六氨基酸注射液基酸注射液4006.氨基酸自动分析氨基酸自动分析仪仪碘量法碘量法w原理:半胱氨酸分子中含有原理:半胱氨酸分子中含有SH,在酸性条在酸性条件下,与过量的碘作用,剩余的碘用硫代硫件下,与过量的碘作用,剩余的碘用硫代硫酸钠溶液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗的酸钠溶液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗的量,间接求出硫化物的含量。量,间接求出硫化物的含量。w注意:滴定条件,指示剂,碘滴定液,注意:滴定条件,指示剂,碘滴定液,Na2S2O3 标液配制标液配制 碘量法
5、的背景知识碘量法的背景知识w(一一)方法简介方法简介w 碘碘量量法法也也是是常常用用的的氧氧化化还还原原滴滴定定方方法法之之一一。它它是是以以I2的的氧氧化化性性和和I-的的还还原原性性为为基基础础的的滴滴定定分分析析法法。因此,碘量法的基本反应是因此,碘量法的基本反应是 n由由E可可知知I2是是一一种种较较弱弱的的氧氧化化剂剂,能能与与较较强强的的还还原原剂剂作作用用;而而I-是是一一种种中中等等强强度度的的还还原原剂剂,能能与与许许多多氧氧化化剂剂作作用用,因因此此碘碘量量法法又又可可以以用用直直接接的的和和间间接接的的两种方式进行滴定。两种方式进行滴定。n 1、碘滴定法、碘滴定法(也称直
6、接碘量法也称直接碘量法)n 电电位位比比EI2/I低低的的还还原原性性物物质质,可可以以直直接接用用I2的的标标准准溶溶液液滴滴定定的的并并不不多多,只只限限于于较较强强的的还还原原剂剂,如:如:S2-、SO32-、Sn2+、S2O32-、AsO32-、SbO33-等。等。w剩余碘量法剩余碘量法w在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液,在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液,待待I2与测定组分反应完全后,再用硫代硫酸钠与测定组分反应完全后,再用硫代硫酸钠滴定液滴定剩余的碘,根据与药物作用的碘滴定液滴定剩余的碘,根据与药物作用的碘的量来计算药物含量的方法。的量来计算药物含量的方法。w 2、滴定碘
7、法、滴定碘法(间接碘量法间接碘量法)w 电电位位比比EI2/I高高的的氧氧化化性性物物质质,可可在在一一定定的的条条件件下下,用用碘碘离离子子来来还还原原,产产生生相相当当量量的的碘碘,然然后后用用Na2S2O3标标准准溶溶液液来来滴滴定定析析出出的的I2,这这种种方方法法叫叫做做间间接接碘碘量量法法或或称称为为滴滴定定碘碘法法。例例如如K2Cr2O7在在酸酸性性镕镕液液中中与过量的与过量的KI作用,析出的作用,析出的I2用用Na2S2O3标准溶液滴定。标准溶液滴定。w Cr2O72-+6I-+14H+2Cr3+3I2+7H2Ow I2+2S2O322I-+S4O62利利用用这这一一方方法法可
8、可以以测测定定很很多多氧氧化化性性物物质质,如如ClO3-、ClO-、CrO42-、IO3-、BrO3-、SbO43-、MnO4-、MnO2、AsO43-、NO3-、NO2-、Cu2+、H2O2等等等等,以以及及能能与与CrO42-生生成成沉沉淀淀的的阳阳离离子子,如如Pb2+、Ba2+等等,所以滴定碘法的应用范围相当广泛。所以滴定碘法的应用范围相当广泛。w 碘碘量量法法常常用用淀淀粉粉作作指指示示剂剂,淀淀粉粉与与碘碘作作用用形形成成蓝蓝色色络络合合物物,灵灵敏敏度度很很高高,即即使使在在5106 mol/L溶液中亦能看出。溶液中亦能看出。w 淀淀粉粉指指示示剂剂应应在在近近终终点点时时加加
9、入入,因因为为当当溶溶液液中中有有大大量量碘碘存存在在时时,碘碘可可被被吸吸附附在在淀淀粉粉表面,影响终点的正确判断。表面,影响终点的正确判断。w 碘滴定液碘滴定液(0.1mol/L)I2=253.81 12.69g1000ml 【配制配制】取碘取碘13.0g,加碘化钾加碘化钾36g与水与水50ml溶解后,加盐酸溶解后,加盐酸3滴与水适量使成滴与水适量使成1000ml,摇,摇匀,用垂熔玻璃滤器滤过。匀,用垂熔玻璃滤器滤过。w 碘碘量量法法的的主主要要误误差差来来源源,一一是是I2易易挥挥发发,二二是是I-易被空气中的氧所氧化。易被空气中的氧所氧化。w 为防止为防止I2挥发,应采取以下措施:挥发
10、,应采取以下措施:w 1.加加入入过过量量KI,KI与与I2形形成成I3,以以增增大大I2的的溶溶解解度,降低度,降低I2的挥发性,提高淀粉指示剂的灵敏度。的挥发性,提高淀粉指示剂的灵敏度。w 此此外外,加加入入过过量量的的KI,可可以以加加快快反反应应的的速速度度和和提提高反应的完全程度。高反应的完全程度。w 2.反反应应时时溶溶液液的的温温度度不不能能高高,一一般般在在室室温温下下进进行行。因因升升高高温温度度增增大大I2的的挥挥发发性性,降降低低淀淀粉粉指指示示剂剂的的灵灵敏敏度度。保保存存Na2S2O3溶溶液液时时,室室温温升升高高,加加速速Na2S2O3的分解。的分解。w 3.析析出
11、出碘碘的的反反应应最最好好在在带带塞塞的的碘碘量量瓶瓶中中进进行行,滴滴定切勿剧烈摇动。定切勿剧烈摇动。w 为防止为防止I-被空气中的氧所氧化,被空气中的氧所氧化,应采取以下措施应采取以下措施:w 1.避光避光 光线能催化光线能催化I被空气氧化。被空气氧化。w 2.溶溶液液pH值值的的影影响响 S2O32与与I2之之间间的的反反应应必必须须在在中中性性或或弱弱酸酸性性溶溶液液中中进进行行。因因为为在在碱碱性性溶溶液液中中,I2与与S2O32将会发生下述副反应:将会发生下述副反应:w S2O32+4I2+10 OH2SO42+8I十十5H2Ow 而且,而且,I2在碱性溶液中还会发生歧化反应:在碱
12、性溶液中还会发生歧化反应:w 3 I2+6OHIO3+5I+3H2Ow 如如 果果 在在 强强 酸酸 性性 溶溶 液液 中中,Na2S2O3溶溶 液液 会会 发发 生生 分分 解解:S2O32+2H+SO2+S+H2Ow 同时,同时,I在酸性溶液中也容易被空气中的在酸性溶液中也容易被空气中的O2氧化:氧化:w 4I+4H+O2=2I2+2H2O w 3.在在间间接接碘碘量量法法中中,当当析析出出碘碘的的反反应应完完成成后后,应应立立即即用用Na2S2O3进进行行滴滴定定(避避免免I2的的挥挥发发和和I被被空空气气氧氧化化)。w(二)应用实例(二)应用实例w1.铜矿石中铜的测定铜矿石中铜的测定w
13、 矿矿石石经经HCl、HNO3、溴溴水水和和尿尿素素处处理理成成溶溶液液后后、用用NH4HF2掩掩蔽蔽试试样样中中的的Fe3+,使使其其形形成成稳稳定定的的FeF63-络络合合物物,并并调调节节溶溶液液的的pH为为3.54.0,加加入入KI与与Cu2+反反应应,析析出出的的I2,用用Na2S2O3标标准准溶溶液液滴滴定定,以以淀淀粉粉为为指示剂,反应式如下:指示剂,反应式如下:w 2Cu2+4I2CuI+I2w I2十十2S2O322I+S4O62w 本法可测定矿石中本法可测定矿石中0.5%以上的铜。以上的铜。w 2.钡盐中钡的测定钡盐中钡的测定w 在在HAc-NaAc缓缓冲冲溶溶液液中中,C
14、rO42能能将将Ba2+沉沉淀淀为为BaCrO4。沉沉淀淀经经过过滤滤、洗洗涤涤 后后,用用 稀稀 HCl溶溶 解解,加加 入入 过过 量量 KI,Cr2O72将将I氧氧化化为为I2,析析出出的的I2,以以淀淀粉粉为为指指示示剂剂用用Na2S2O3标标准准溶溶液液滴滴定定。反反应应式式如下:如下:w Ba2+CrO42BaCrO4(黄黄)w 2BaCrO4+4H+2 Ba2+H2Cr2O7+H2Ow Cr2O72+6I+14H+3I2+2Cr3+7H2Ow I2+2S2O322I+S4O62HPLC(高效液相色谱)柱的类型:柱的类型:检测器类型:检测器类型:固定相:固定相:流动相:流动相:氨基
15、酸自动分析仪w一种专门用来分析氨基酸的自一种专门用来分析氨基酸的自动化的液相色谱仪。动化的液相色谱仪。w原理:蛋白质经盐酸水解原理:蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸,经氨基成为游离氨基酸,经氨基酸分析仪的离子交换柱分酸分析仪的离子交换柱分离,与茚三酮溶液产生颜离,与茚三酮溶液产生颜色反应,再通过分光光度色反应,再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。计比色测定氨基酸含量。w 一份水解液可同时测定天一份水解液可同时测定天冬,苏,丝,精氨酸等冬,苏,丝,精氨酸等16种氨基酸。种氨基酸。多肽类药品检测1.酸碱滴定法酸碱滴定法2.紫外分光光度法紫外分光光度法3.效价测定法(略)效价测定法(略)示例一:抑肽酶
16、效价的测定示例一:抑肽酶效价的测定 示例二:杆菌肽效价的测定示例二:杆菌肽效价的测定蛋白质类药品的检验蛋白质类药品的检验w定氮法定氮法w电泳法(重点介绍)电泳法(重点介绍)w生物检定法生物检定法w电泳:是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电电泳:是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。荷的电极移动的现象。w醋酸纤维素薄膜电泳:以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维素薄膜电泳:以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯,由纤维素的羟基经乙酰化而它是纤维素的醋酸酯,由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中,即可涂布成均一制成。它溶于丙酮等有机溶液中,即可涂布成均一细密的微孔
17、薄膜,厚度以细密的微孔薄膜,厚度以0.1mm0.15mm为宜。为宜。w特点:操作简单、灵敏度高,样品用量少。电泳时特点:操作简单、灵敏度高,样品用量少。电泳时间短,一般电泳间短,一般电泳4560min即可,加上染色,脱色,即可,加上染色,脱色,整个电泳完成仅需整个电泳完成仅需90min左右。左右。醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白效价单位Uw效价效价:指某一物质引起生物反应的功效单位指某一物质引起生物反应的功效单位,可用理可用理化方法检测化方法检测,也可用生物检测方法测定,通常以重量也可用生物检测方法测定,通常以重量单位或效价单位来计量。不同的药物有各自的效价单位或效价单位来
18、计量。不同的药物有各自的效价的定义。的定义。w某些生化药物,其药物中含有一些杂质,不可能是某些生化药物,其药物中含有一些杂质,不可能是纯品。故不能以重量单位准确表示其含量,只能依纯品。故不能以重量单位准确表示其含量,只能依靠生物检定的方法与标准品进行比较来测定药物的靠生物检定的方法与标准品进行比较来测定药物的效价剂量。因此,采用特定的效价剂量。因此,采用特定的“单位单位”“U”来来计量。产生相同效应药品的剂量比较时,所需剂量计量。产生相同效应药品的剂量比较时,所需剂量越小,药物的效价就越高,反之效价就低。越小,药物的效价就越高,反之效价就低。w临床上常见到的以效价单位计量的药物有生物制剂临床上
19、常见到的以效价单位计量的药物有生物制剂如蛋白质类、酶制剂、激素、维生素及部分抗生素如蛋白质类、酶制剂、激素、维生素及部分抗生素类药。这些药物依中国药典规定,均以其特有的药类药。这些药物依中国药典规定,均以其特有的药理效价表示剂量。理效价表示剂量。w肝素的效价是以每毫克肝素制剂肝素的效价是以每毫克肝素制剂(602mmHg柱真空柱真空干燥干燥3小时小时)所相当的单位数来表示。所相当的单位数来表示。1U为为24h内在内在冷处阻止冷处阻止1ml猫血凝结所需的最低肝素量。在制药猫血凝结所需的最低肝素量。在制药工业的发展过程中,随着制药工艺的提高,药物的工业的发展过程中,随着制药工艺的提高,药物的纯度也逐
20、年提高,其生物效价亦随之愈来愈高。该纯度也逐年提高,其生物效价亦随之愈来愈高。该药研制初期的生物效价,每药研制初期的生物效价,每1.0mg效价相当于效价相当于125U,1977版中国药典规定肝素钠每版中国药典规定肝素钠每1.0mg效价不效价不得少于得少于140U,而,而1995版药典则定为每版药典则定为每1.0mg效价不效价不得少于得少于150U,2005年为不少于年为不少于156U,2010年版改年版改为不得少于为不得少于170U。酶类药品检验-酶活力测定法酶活力概念w 酶活力酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的
21、快慢,即酶催定条件所催化的某一化学反应速度的快慢,即酶催化的反应速度越快,酶活力越高,反之则表示该酶化的反应速度越快,酶活力越高,反之则表示该酶活力低。活力低。w但是,酶的定量并非对其蛋白质进行定量,而是对但是,酶的定量并非对其蛋白质进行定量,而是对它的催化能力进行定量。它的催化能力进行定量。所以,酶的定量就是测定所以,酶的定量就是测定所以,酶的定量就是测定所以,酶的定量就是测定酶的活力,也即测定酶促反应的速度。酶的活力,也即测定酶促反应的速度。酶的活力,也即测定酶促反应的速度。酶的活力,也即测定酶促反应的速度。一.酶活力的测定:(一)酶活力测定的基本知识:酶不易制成纯品,其中含有很多杂质,真
22、正的含酶量并不多。所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。酶活力是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量,即测定酶促反应的速率来获得的。一般情况下,产物和底物的改变量是一致的,但测定产物的生成要比测定底物的减少为好,这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的,而反应时间通常又很短,尤其是在酶活力很低时,底物减少量仅占加入量的很小比例,因此测定不易准确;反之,产物从无到有(如不纯的酶制剂中内源性产物不计的话),只要测定方法灵敏,准确度可以很高,故酶活力测定绝大多数是采用测定产物生成速率的方法。测定酶活力时通常都附有适当的对照(control)以消除非酶促反应所生成的产物,常用的对
23、照有以下几种,可根据具体情况予以选择。1.样品对照 若测定酶活力的样品是粗提取液,属于非常不纯的酶制剂,往往含有所欲测定的产物,也可能在保温时由于内源性底物的旁反应产生相同的产物,这些可通过不加底物单加样品的样品对照予以消除。2.底物对照 某些酶的底物能自发(非酶促)地分解成所欲测定的产物,可以通过不加样品单加底物的底物对照予以消除。3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底物自发分解的情况并存,则必须做一个酶和底物都加入但反应时间为零的对照,也即先用蛋白沉淀剂或其它试剂停止反应,再加入底物。在双底物反应时,对照管可以加入酶制剂和两种底物中的一种,因缺乏另一种底物,不可能生成产物,至于应加入两
24、种底物中的哪一种可以根据预实验决定。测定管中的产物量必须减去对照管中的产物才是真正由酶促反应所生成的产物量。(二)酶活力测定的方法:酶活力测定要符合两个原则:在零级反应期测定,即-s或p与反应时间t成正比,反应速度与酶量成线性关系,即 E E=k(-k(-s s/t)=/t)=k kp p/t/t 常用的方法有:1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法 如何测定酶活力?如何测定酶活力?如何测定酶活力?如何测定酶活力?以产物浓度对反应时间作图,可得到酶促反应以产物浓度对反应时间作图,可得到酶促反应以产物浓度对反应时间作图,可得到酶促反应以产物浓度对反应时间作图,可得到酶促反应速度曲线速度曲线速度曲
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 氨基酸 多肽 蛋白质 药品 检验
限制150内