第十章 蛋白质和氨基酸的测定.ppt

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1、第十章第十章 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定4 42 2 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定1 1 概述概述氨基酸的定性测定氨基酸的定性测定4 45 5氨基酸定量测定氨基酸定量测定3 3蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定凯氏定氮法凯氏定氮法主主 要要 内内 容容氨基酸的分离测定氨基酸的分离测定6 61、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。2、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。3、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理1、蛋白质的性质和测定意义；、蛋白质的性质和测定意义；2

2、、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；3、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。2.重点重点 1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。3.难点难点3.1.基本知识点基本知识点学学 习习 目目 标标第一节第一节 概述概述一、蛋白质的组成一、蛋白质的组成蛋蛋白白质质是是复复杂杂的的含含氮氮有有机机化化合合物物，它它由由2020多多种种氨氨基基酸酸通通过过酰胺键以以一一定定的的方方式式结结合合起起来来，并并具具有

3、有复复杂杂的的空空间间结结构构。它它主主要要含含的的元元素素是是C、H、O、N、S、P另另外外还还有有一一些些微微量量元元素素Fe、Zn、I、Cu、Mn。而而含N是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。二、氨基酸二、氨基酸propro是是由由氨氨基基酸酸组组成成的的高高分分子子化化合合物物，目目前前各各种种氨氨基基酸酸已已达达175175种种以以上上，但是构成但是构成propro的氨基酸主要有的氨基酸主要有2020种。种。赖氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸天冬氨酸缬氨酸天冬酰胺丝氨酸ProPro的基本组成单位是氨基酸的基本组成单位是氨基酸那什么是氨基酸呢？几种常见的氨基酸几种常见的氨基酸几种常见的氨基酸

4、几种常见的氨基酸这些氨基酸结构上有什么共同点？羧基和氨基羧基和氨基连接在同一连接在同一个碳原子上个碳原子上蛋白质的基石物质：-氨基酸氨基酸的缩合氨基酸的缩合肽键二肽、多肽等二肽、多肽等1.1.误食重金属盐，误食重金属盐，可以喝大量牛奶可以喝大量牛奶进行紧急处理，进行紧急处理，WHY?WHY?2.2.鸡蛋水煮会发生鸡蛋水煮会发生什么样变化？什么样变化？3.3.医用酒精可以消医用酒精可以消毒，福尔马林可毒，福尔马林可以保存动物标本，以保存动物标本，WHYWHY？问：蛋白质具有问：蛋白质具有什么样的性质呢什么样的性质呢？三、蛋白质的性质三、蛋白质的性质1.1.盐析盐析2.2.变性变性小小 结结u 蛋

5、白质的主要组成元素？蛋白质的主要组成元素？u 天然蛋白质的分子量：天然高分子有机化合物，分子量几万到几十万；天然蛋白质的分子量：天然高分子有机化合物，分子量几万到几十万；u 哪些物质中富含蛋白质呢？哪些物质中富含蛋白质呢？uProPro是是食食品品的的重重要要组组成成成成分分，也也是是生生命命的的基基础础。人人体体11%-11%-13%13%的的总总热热量量来来自自蛋蛋白白质质。无无论论动动物物、植植物物都都含含有有蛋蛋白白质质，只只是是含含量量及及类类型型不不同同。测测定定食食品品中中的的蛋蛋白白质质含含量量，对对合合理理调调配配膳膳食食，保保证证不不同同人人群群的的营营养养需需求求，掌掌握

6、握食食品品的的营营养养价价值值，合合理理开开发发利利用用食食品品资资源源，控控制制食食品品加加工工中中食食品品的品质、质量都具有重要的意义的品质、质量都具有重要的意义。uProPro是是食食品品的的最最重重要要质质量量指指标标。食食品品营营养养价价值值的的高高低低，主主要看蛋白质的高低。要看蛋白质的高低。四、蛋白质测定的意义四、蛋白质测定的意义u除除了了保保证证食食品品的的营营养养价价值值外外，在在决决定定食食品品的的色色、香香、味及结构等特征上也起着重要的作用。味及结构等特征上也起着重要的作用。u蛋白质是微生物发酵中所必需的重要氮源之一。蛋白质是微生物发酵中所必需的重要氮源之一。Eg.Eg.

7、发发酵酵原原料料中中蛋蛋白白质质含含量量的的高高低低对对发发酵酵产产品品的的质质量量影响很大。影响很大。啤啤酒酒生生产产要要选选用用蛋蛋白白质质含含量量较较低低的的大大麦麦等等原原料料，因因啤啤酒酒酿酿造造中中，原原料料（大大麦麦芽芽）中中蛋蛋白白质质含含量量过过高高，可可造造成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。但但对对酱酱和和酱酱油油等等发发酵酵调调味味品品来来讲讲，则则需需要要选选用用蛋蛋白白质质含量较高的原料；含量较高的原料；至至于于活活性性干干酵酵母母，含含氮氮量量则则是是评评价价其其成成品品质质量量的的一一个个重要指标，主要是判定活性酵母菌的数量。重要指标，主要是

8、判定活性酵母菌的数量。四、蛋白质测定的意义四、蛋白质测定的意义五、蛋白质的测定方法五、蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分两大类蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率含氮量、肽键和折射率等测等测定蛋白质含量；定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。等测定蛋白质含量。具体测定方法：具体测定方法：凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法双缩脲反应、染料结合反应、酚

9、试剂法国外：红外分析仪国外：红外分析仪氨基酸总量氨基酸总量酸碱滴定法测定；酸碱滴定法测定；各种氨基酸的分离与定量各种氨基酸的分离与定量色谱技术。色谱技术。有多种氨基酸分析仪。有多种氨基酸分析仪。第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定 （p116)p116)一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电电泳泳或或纸纸层层析析之之后后用用一一些些染染料料与与蛋蛋白白质质结结合合并并变变色。（色。（5 5 种染料）种染料）二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3 3种方法）种方法）（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2 2种方法）种方法）

10、第三节第三节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定食品中的蛋白质含量及测定意义蛋白质系数蛋白质测定方法（1 1）生物活性测定）生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。（2 2）功能性质调查）功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡能力。（3 3）营养标签）营养标签 总蛋白质含量；氨基酸组成；混合物中的特定蛋白质的含量；蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量；非蛋白氮；蛋

11、白质的营养价值(消化率、蛋白质功效比或氮平衡)蛋白质分析的重要性蛋白质分析的重要性蛋白质分析的重要性蛋白质分析的重要性一、含量及测定意义一、含量及测定意义食品种类食品种类 蛋白质的百蛋白质的百分含量分含量食品种类食品种类 蛋白质的蛋白质的百分含量百分含量大米大米(糙米糙米)大米大米(白米白米)小麦粉小麦粉(整粒整粒)玉米粉玉米粉(整粒整粒)意大利面条意大利面条玉米淀粉玉米淀粉 7.97.113.76.912.80.3大豆大豆(成熟、生）成熟、生）豆豆(腰子状、生腰子状、生)豆腐豆腐(生、坚硬生、坚硬)豆腐豆腐(生、普通生、普通)36.523.615.88.1食品中蛋白质的含量食品中蛋白质的含量

12、 乳制品乳制品 牛乳牛乳(全脂，液体全脂，液体)牛乳牛乳(脱脂、干脱脂、干)切达干酪切达干酪 酸奶酸奶(普通的、低脂普通的、低脂)水果和蔬菜水果和蔬菜 苹果苹果(生、带皮生、带皮)芦笋芦笋(生生)草莓草莓(生生)莴苣莴苣(冰、生冰、生)土豆土豆(整粒、肉和皮整粒、肉和皮)3.336.224.95.30.22.30.61.02.1肉、家禽、鱼肉、家禽、鱼 牛肉牛肉(颈肉、烤前腿颈肉、烤前腿)牛肉牛肉(腌制、干牛肉腌制、干牛肉)鸡鸡(可供煎炸的鸡胸肉可供煎炸的鸡胸肉)火腿火腿(切片、普通的切片、普通的)鸡蛋鸡蛋(生、全蛋生、全蛋)鱼鱼(太平洋鳕鱼太平洋鳕鱼)鱼鱼(金枪鱼、白色、罐装、金枪鱼、白色、

13、罐装、油浸、滴干的固体油浸、滴干的固体)18.529.123.117.612.517.926.5食品中蛋白质的含量食品中蛋白质的含量 测测定定食食品品中中的的蛋蛋白白质质的的含含量量，对对于于评评价价食食品品的的营营养养价价值值，合合理理开开发发利利用用食食品品资资源源、提提高高产产品品质质量量、优优化化食食品品配配方方、指指导导经经济济核核算算及及生生产产过过程控制均具有极其重要的意义。程控制均具有极其重要的意义。二、蛋白质系数二、蛋白质系数 不不同同的的蛋蛋白白质质其其氨氨基基酸酸构构成成比比例例及及方方式式不不同同，故故各各种种不不同同的的蛋蛋白白质质其其含含氮氮量量也也不不同同，一一般

14、般蛋蛋白白质质含含氮氮量量为为16%，即即一一份份氮氮素素相相当当于于6.25份份蛋蛋白白质质，此此数数值值（6.25）称称为为蛋白质系数蛋白质系数。不不同同种种类类食食品品的的蛋蛋白白质质系系数数有有所所不不同同，如如玉玉米米、荞荞麦麦、青青豆豆、鸡鸡蛋蛋等等为为6.25，花花生生为为5.46，大大米米为为5.95，大大豆豆及及其其制品为制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为，牛乳及其制品为6.38。一般手册上列出了一部分换称等数，用时可查。三、蛋白质含量测定常用的方法三、蛋白质含量测定常用的方法1.1.凯氏定氮法凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，现发展为

15、年提出，现发展为常量、微量、自动常量、微量、自动定氮仪法定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。，半微量法及改良凯氏法。凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机凯氏定氮法是目前普遍采用的测定有机N N总量较为准总量较为准确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用确、方便的方法之一，适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也是较为广泛。是经典的分析方法之一，也是GB/T 5009.5-GB/T 5009.5-20032003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法。第一法。三、蛋白质含量测定常用的方法三、蛋白质含量测定常用的方法凯凯氏氏定定氮氮法法是是将将蛋蛋白白质质消消化化，

16、测测定定其其总总N N量量，再再换换算算成成为为蛋蛋白白质质含含量量。食食品品中中的的含含N N物物质质，除除蛋蛋白白质质中中的的氮氮以以外外，还还包包括括氨氨基基酸酸、酰酰胺胺、核核酸酸等等中中的的氮氮等等少少量量的的非非蛋蛋白白质质含含N N物物质，所以该法测定的蛋白质含量应称为质，所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。粗蛋白质。对对于于不不同同的的蛋蛋白白质质，它它的的组组成成和和结结构构不不同同，但但从从分分析析数数据可以得到近似的据可以得到近似的propro的元素组成百分比。的元素组成百分比。元素元素C CH HO ON NS SP P百分比百分比50507 7232316160

17、03 30 03 3（一）、凯氏定氮法（一）、凯氏定氮法 凯凯氏氏定定氮氮法法有有常常量量法法、微微量量法法及及改改良良法法，其其原原理理基基本本相相同同，只只是是所所使使用用的的样样品品数数量量和和仪仪器器不不同同。而而改改良良的的常常量量法法主主要要是是催催化化剂剂的的种种类类、硫硫酸酸和和盐盐类类添添加加量量不不同同，一一般般采采用用硫硫酸酸铜铜、二二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。有有些些样样品品中中含含有有难难以以分分解解的的含含N N化化合合物物，如如：蛋蛋白白质质中中含含有有色色氨氨酸酸、赖赖氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸、脯脯氨氨酸酸等等，

18、单单纯纯以以硫硫酸酸铜铜作作催催化化剂剂，1818小小时时或或更更长长时时间间也也难难以以分分解解，单单独独用用汞汞化化合合物，在短时间内即可，但它有毒性。物，在短时间内即可，但它有毒性。凯氏定氮法凯氏定氮法常量分析（常量分析（macro analysismacro analysis）：）：对对0.1g0.1g以上的试样进行的分析。以上的试样进行的分析。半微量分析（半微量分析（semimicro analysissemimicro analysis）：）：对对10mg10mg100 mg100 mg的试样进行的分析。的试样进行的分析。GB/T GB/T 5413.1-1997 5413.1-1

19、997 婴婴幼幼儿儿配配方方食食品品和和乳乳粉粉蛋蛋白白质质的的测测定定就就是是半半微微量量凯凯氏氏定氮法定氮法微量分析微量分析（micro analysismicro analysis）：对对1mg11mg110 mg10 mg的试样进行的分析。的试样进行的分析。超微量分析（超微量分析（ultramicro analysisultramicro analysis）：）：对对1mg1mg以下的试样进行的分析。以下的试样进行的分析。痕量分析（痕量分析（trace analysistrace analysis）：）：对待测组分的质量分数小于对待测组分的质量分数小于0.01%0.01%的分析。的分析

20、。超超痕痕量量分分析析（ultratrace ultratrace analysisanalysis）：对对待待测测组组分分的的质质量量分分数数小小于于0.0001%0.0001%的分析。的分析。GB/T 14666-2003GB/T 14666-2003分析化学术语分析化学术语（1 1）常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法 原理原理 样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与与硫硫酸酸结结合合成成硫硫酸酸铵铵。然然后后加加碱碱蒸蒸馏

21、馏，使使氨氨蒸蒸出出，用用硼硼酸酸吸吸收收后后再再用用标标准准酸酸滴滴定定，根根据据标标准准酸酸消消耗耗量量可可计计算算出出样样品品中中蛋蛋白白质质含量。含量。a)a)凯氏烧瓶凯氏烧瓶500 mL500 mL或或250 mL250 mL b)b)龙科龙科A A凯氏定氮仪凯氏定氮仪c)c)扭力天平扭力天平 d)d)分析天平分析天平e)e)5 5mLmL移液管移液管 f)f)温度可以控制的电炉温度可以控制的电炉g)g)小漏斗小漏斗 h)h)滴定管滴定管i)i)250 250 mLmL锥形瓶锥形瓶 j)j)玻璃珠玻璃珠 仪仪 器器（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品

22、中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法）仪仪 器器a)a)硫酸铜硫酸铜(CuSOCuSO4 4 5H5H2 2O)O)b)b)硫酸钾硫酸钾c)c)硫酸硫酸(密度为密度为1.84191.8419g/L)g/L)d)d)硼酸溶液硼酸溶液(20(20g/L)g/L)e)e)氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液(400(400g/L)g/L)f)f)盐盐酸酸标标准准滴滴定定溶溶液液 c(HCl)=0.0500 c(HCl)=0.0500 mol/L mol/L 或或硫硫酸酸标标准准滴滴定定溶溶液液 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=0.0500 mol/L)=0.0500 mol/Lg)g)

23、混混合合指指示示液液：1 1份份甲甲基基红红乙乙醇醇溶溶液液 (1(1g/L)g/L)与与5 5份份溴溴甲甲酚酚绿绿乙乙醇醇溶溶液液(1(1g/L)g/L)，临临用用时时混混合合。(也也可可用用2 2份份甲甲基基红红乙乙醇醇溶溶液液(1(1g/L)g/L)与与1 1份次甲基蓝乙醇溶液份次甲基蓝乙醇溶液(1(1g/L)g/L)临用时混合临用时混合)。试试 剂剂（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法）（GB/T 601-2002 GB/T 601-2002 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备标准滴定溶液的制备1 1、配

24、制、配制 按下表的规定量取盐酸，注入按下表的规定量取盐酸，注入1000 mL1000 mL水中，摇匀。水中，摇匀。常常用用酸酸碱碱浓浓度度表表(市市售售商商品品)（GB/T5009.1-2003 GB/T5009.1-2003 食食品品卫卫生生检检验验方方法法 理理化化部部分分 总则总则）盐酸标准滴定溶液的浓度盐酸标准滴定溶液的浓度 c c(HCl)mol/L(HCl)mol/L盐酸的体积盐酸的体积V/mLV/mL1 190900.50.545450.10.19 9试剂名称试剂名称分子量分子量含量含量/(%)(质量分数质量分数)相对密度相对密度浓度浓度/(mol/L)盐酸盐酸36.536381

25、.18(约约)12(HCl)硝酸硝酸63.0265681.416(HNO3)高氯酸高氯酸100.5701.6712(HClO4)磷酸磷酸98.0851.7015(H3PO4)硫酸硫酸98.196981.84(约约)18(H2SO4)盐酸盐酸标准滴定溶液配制与标定标准滴定溶液配制与标定 c(HCl)=0.0500 mol/Lc(HCl)=0.0500 mol/L2 2、标标定定 按按下下表表的的规规定定称称取取于于270270300300高高温温炉炉中中灼灼烧烧至至恒恒重重的的工工作作基基准准试试剂剂无无水水碳碳酸酸钠钠，溶溶于于50 50 mLmL水水中中，加加1010滴滴溴溴甲甲酚酚绿绿-甲

26、甲基基红红指指示示液液，用用配配制制好好的的盐盐酸酸溶溶液液滴滴定定至至溶溶液液由由绿绿色色变变为为暗暗红红色色，煮煮沸沸2 2 minmin，冷冷却却后后继继续续滴滴定定至至溶溶液再呈暗红色。同时做空白试验。液再呈暗红色。同时做空白试验。说明：说明：u称称量量工工作作基基准准试试剂剂的的质质量量的的数数值值小小于于等等于于0.5 0.5 g g时时，按按精精确确至至0.01 0.01 mgmg称称量量;数值大于数值大于0.5 g0.5 g时，按精确至时，按精确至0.1 mg0.1 mg称量。称量。u在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持

27、在6 68 mL/min8 mL/min。盐酸标准滴定溶液的浓度盐酸标准滴定溶液的浓度 c c(HCl)mol/L(HCl)mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/gm/g 1 11.9 1.9 0.50.50.950.950.10.10.20.2u制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的5%5%范围以范围以内。内。u标准滴定溶液的浓度小于等于标准滴定溶液的浓度小于等于0.02 mol/L0.02 mol/L时，应于临用前时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水稀释，必要时重将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并冷却的水

28、稀释，必要时重新标定。新标定。u除另有规定外，标准滴定溶液在常温除另有规定外，标准滴定溶液在常温15152525下保存时间下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现一般不超过两个月。当溶液出现浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新制备。象时，应重新制备。u贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，壁厚最薄处不小于壁厚最薄处不小于0.5 mm0.5 mm。（GB/T 601-2002 GB/T 601-2002 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备）标准滴定溶液的制备）1 1、配制、配制 按下表的规定量取硫酸，缓缓往

29、入按下表的规定量取硫酸，缓缓往入1000 mL1000 mL水中，冷却，摇匀。水中，冷却，摇匀。2 2、标标定定 按按下下表表的的规规定定称称取取于于270270300 300 高高温温炉炉中中灼灼烧烧至至恒恒重重的的工工作作基基准准试试剂剂无无水水碳碳酸酸钠钠，溶溶于于50 50 mLmL水水中中，加加1010滴滴溴溴甲甲酚酚绿绿-甲甲基基红红指指示示液液，用用配配制制好好的的硫硫酸酸溶溶液液滴滴定定至至溶溶液液由由绿绿色色变变为为暗暗红红色色，煮煮沸沸2 2 minmin，冷冷却却后后继继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。硫酸标准滴定溶液的浓度

30、硫酸标准滴定溶液的浓度 c(1/2H2SO4)mol/Lmol/L硫酸的体积硫酸的体积V/mL/mL1 130300.50.515150.10.13 3硫酸标准滴定溶液的浓度硫酸标准滴定溶液的浓度c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)/mol/L)/mol/L工作基准试剂无水碳酸钠的质量工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/gm/g 1 11.9 1.9 0.50.50.950.950.10.10.20.2硫酸硫酸标准滴定溶液标准滴定溶液 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=0.0500 mol/L)=0.0500 mol/L溴甲酚绿甲基红溴甲酚绿甲基红指示液指示液（GB/T 5

31、009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法）（GB/T GB/T 603-2002 603-2002 化化学学试试剂剂 试试验验方方法法中中所所用用制制剂剂及及制制品品的的制备制备）溶液溶液I I：称取称取0.1g 0.1g 溴甲酚绿，溶于乙醇溴甲酚绿，溶于乙醇(95%)(95%)，用乙醇，用乙醇(95%)(95%)稀释至稀释至100 mL100 mL。溶液溶液：称取称取0.2 g0.2 g甲基红，溶于乙醇甲基红，溶于乙醇(95%)(95%)，用乙醇，用乙醇(95%)(95%)稀释至稀释至100 mL100 mL。取取30 mL30

32、mL溶液溶液I I、10 mL10 mL溶液溶液，混匀。，混匀。消化蒸馏吸收滴定凯氏定氮法步骤步骤总反应式：总反应式：2NH2NH2 2（CHCH2 2）2 2COOH+13HCOOH+13H2 2SOSO4 4 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4+6CO+6CO2 2+12SO+12SO2 2+16H+16H2 2O O（一定（一定要用浓要用浓硫酸硫酸-98-98%）样品消化样品消化 加加硫酸钾硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸

33、点，但效果不如硫酸钾。硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。为缩短消化时为缩短消化时间间硫酸铜硫酸铜 作作为为催催化化剂剂同同时时作作为为消消化化终终点点指指示示剂剂。也也可可加加氧氧化化汞汞、汞汞（均均有有毒毒，价价格格贵贵）、硒硒粉粉、二二氧氧化化钛钛。所所以以有有机机物物全全部部消消化化后后，出出现现硫硫酸酸铜铜的的兰兰绿绿色色，它它具具有有催催化化功功能能，还可以作为碱性反应指示剂。还可以作为碱性反应指示剂。氧化剂氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。样品消化样品消化要注意防要注意防止爆沸止爆沸消化液消化液 +40%+40%氢氧化

34、钠加热蒸馏，放出氨气。氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。2NaOH+2NaOH+（NHNH4 4）2 2SOSO4 4 2NH 2NH3 3+Na+Na2 2SOSO4 4+H+H2 2O O蒸蒸 馏馏蒸馏蒸馏:一：加入氢氧化一：加入氢氧化钠溶液要过量钠溶液要过量;二：要防止样液二：要防止样液中氨气逸出。中氨气逸出。用用4%4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰兰+甲基红。甲基红。指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸）（碱）（碱）（酸）

35、（酸）吸收吸收滴定滴定吸收吸收与滴定与滴定2NH2NH3 3+4H+4H3 3BOBO3 3 (NH (NH4 4)2 2B B4 4O O7 7(NH(NH4 4)2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O+2HCl 2NHO+2HCl 2NH4 4Cl+4HCl+4H3 3BOBO3 3 用过量的用过量的 H H2 2SOSO4 4 或或 HClHCl标准溶液吸收，再用标准溶液吸收，再用 NaOH NaOH 标标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。凯氏定氮法凯氏定氮法分析步骤分析步骤再次说明再次说明（一）试样处理（一）试样处理 1 1、称样、

36、称样 (约相当氮约相当氮30 30 40 mg)40 mg)（1 1）固体试样：）固体试样：0.200.202.00 g2.00 g（2 2）半固体试样）半固体试样：2.002.005.00 g5.00 g（3 3）液体试样：）液体试样：10.0010.0025.00 mL25.00 mL 2 2、消化准备、消化准备 将试样移入洗净、烘干、编号的将试样移入洗净、烘干、编号的100 mL100 mL或或500 mL500 mL的凯氏烧瓶内的凯氏烧瓶内 ，加入，加入0.2 g0.2 g硫酸铜，硫酸铜，6 g6 g硫酸钾及硫酸钾及20 mL20 mL硫酸，加入硫酸，加入2 2粒粒3 3粒玻璃珠，稍粒

37、玻璃珠，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以4545角斜支于有角斜支于有小孔的石棉网上。小孔的石棉网上。GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法）3 3、消化、消化 将准备好的凯氏烧瓶以将准备好的凯氏烧瓶以4545斜放于温控电炉上（先垫上石斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），待内容物全部炭化待内容物全部炭化,泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后

38、，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力散尽后升至高温，加强火力,并保持瓶内液体微沸并保持瓶内液体微沸,（为加快消化速度（为加快消化速度,可可分数次加入分数次加入10 mL 30%10 mL 30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）,经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，再继续加热再继续加热0.50.51h1h。然后取下并使之冷。然后取下并使之冷却。却。消消 化化（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动

39、或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。4 4、定容定容 将消化好并冷却至室温的样品消化液加入将消化好并冷却至室温的样品消化液加入20 mL20 mL蒸馏水摇匀蒸馏水摇匀放冷，小心转移到放冷，小心转移到100 mL100 mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，并将洗液一并转入容量瓶中，直至烧瓶洗至中性直至烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地移入容，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，量瓶中，充分摇匀后，静置至室温静置至室温，加水至刻度线定容，混匀备用。，加水至刻度线定容，混匀备用。同样条件下做

40、同样条件下做一一试剂试剂空白试验空白试验。消消 化化蒸蒸 馏馏（二）（二）蒸馏蒸馏1 1、水水蒸蒸汽汽发发生生器器的的准准备备：按按要要求求安安装装好好定定氮氮装装置置，保保证证管管路路密密闭闭不不漏漏气气。于于水水蒸蒸气气发发生生瓶瓶内内装装水水至至2/3处处，加加甲甲基基红红指指示示剂剂3滴滴及及35 mL硫硫酸酸，以以保保持持水水呈呈酸酸性性（防防止止水水中中含含有有N，加加硫硫酸酸使使成成为为(NH4)2SO4形形式式固固定定下下来来，蒸蒸馏馏中中不不会会被被蒸蒸发发），开开通通电电源源加加热热煮煮沸沸水水蒸气发生瓶内的水。蒸气发生瓶内的水。蒸蒸 馏馏2 2、清清洗洗凯凯氏氏定定氮氮仪

41、仪：打打开开进进气气口口，关关闭闭废废液液出出口口，接接通通冷冷凝凝水水，空空蒸蒸5 10 min，冲冲冼冼定定N仪仪、样样杯杯、碱碱杯杯和和内内室室。分分别别关关闭闭进进气气口口（注注意意不不要要同同时时关关闭闭所所有有进进气气口口！），使使废废液液自自动动倒倒吸吸于于定定氮氮仪仪外外室室，再再由由样样杯杯加加入入少少量量水水，冲冲冼冼再再次次，当当废废液液全全部部吸吸入入外外室室后，再放排液口，并使其敞开。后，再放排液口，并使其敞开。3 3、吸吸收收液液准准备备：在在250 mL锥锥形形瓶瓶中中加加入入10 mL(20 g/L)硼硼酸酸溶溶液液和和13滴滴混混合合指指示示剂剂，放放置置冷冷

42、凝凝器器的的下下端端，并并使使冷冷凝凝管管下下端端插入液面下。插入液面下。4 4、蒸蒸馏馏准准备备：准准确确吸吸取取10mL试试样样处处理理液液，由由样样杯杯（小小漏漏斗斗）流流入入定定氮氮仪仪内内室室（反反应应室室），并并用用10 mL水水冲冲洗洗样样杯杯（小小漏漏斗斗）使使流流入入定定氮氮仪仪内内室室（反反应应室室内内）但但内内室室中中溶溶液液总总体体积积不不超超过过内内室室的的2/3(约约50 mL)，塞塞紧紧棒棒状状玻玻塞塞，加加水水至至杯杯口口12cm，以以防防漏漏气气，关关闭闭排排液液口口，迅迅速速由由碱碱杯杯缓缓缓缓加加入入10 mL氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液(400 g/L)，夹

43、夹紧紧螺螺旋旋夹夹，通通入入蒸蒸汽汽开开始始蒸馏。蒸馏。蒸蒸 馏馏5 5、蒸蒸馏馏：关关闭闭排排液液口口，蒸蒸汽汽进进入入反反应应室室（内内室室），NH3通通过过冷冷凝凝管管进进入入接接收收瓶瓶被被硼硼酸酸吸吸收收，蒸蒸馏馏5 min，移移开开接接收收瓶瓶，使使冷冷凝凝管管下下端端离离开开液液面面，再再蒸蒸馏馏1 min，然然后后，用用少少量量水水冲冲冼冼冷冷凝凝管管下下端端外外部部，洗洗液液一一并并聚聚集集于于硼硼酸溶液中。酸溶液中。6 6、收收尾尾：关关闭闭进进气气口口，停停止止送送气气，废废液液将将自自动动倒倒吸吸入入外外室室，待待倒倒吸吸完完全全时时，将将样样杯杯中中的的蒸蒸馏馏水水分

44、分数数次次放放入入，冲冲冼冼内内室室，待待洗洗液液全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。按按上上述述步步骤骤，换换下下一一试试样样蒸蒸馏馏。同同时时准准确确吸取吸取10 mL试剂空白消化液作空白试验。试剂空白消化液作空白试验。蒸蒸 馏馏滴滴 定定 取下接收瓶取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准滴定溶液以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0.05 mol/L)滴定至滴定至灰色或蓝紫色灰色或蓝紫色为终点。为终点。结果计算结果计算W W蛋白质含量；蛋白质含量；c c盐酸标准液的浓度，盐酸标准液的浓度，mol/Lmol/L；V V1 1滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，滴定样品

45、蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mLmL；V V2 2滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mLmL；m m样品质量，样品质量，g g；M-1/2 NM-1/2 N2 2的摩尔质量，的摩尔质量，14.01 g/mol;14.01 g/mol;F F蛋白质系数蛋白质系数.适用范围适用范围 此法用于各类食品中蛋白质含量此法用于各类食品中蛋白质含量的测定，是国家标准分析方法。的测定，是国家标准分析方法。.说明说明a)a)所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制;b)b)消消化化时时不不要要用用强强火火，应应保保持持缓缓和和沸沸腾腾，以以免免粘粘贴贴在在凯凯

46、氏氏瓶瓶内内壁壁上上的的含含氮氮化化合合物物在在无无硫硫酸酸存存在在的情况下消化不完全而造成氮损失的情况下消化不完全而造成氮损失;c)c)消消化化时时应应注注意意不不时时转转动动凯凯氏氏烧烧瓶瓶，以以便便利利用用冷冷凝凝酸酸液液将将附附在在瓶瓶壁壁上上的的固固体体残残渣渣洗洗下下，并并促促进进其消化完全其消化完全;d)d)样样品品中中若若含含脂脂肪肪较较多多时时，消消化化过过程程中中易易产产生生大大量量泡泡沫沫，为为防防止止泡泡沫沫溢溢出出瓶瓶外外，在在开开始始消消化化时时应应用用小小火火加加热热，并并时时时时摇摇动动；或或者者加加入入少少量量辛辛醇醇或或液液体体石石蜡蜡或或硅硅油油消消泡泡剂

47、剂，并并同同时时注意控制热源强度注意控制热源强度;e)e)当当样样品品消消化化液液不不易易澄澄清清透透明明时时，可可将将凯凯氏氏烧烧瓶瓶冷冷却却，加加入入3030过过氧氧化化氢氢 2 23 3 mL mL 后后再再继继续加热消化续加热消化;f)f)若若取取样样量量较较大大，如如干干试试样样超超过过5 5 g g可可按按每每克克试试样样5 5 mLmL的的比例增加硫酸比例增加硫酸用量用量;g)般般消消化化至至呈呈透透明明后后，继继续续消消化化3030分分钟钟即即可可，但但对对于于含含有有特特别别难难以以消消化化的的样样品品，如如含含赖赖氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸或或脯脯氨

48、氨酸酸等等时时，需需适适当当延延长长消消化化时时间间。有有机机物物如如分分解解完完全全，消消化化液液呈呈蓝蓝色色或或浅浅绿绿色色，但但含含铁铁量量多多时时，呈呈较深绿较深绿色色;h)h)蒸馏装置蒸馏装置不能不能漏气漏气;i)i)蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量;j)j)蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸管口，再蒸1 1分钟后关掉热源，否则可能造成分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。吸收液倒吸。（二）、（二）、微量凯氏

49、定氮法微量凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2 2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸加入硼酸量量由由 50 mL 50 mL 10 10 mL,mL,滴定用盐酸浓度滴定用盐酸浓度由由 0.1 0.1 mol/L mol/L 0.01 mol/L,0.01 mol/L,可用微量滴定管可用微量滴定管。10-210-2（三）、（三）、全自动凯氏定氮法全自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2 2、特点：、特点：（1 1）消消化化装装置置用用优优质质玻玻璃璃制制成成的的凯凯氏氏消消化化瓶瓶，红红外外线线加热的消化炉。加热的消化炉。（2 2）快快速速

50、：一一次次可可同同时时消消化化8 8个个样样品品，3030分分钟钟可可消消化化完毕。完毕。（3 3）自自动动：自自动动加加碱碱蒸蒸馏馏，自自动动吸吸收收和和滴滴定定，自自动动数数字字显显示示装装置置。可可计计算算总总氮氮百百分分含含量量并并记记录录，1212分分钟钟完完成成1 1个样。个样。产品名称：产品名称：凯氏定氮仪凯氏定氮仪操操 作作 视视 频频微量凯氏定氮法：http:/ http:/ m 54 s)传传统统的的凯凯氏氏定定氮氮法法应应用用范范围围广广，灵灵敏敏度度高高、准确，不要大仪器，但费时，有环境污染。准确，不要大仪器，但费时，有环境污染。新开发的：新开发的：（四）、（四）、双缩