3流式细胞凋亡分析.ppt

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1、流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析概概 念念 细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosisapoptosis）是指有核细胞）是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，在一定条件下通过启动其内部自身机制，主要是通过内源性主要是通过内源性DNADNA内切酶的激活而发生内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。一种普遍存在的现象。概概 念念 细胞凋亡是维持人体正常生理过程和细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活功能活动所必需的，是多细

2、胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。概概 念念 细胞凋亡与细胞坏死（细胞凋亡与细胞坏死（necrosisnecrosis）是）是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反应。程，并可导致周围组织的炎症反应。概概 念念细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：细胞凋亡的作用主要包括以

3、下几方面：清除无功能的细胞；清除无功能的细胞；控制细胞数量；控制细胞数量；清除病态的或有害的细胞；清除病态的或有害的细胞；清除多余的细胞；清除多余的细胞；细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链胞核双链DNADNA发生裂解所致。发生裂解所致。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：DNA

4、DNA降解后，形成长度主要为降解后，形成长度主要为180-180-200bp200bp的的DNADNA片断，随后细胞裂解成许多有片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体（膜包被的小体，称为凋亡小体（apoptotic apoptotic bodies),bodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学

5、特征：电镜下，细胞核内可见高电子密度区，电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核这是核DNADNA在核小体连接处断裂成核小体后，在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱

6、。致密、紊乱。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸（丝氨酸（phosphatidylserine,psphosphatidylserine,ps)和凝血和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。胞的清除有关。细胞凋亡

7、的特征细胞凋亡的特征形态学特征：形态学特征：凋亡细胞另一个形态特征通过总凋亡细胞另一个形态特征通过总DNADNA提提取取，DNADNA凝胶电泳分析凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱可呈现出梯状图谱，可见清晰的可见清晰的DNADNA梯子梯子(ladder)(ladder)。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 1 caspasecaspase蛋白酶：蛋白酶：细胞凋亡的发生和发展过程也可能是细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子结构水解酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如的物质如DNADNA、细胞骨架水解变性成小分子、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致使细胞发

8、生凋亡。碎片，致使细胞发生凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 1 caspasecaspase蛋白酶：蛋白酶：其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为有相同的结构和功能特性而被称为caspasecaspase。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 1 caspasecaspase蛋白酶：蛋白酶

9、：caspasecaspase可能在凋亡细胞的形态变化中可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。起了主导作用。CaspaseCaspase通常是以酶原形式通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的为有活性的酶，活化的caspasecaspase进一步激活进一步激活其他的其他的caspasecaspase前体，形成了级联放大切割前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 1 caspasecaspase蛋白酶：蛋白酶：目前已

10、发现目前已发现1515个个caspasecaspase家族成员，分家族成员，分别命名为别命名为caspase-1caspase-11515，并根据其功能特，并根据其功能特点分成两类，即启动点分成两类，即启动caspase(caspase-2caspase(caspase-2、8 8、9 9、1010）和效应）和效应caspase(caspase3caspase(caspase3、6 6、7 7）。）。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 1 caspasecaspase蛋白酶：蛋白酶：启动启动caspasecaspase作用于凋亡信号触发后上作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。

11、效应游的不可逆位点。效应caspasecaspase由启动胱冬由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。凋亡的信号。bcl-2bcl-2家族成员能调节执行位家族成员能调节执行位点的进程。点的进程。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：1 1 caspasecaspase蛋白酶：蛋白酶：caspase-3caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为是最重要的指示蛋白酶，为17kD17kD和和12

12、kD12kD亚单位组成的异二聚体。活化亚单位组成的异二聚体。活化的的caspase-3caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他可以蛋白水解切割和激活其他caspasecaspase、相关的胞质靶位点（细胞因子、相关的胞质靶位点（细胞因子1818，CK18)CK18)和细胞核靶位点。和细胞核靶位点。Caspase-3Caspase-3切割切割CK18CK18是凋亡过程中是凋亡过程中caspasecaspase切割发生的早期切割发生的早期指示因子。指示因子。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：2 2 核酸内切酶的激活：核酸内切酶的激活：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激细胞凋亡时，内

13、源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接活，将核小体间连接DNADNA降解，形成长度主降解，形成长度主要为要为180-200bp180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在不改变。在DNADNA凝胶电泳分析中呈现出特征凝胶电泳分析中呈现出特征性性“梯状梯状”条带，而细胞坏死时，条带，而细胞坏死时，DNADNA片断片断大小不一，无大小不一，无“梯状梯状”条带出现。但并非条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。特征。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生

14、化特征：生化特征：2 2 核酸内切酶的激活：核酸内切酶的激活：细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化：线粒体发生的重要改变之一就是凋亡线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。联。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化：线粒体膜电

15、位的变化发生在细胞凋亡线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的相关的bcl-2bcl-2家族分布在细胞内膜系统，其家族分布在细胞内膜系统，其中线粒体外膜上分布最多，中线粒体外膜上分布最多，bcl-2bcl-2具有抑制具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通过此途径线粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。抑制细胞凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞

16、质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：细胞内细胞内CaCa2+2+和和H H+浓度的稳定对维持生命浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内活动至关重要。胞内CaCa2+2+库的释放，胞质库的释放，胞质CaCa2+2+与细胞凋亡关系密切。胞外与细胞凋亡关系密切。胞外CaCa2+2+内流促使内流促使胞质胞质CaCa2+2+持续升高，作为凋亡信号启动凋亡持续升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。发生。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：此外，此外，CaCa2+2+的释放打破了细胞内结构的的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡

17、效应系统的关键成分稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。接触，从而触发细胞凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：细胞细胞pHpH的变化可影响细胞凋亡。细胞的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时伴随胞质凋亡时伴随胞质pHpH降低，胞质酸化影响细降低，胞质酸化影响细胞凋亡。胞质胞凋亡。胞质pHpH降低可能与胞质降低可能与胞质CaCa2+2+升高有升高有关。胞质酸化主要通过激活酸性关。胞质酸化主要通过激活酸性DNaseDNase启启动细胞

18、凋亡。动细胞凋亡。pHpH降低也影响了一些酸性功降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 细胞凋亡受基因的调控，其机制非常细胞凋亡受基因的调控，其机制非常复杂。凋亡基因可分为两类：复杂。凋亡基因可分为两类：1 1诱导基因：野生型诱导基因：野生型p53p53基因、基因、c-mycc-myc、细胞、细胞表面抗原基因表面抗原基因Apo-1(Fas)Apo-1(Fas)等等2 2抑制基因：抑制基因：bcl-2bcl-2、突变型、突变型p53p53基因和基因和rasras基因等基因等 细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 上述

19、两类基因蛋白产物的表达对凋亡上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调，可提高细胞对凋亡信号的敏感性，上调，可提高细胞对凋亡信号的敏感性，促进凋亡发生。抑制基因蛋白产物表达，促进凋亡发生。抑制基因蛋白产物表达，可降低细胞对凋亡信号的敏感性，抑制或可降低细胞对凋亡信号的敏感性，抑制或推迟凋亡。推迟凋亡。细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控 诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行平衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控，维持细胞群体的正常稳定性。当调调控，维持细胞群体的正

20、常稳定性。当调控失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、控失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、AIDSAIDS、霍奇金淋巴瘤等。霍奇金淋巴瘤等。细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：1 bcl-2 1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。是研究最早的与凋亡有关的基因。bcl-2bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、制由许多因子，如化疗药物、某些病

21、毒、p53p53、c-mycc-myc及生长因子等激发的凋亡。及生长因子等激发的凋亡。细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：2 p53 2 p53 p53p53基因不仅是一种与肿瘤发生、发基因不仅是一种与肿瘤发生、发展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、分化及死亡的调控。分化及死亡的调控。P53P53在调节凋亡中起重在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或线或gammagamma射线照射后，含正常射线照射后，含正常p53p53的细胞，的细胞，可发生凋亡，而可发生凋

22、亡，而p53p53基因缺失或突变的细胞基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。野生型野生型p53p53对凋亡起促进作用，突变型对凋亡起促进作用，突变型p53p53对凋亡起抑制作用。对凋亡起抑制作用。细胞凋亡的基因调控细胞凋亡的基因调控常见的凋亡基因及其蛋白：常见的凋亡基因及其蛋白：3 3 FasFas和和FasFas配体配体 FasFas是肿瘤坏死因子是肿瘤坏死因子（TNFTNF）受体和神经生长因子受体家族的细）受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。胞表面分子。FasFas配体（配体（FasFas ligand,FasLligand,Fa

23、sL)是是TNFTNF家族的细胞表面分子。家族的细胞表面分子。FasLFasL与其受体与其受体FasFas结合导致携带结合导致携带FasFas的细胞凋亡。抗的细胞凋亡。抗FasFas抗抗体、表达体、表达FasLFasL的细胞和可溶性的的细胞和可溶性的FasLFasL与与FasFas交联均产生细胞凋亡信息，而交联均产生细胞凋亡信息，而bcl-2bcl-2过度表过度表达能抑制达能抑制FasFas致凋亡作用。致凋亡作用。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：以往，细胞增殖的失调、细胞分化与以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。增殖紊乱被认为是恶性肿

24、瘤的发生机制。近来，人们认识到在肿瘤细胞快速增殖过近来，人们认识到在肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间程中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡有可能决定着肿瘤的生长速度。细的平衡有可能决定着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减少，在肿瘤发生、发展中起着胞凋亡的减少，在肿瘤发生、发展中起着重要作用。重要作用。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：凋亡调节基因的紊乱、凋亡机制蛋白凋亡调节基因的紊乱、凋亡机制蛋白的增加是肿瘤形成的重要机制。用于调控的增加是肿瘤形成的重要机制。用于调控肿瘤细胞凋亡的基因主要有肿瘤细胞凋亡的基因主要有bcl-2bcl-2基因家族、基因

25、家族、p53p53基因、基因、FasFas基因家族和基因家族和c-mycc-myc基因家族。基因家族。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见凋亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化凋亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化生等病变中起决定性作用，但胃癌的凋亡生等病变中起决定性作用，但胃癌的凋亡指数低于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘指数低于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘膜病变细胞凋亡减少、生存期延长、细胞膜病变细胞凋亡减少、生存期延长、细胞大量堆积可能是胃癌发生、浸润及转移的大量堆积可能是胃癌发生、浸润及转移的基础。基础。细

26、胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与肿瘤：细胞凋亡与肿瘤：凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指数与肿瘤内部微血管密度成负相关，凋亡指数与肿瘤内部微血管密度成负相关，并与胃癌的组织类型有关。并与胃癌的组织类型有关。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：许多以免疫功能异常为主要特征的疾许多以免疫功能异常为主要特征的疾病均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫病均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形态的发生分化以及抗感染免疫和自身免形态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的发生中起重要作用。疫病的发生中起重要作用。细胞凋亡与疾病细胞凋亡

27、与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：当凋亡过少、炎症反应过强时，易造当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及以及CD40/CD40LCD40/CD40L之之间的相互作用起了重要作用。它们通过激间的相互作用起了重要作用。它们通过激活活T T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B B淋巴细淋巴细胞，进一步

28、调节免疫反应的强弱。胞，进一步调节免疫反应的强弱。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：当凋亡过少、炎症反应过强时，易造当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及以及CD40/CD40LCD40/CD40L之之间的相互作用起了重要作用。它们通过激间的相互作用起了重要作用。它们通过激活活T T淋巴细胞

29、的自杀或杀伤激活的淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B B淋巴细淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。胞，进一步调节免疫反应的强弱。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：细胞凋亡与免疫系统疾病：近来研究发现，淋巴细胞凋亡作用的近来研究发现，淋巴细胞凋亡作用的缺陷与系统性红斑狼疮（缺陷与系统性红斑狼疮（SLESLE）的发生、发）的发生、发展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是自身基因调控异常的结果。目前已明确定自身基因调控异常的结果。目前已明确定义为自身基因的有义为自身基因的有FasFas和和bcl-2bcl-2等。等。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与

30、皮肤病：细胞凋亡与皮肤病：某些皮肤病是以凋亡的增加为特征。某些皮肤病是以凋亡的增加为特征。银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡的银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡的形态学和生化特征。形态学和生化特征。plaqueplaque基底细胞层基底细胞层bcl-2bcl-2阳性细胞数显著下降。阳性细胞数显著下降。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡与皮肤病：细胞凋亡与皮肤病：自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫异常与自身反应性病等，其免疫异常与自身反应性T T、B B淋巴淋巴细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、发展与细胞凋亡基

31、因调控失常而导致凋亡发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自动消退有关。动消退有关。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病：以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是由于神经元广泛坏死所致。近来研究表是由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明，全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过明，全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域程。大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经细胞很快坏死，但周围的神经细胞，神经细胞很快坏死，但周围的神经细胞，以海马以海马

32、CAICAI区的锥形细胞最为明显，要经过区的锥形细胞最为明显，要经过一个潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，一个潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，即细胞凋亡。即细胞凋亡。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病：这种凋亡发生在缺血后这种凋亡发生在缺血后1-21-2天，并在缺天，并在缺血周边区域出现血周边区域出现bcl-2bcl-2蛋白的表达。而且，蛋白的表达。而且，不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管壁中也有表达，这提胞、内皮细胞和血管壁中也有表达，这提示非致死性的损伤导致细胞产生示非致死性的损伤导致细胞

33、产生bcl-2bcl-2，以，以抵抗细胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组抵抗细胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组织中检测到织中检测到FasFas抗原抗原mRNAmRNA明显增加，提示明显增加，提示FasFas在凋亡中起一定作用。在凋亡中起一定作用。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病缺血性脑损伤和缺血性心脏病：缺血性脑损伤和缺血性心脏病：除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌细胞死亡的重要方式。在体心脏实验心肌细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再灌注损伤和心肌梗死均能诱发心表明，再灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌梗死肌细胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌

34、梗死的大小取决于细胞凋亡的严重程度，凋亡的大小取决于细胞凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性心脏病演化为心力衰竭的细可能是缺血性心脏病演化为心力衰竭的细胞学机制。胞学机制。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病感染性疾病：感染性疾病：HIVHIV感染可导致感染可导致AIDSAIDS。其感染的细胞学。其感染的细胞学特征是特异性破坏特征是特异性破坏CD4+TCD4+T淋巴细胞，造成相淋巴细胞，造成相关免疫功能缺陷，导致感染和肿瘤。在关免疫功能缺陷，导致感染和肿瘤。在HIVHIV感染过程中，从感染过程中，从HIVHIV对对CD4+TCD4+T淋巴细胞黏附、淋巴细胞黏附、病毒颗粒进入细胞、病毒颗粒进入细胞、HIVH

35、IV基因组在细胞中复基因组在细胞中复制和装配以及出芽释放等环节，都与细胞制和装配以及出芽释放等环节，都与细胞凋亡密切相关。凋亡密切相关。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病其他疾病：其他疾病：肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均发现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小发现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小球硬化和肾功能衰竭有关。血管动脉粥样球硬化和肾功能衰竭有关。血管动脉粥样硬化形成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋硬化形成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋亡同时存在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制、亡同时存在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制、粥样病灶的形成和斑块的剥脱有一定的影粥样病灶的形成和斑块的剥

36、脱有一定的影响。响。细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病 通过对各种疾病细胞凋亡的研究，使通过对各种疾病细胞凋亡的研究，使我们对疾病的发生机制有了新的认识，同我们对疾病的发生机制有了新的认识，同时也为疾病的治疗提供了新的思路。时也为疾病的治疗提供了新的思路。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。在光学显微镜或电子显微镜下观察。流式细胞

37、分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。如通在光学显微镜或电子显微镜下观察。如通过苏木素过苏木素-伊红（伊红（HE)HE)染色、吉姆萨染色、吉姆萨（GiemsaGiemsa)染色、甲基绿染色、甲基绿-哌诺宁染色在普哌诺宁染色在普通光学显微镜下观察；通过荧光染料如丫通光学显微镜下观察；通过荧光染料如丫啶橙（啶橙（AO)AO)、Heochs

38、t33258Heochst33258染色在荧光显微染色在荧光显微镜下观察；或制成超薄切片用电子显微镜镜下观察；或制成超薄切片用电子显微镜观察，以区别凋亡和坏死。观察，以区别凋亡和坏死。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 FCMFCM可间接观察凋亡细胞形态学变化，可间接观察凋亡细胞形态学变化，主要是根据未经染色的凋亡细胞的光散射主要是根据未经染色的凋亡细胞的光散射特征进行检测。特征进行检测。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 FCMFCM提供的散射光参数主要包括前向散提供的散射光参数主要包括前向散射光（射光（FSCFSC）和测向

39、散射光（）和测向散射光（SSCSSC）。）。FSCFSC主主要与细胞大小有关，对同一个细胞群体，要与细胞大小有关，对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些，散射光弱的，散射光强的，其细胞大一些，散射光弱的，其细胞小一些。其细胞小一些。SSCSSC主要与细胞内部颗粒密主要与细胞内部颗粒密度有关，颗粒密度越大，度有关，颗粒密度越大，SSCSSC就越大，而颗就越大，而颗粒密度越小，粒密度越小，SSCSSC就越小。就越小。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、细胞皱缩，因此这一阶段凋亡细胞细胞皱缩，因

40、此这一阶段凋亡细胞FSCFSC较活较活细胞小，而细胞小，而SSCSSC较之增强或无明显变化。较之增强或无明显变化。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩更加明显，核质的变化导致细胞内颗粒密更加明显，核质的变化导致细胞内颗粒密度明显增强，度明显增强，FSCFSC进一步变小，而进一步变小，而SSCSSC却明却明显增大。最终，当凋亡小体形成时，显增大。最终，当凋亡小体形成时，FSCFSC明明显缩小。显缩小。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 此外，也可通过此外，也可通过F

41、SCFSC区分坏死细胞和凋区分坏死细胞和凋亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其FSCFSC增大，增大，SSCSSC在细胞坏死时也增大。但晚在细胞坏死时也增大。但晚期凋亡细胞的期凋亡细胞的FSCFSC和和SSCSSC与坏死细胞区分不与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的细胞膜破裂，核质丢明显。当坏死细胞的细胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时，其失，细胞成为碎片时，其FSCFSC和和SSCSSC均明显均明显变小。变小。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡形态学特征检测形态学特征检测 但实际上，由于被检测细胞形态上的但实际上

42、，由于被检测细胞形态上的均一性和核均一性和核/质比例不同，凋亡不同阶段的质比例不同，凋亡不同阶段的细胞，其光散射参数的变化不同，有时很细胞，其光散射参数的变化不同，有时很难准确检测到凋亡细胞。但将光散射参数难准确检测到凋亡细胞。但将光散射参数与荧光标记的抗体或荧光染料结合起来检与荧光标记的抗体或荧光染料结合起来检测细胞凋亡，可以克服单纯的光散射参数测细胞凋亡，可以克服单纯的光散射参数的缺点。的缺点。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 凋亡细胞的一个重要特点是很长一段凋亡细胞的一个重要特点是很长一段时间里细胞膜结构未受影响，其主要表现时间里细

43、胞膜结构未受影响，其主要表现为：维持膜的基本功能，如离子和大分子为：维持膜的基本功能，如离子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。的屏蔽作用和具有功能的通道泵。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 根据不同功能状态下的细胞对染料的根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收或排斥作用不同，可用流式细胞仪定吸收或排斥作用不同，可用流式细胞仪定量检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百量检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比。分比。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 处于早处于早/中期的凋亡细胞，仍然保持着

44、中期的凋亡细胞，仍然保持着完整的质膜及其基本功能，阻碍大分子物完整的质膜及其基本功能，阻碍大分子物质及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞或质及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞或坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某些大分子物质及离子可以进入细胞内。因些大分子物质及离子可以进入细胞内。因此，根据对此，根据对DNADNA染料通透性的不同，可区分染料通透性的不同，可区分处于不同阶段的细胞。处于不同阶段的细胞。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 PIPI和和EBEB均属于插入性荧光染料，可选均属于插入性荧光染料，可选择性

45、的定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，择性的定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发射均为橙红色，如果使用氩离子其荧光发射均为橙红色，如果使用氩离子激光激光488nm488nm激发，激发，PIPI的发射光谱波长在的发射光谱波长在610-610-620nm620nm范围，范围，EBEB的发射光谱波长在的发射光谱波长在603-603-610nm610nm之间，二者可互相替代，但之间，二者可互相替代，但EBEB毒性较毒性较大。大。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 7-7-氨基氨基-放线菌素放线菌素D D（7-AAD7-AAD）主要以插）主要以插入方式与

46、入方式与DNADNA链的链的G-CG-C碱基对结合，其激发碱基对结合，其激发波长约为波长约为580nm580nm，最大发射波长为，最大发射波长为660nm660nm，由于其发射波长较大，可与藻红蛋白由于其发射波长较大，可与藻红蛋白（PEPE）结合，通过单一光谱）结合，通过单一光谱488nm488nm的激光光的激光光源激发，可以进行定量源激发，可以进行定量DNADNA和免疫荧光的双和免疫荧光的双参数分析。参数分析。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 由于由于EBEB、PIPI和和7-AAD7-AAD不能进入具有完整不能进入具有完整细胞膜的活细

47、胞中，即正常细胞和凋亡细细胞膜的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在未固定时对这些染料是拒染的，而坏胞在未固定时对这些染料是拒染的，而坏死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。因死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。因此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细胞。胞。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 赫斯特类染料（特别是赫斯特类染料（特别是HO33342)HO33342)检测检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。细胞凋亡的原理与上述染料不同。HO33342HO33342是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与是双苯并咪唑家族成员之一

48、，能特异与DNADNA螺旋中富含螺旋中富含A-TA-T重复序列结合。重复序列结合。HO33342HO33342用用氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为352nm352nm，发射光波长为，发射光波长为400-500nm400-500nm，产生蓝，产生蓝色荧光。色荧光。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 HO33342HO33342能被活细胞摄取，而其从细胞能被活细胞摄取，而其从细胞内排出是一个耗能的主动过程，依赖细胞内排出是一个耗能的主动过程，依赖细胞膜上的膜上的P-P-糖蛋白泵。活细胞染色时，应考糖蛋白泵。活

49、细胞染色时，应考虑是否存在细胞抗药性问题，如有耐药性，虑是否存在细胞抗药性问题，如有耐药性，则染色效果不佳。则染色效果不佳。HO33342HO33342进入凋亡细胞比进入凋亡细胞比正常细胞多，将其与正常细胞多，将其与PIPI结合对凋亡细胞进结合对凋亡细胞进行双染，可将正常细胞、凋亡细胞和坏死行双染，可将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区分开来。细胞区分开来。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡细胞对染料吸收能力的检测细胞对染料吸收能力的检测 在双变量流式细胞仪的散点图上，这在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现为：正常细胞低蓝光三群细胞表现为：正常细胞低蓝光/低红光，低红光，凋亡细胞为高

50、蓝光凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低低红光，坏死细胞为低蓝光蓝光/高红光。高红光。流式细胞分析细胞凋亡流式细胞分析细胞凋亡caspasecaspase的流式细胞仪检测的流式细胞仪检测 caspasecaspase家族在细胞凋亡过程中起着重家族在细胞凋亡过程中起着重要作用，通过要作用，通过caspasecaspase对大分子结构的瀑布对大分子结构的瀑布级联水解反应，导致凋亡发生。其中级联水解反应，导致凋亡发生。其中caspase-3caspase-3是最重要的指示蛋白酶，活化的是最重要的指示蛋白酶，活化的caspase-3caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他的可以蛋白水解切割和激活