8.核酸扩增技术.ppt

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1、分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术温州医学院温州医学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术主要内容第一节第一节聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术第二节第二节荧光定量荧光定量PCR技术技术第三节第三节其他核酸扩增技术其他核酸扩增技术第四节第四节临床基因扩增实验室的管理与质量控制临床基因扩增实验室的管理与质量控制SchoolofLaboratoryMedicine,

2、WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术第一节第一节聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术polymerasechainreaction,PCR一、一、PCR技术发展简史技术发展简史二、二、PCR技术原理技术原理三、三、PCR反应体系、条件及其优化反应体系、条件及其优化四、扩增产物检测及分析四、扩增产物检测及分析五、五、PCR常见问题与原因分析常见问题与原因分析六、六、PCR衍生技术衍生技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块

3、8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR技术发展简史技术发展简史Korana于于1971年最早提出核酸年最早提出核酸体外扩增的设想。体外扩增的设想。1985年年Mullis等发明了具有划等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使时代意义的聚合酶链反应，使用的用的DNA聚合酶是聚合酶是Klenow片段。片段。(1993年诺贝尔化学奖获得者年诺贝尔化学奖获得者)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR技术发展简史技术发展简史1988年初，年初，Keohanog改用改用T4DNA

4、聚合酶进行聚合酶进行PCR。1988年年Saiki发现发现TaqDNA聚合酶，从此聚合酶，从此PCR技术得以技术得以广泛应用。广泛应用。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术基基本本原原理理N=N0(1+E)cSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR反应体系、条件及其优化反应体系、条件及其优化PCR反应体系反应体系模板（模板（templa

5、te）引物（引物（primers）DNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase)dNTPPCR缓冲液（缓冲液（PCRbuffer）PCR反应条件反应条件变性变性退火退火延伸延伸循环循环SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术DNARNA：总：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒病毒RNA基因组DNA质粒DNA模板（模板（template）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学

6、检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物（引物（primers)引物是人工合成的两段引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的物与感兴趣区域一端的一条一条DNA模板链互补，模板链互补，另一个引物与感兴趣区另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条域另一端的另一条DNA模板链互补。模板链互补。3355SenseprimerAntisenseprimerSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物的重要性的重要性在整个在整个PCR体

7、系中体系中,引物占有十分重要的引物占有十分重要的地位。地位。PCR的特异性要求引物与靶的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的特异结合，不与其他非目的DNA结合，结合，PCR的灵敏性要求的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。结果密切相关。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物设计总原则引物设计总原则引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补引物与引物

8、之间避免形成稳定的二聚体或引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA DNA 聚聚合反应合反应(即错配即错配)。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物设计一般原则引物设计一般原则引物长度引物长度碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性Tm值值引物二级结构引物二级结构引物引物3端端引物引物5端端引物的内部稳定性引物的内部稳定性引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构扩增区域的二级结

9、构SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物长度引物长度一般为一般为15-30个核苷酸，个核苷酸，常用的是常用的是18-24 18-24 bpbp。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/

10、400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性GC含量一般含量一般40-60%，推荐推荐45-55%45-55%或或50-60%50-60%。上下游引物的上下游引物的GCGC含量不能相差太大。含量不能相差太大。GC含量太低导致引物含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火值较低，使用较低的退火温度不利于提高温度不利于提高PCR的特异性的特异性GC含

11、量太高也易于引发非特异扩增。含量太高也易于引发非特异扩增。同一碱基连续出现不应超过同一碱基连续出现不应超过5个个SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物Tm值值一般要求：一般要求：55-65。计算：计算：对于低于对于低于20个碱基的引物，个碱基的引物，Tm值可根据值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算来粗略估算对于较长引物，对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学值则需要考虑热动力学参数，从参数，从“最近邻位最近邻位”的计算方式得到，这的计算方式得到，

12、这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6log(K+/(1+0.7K+)-273.15SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物二级结构引物二级结构引物二聚体引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多端有有较多碱基互补碱基互补发夹结构发夹结构尤其是要避免引物尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则端形成发夹结构，否则将严重影响将严重影响DNA聚合酶的延伸

13、。聚合酶的延伸。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物3端端引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3端不不要出现要出现3个以上的连续碱基个以上的连续碱基，如GGG或CCC，否则会使错误引发机率增加。引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合

14、成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基末位碱基为为A的错配效率明显高于其他的错配效率明显高于其他3个碱基个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物5端端引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变点突变以作研

15、究。5端标记标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性保守性：通用引物保守性：通用引物检测同一类病原微生检测同一类病原微生物尽可能多的型别物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增特异性：避免非特异性扩增SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术扩增区域的二级结

16、构扩增区域的二级结构模板模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。扩增区域的自由能（扩增区域的自由能（G。）小于小于58.61kJ/mol引物引物Tm值与值与PCR产物产物Tm值相差一般不超过值相差一般不超过30Tmproduct=81.5+16.6log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length(primerpremier5.0)lTmproduct=81.5+16.6(log10(Na+)+0.41(%G+%C)-600/length

17、(primer3)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物与引物与PCR引物浓度：一般为引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L引物浓度引物浓度(uM)=nOD33/（A312C288G328T303-61）/VH2OVH2O(单位：单位：L)退火温度退火温度最适退火温度（最适退火温度（TaOpt）=0.3(Tmofprimer)+0.7(Tmofproduct)25一般采用较引物一般采用较引物Tm值低值低5作为作为PCR退火温度。退火温度。SchoolofLab

18、oratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物设计软件PrimerPremier5.0OligoPrimerexpressprimer3MethPrimerSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术DNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase)特性：特性：热热稳稳定定性性:92.5、95、97.5时时，半半衰衰期期分分别别为为130min、40min、5-6min延伸效

19、率延伸效率:75-80时，时，150个核苷酸个核苷酸/s校校正正功功能能:TaqDNA聚聚合合酶酶没没有有3-5外外切切酶酶活活性性，Vent、pfu等具有等具有3-5外切酶活性外切酶活性SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术dNTPdNTP：包括包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。量：量：20-200umol/LdNTP会络合会络合Mg2+，当，当PCR需要较高浓度的需要较高浓度的dNTP时，时，应在反应体系中适当增加应在反应体系中适当增加Mg2+浓度。浓度

20、。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR缓冲液（缓冲液（PCRbuffer）一般组成：一般组成：50mMKCl,10-50mMTris-Cl(室温室温PH8.3)，1.5mMMgCl2Mg2+浓度：浓度：附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如剂（如Tween20，浓度浓度0.05%）二甲亚砜）二甲亚砜（DMSO）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物

21、学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR一般方案一般方案反应组成反应组成50ulPCR反应体系的组成：反应体系的组成：样品样品DNA0.11ug；正、负链引物（正、负链引物（25umol/L）各）各1.0ul；脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP各各2.5mmol/L）4.0ul10PCR缓冲液缓冲液5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；TaqDNA聚合酶聚合酶12.5u；蒸馏的去离子水补至蒸馏的去离子水补至50ul，短暂离心混匀。，短暂离心混匀。阳性对照、空白对阳性对照、空白对照分别以阳性模板照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品、蒸馏

22、的去离子水取代样品DNA。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR94,300S94,60S3055,60S72,60S72,5-10min（举例）（举例）（举例）（举例）PCRPCR一般方案一般方案热循环热循环SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR反应体系、条件的优化反应体系、条件的优化三磷酸脱氧核苷酸三磷酸脱氧核苷酸耐热耐热DN

23、A聚合酶聚合酶缓冲液缓冲液模板核酸模板核酸引物引物Mg2+变性温度与时间变性温度与时间复性温度与时间复性温度与时间延伸温度与时间延伸温度与时间循环数和扩增效率循环数和扩增效率降落降落PCR(TouchdownPCR)热启动热启动PCR（hotstartPCR）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术降落降落PCR(TouchdownPCR)根根据据引引物物Tm值值，选选定定一一个个退退火火温温度度范范围围（跨跨越越10-20的的温温度度范范围围，引引物物Tm值值在在这这

24、个个范范围围之之内内）。在在设设置置循循环环参参数数时时，让让退退火火温温度度从从选选定定范范围围的的最最高高温温度度开开始始，逐逐步步降降低低退退火火温温度度（每每次次降降低低1-5），最最后后结结束束在在选选定定范范围围的的最最低低温温度度。在在每每一一个个退退火火温温度度上循环上循环2-5次。次。举举例例：如如果果一一对对引引物物的的Tm值值为为60，可可设设置置退退火火温温度度从从63降降低低到到48，每每次次降降低低1，每每个个退退火火温温度度循循环环两两个个周周期期，最最后后在在48退火温度下做退火温度下做15个循环。个循环。SchoolofLaboratoryMedicine,W

25、enzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术热启动热启动PCR（hotstartPCR）PCR反应体系中先反应体系中先不加不加TaqDNA聚合酶，等聚合酶，等PCR扩增仪的温度上扩增仪的温度上升到升到80以后再加以后再加TaqDNA聚合酶。聚合酶。将石蜡珠在将石蜡珠在Ependorf管中管中PCR反应液上面融化并凝固，在石蜡层反应液上面融化并凝固，在石蜡层上面加上上面加上TaqDNA聚合酶。在温度上升到变性温度时，石蜡融化，聚合酶。在温度上升到变性温度时，石蜡融化，TaqDNA聚合酶进入反应体系，通过对流作用而混匀。聚合酶进入反

26、应体系，通过对流作用而混匀。在在PCR反应液中加入反应液中加入TaqDNA聚合酶的单克隆抗体，再加入聚合酶的单克隆抗体，再加入TaqDNA聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和TaqDNA聚合酶活性，聚合酶活性，TaqDNA聚合酶对引物无法进行延伸。待温度聚合酶对引物无法进行延伸。待温度上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始。上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术扩增产物

27、的检测及分析扩增产物的检测及分析凝胶电泳：凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法PCR-限制性片段长度多态性分析法（限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法核酸探针杂交法PCR产物测序产物测序SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳制胶制胶加样加样电泳电泳紫外光检测紫外光检测SchoolofLaboratoryMedi

28、cine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术特点：特点：分分辨辨力力高高，长长度度仅仅相相差差1bp的的DNA分分子子即即可可分开；分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的回收的DNA纯度高；纯度高；采采用用银银染染色色DNA或或RNA，灵灵敏敏度度高高，比比琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中EB染染色色法法高高2-5倍倍，而而且且避避免免EB易退色的弱点。易退色的弱点。用途：用途：PCR扩增指纹图、多重扩增指纹图、多重PCR。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SchoolofLaboratory

29、Medicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)据据目目的的基基因因序序列列可可查查出出所所包包含含的的酶酶切切位位点点，用用相相应应的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化PCR扩扩增增产产物物，然然后后进进行行电电泳泳，观观察察消消化化片片段段的的大大小小是是否否与与序序列资料相符。列资料相符。用途：用途：传染病病原体基因分型传染病病原体基因分型人类基因的变异性研究。人类基因的变异性研究。SchoolofLabo

30、ratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术单链构型多态性分析法单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCP）将将PCR产物双链产物双链DNA（dsDNA）变性为单链）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序

31、列有关。因此，电泳结束后，序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带带位置的差异即可反映出位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。产物序列的差异。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术核酸探针杂交法核酸探针杂交法点杂交点杂交反向点杂交反向点杂交微孔板杂交微孔板杂交荧光探针杂交法荧光探针杂交法SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术点杂交（点杂交

32、（dotblot）原原理理：将将扩扩增增产产物物变变性性后后直直接接点点在在尼尼龙龙膜膜或或硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，再再用用放放射射性性或或非非放放射射性性标标记记物物标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸探探针与之杂交。针与之杂交。探针：探针：放放射射性性同同位位素素标标记记探探针针检检测测的的敏敏感感、特特异异，具具有有不不稳稳定定性性和和放射性危害。放射性危害。非非放放射射性性物物质质（如如生生物物素素、地地高高辛辛、荧荧光光素素等等）标标记记的的探探针针稳定性高、使用安全、检测速度快稳定性高、使用安全、检测速度快用途：主要用于用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。产物特异性鉴定及变

33、异分析。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术反向点杂交反向点杂交(reversedotblot)原原理理：使使用用带带有有标标记记物物的的引引物物进进行行PCR扩扩增增，然然后后将将扩扩增增产产物物变变性性。将将不不同同的的寡寡核核酸酸探探针针固固定定在在尼尼龙龙膜膜上上，用用变性的变性的PCR产物与之杂交。产物与之杂交。探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。用用途途：反反向向点点杂杂交交特特别别适适用用于于遗遗传传性性疾疾

34、病病多多个个位位点点的的点点突变分析。突变分析。结果分析：结果分析：正常纯合子正常纯合子突变纯合子突变纯合子杂合子杂合子SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术微孔板杂交微孔板杂交(microplatehybridization)夹夹心心杂杂交交SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术荧光探针杂交法荧光探针杂交法目前临床上常用荧光探针法来检测目前

35、临床上常用荧光探针法来检测PCR产产物，主要的方法有物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、分子信标技术、复合探针法等。技术、复合探针法等。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR产物测序产物测序对对PCR产产物物进进行行测测序序是是检检测测PCR产产物物特特异异性性最最可可靠靠的的方方法法，可可将将PCR产产物物克克隆隆到到载载体体上上进进行行测测序序，也也可可对对直直接接PCR产产物进行测序。物进行测序。SchoolofLaboratoryMedici

36、ne,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术常见问题原因分析及处理常见问题原因分析及处理假阳性假阳性非特异性非特异性PCR产物产物假阴性假阴性引物二聚体引物二聚体SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术假阳性假阳性PCR产物是最主要的污染源。产物是最主要的污染源。含有靶含有靶DNA序列的质粒的污染。序列的质粒的污染。阳性对照的污染。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。标本之间的交叉污染。Taq聚合

37、酶中带有细菌聚合酶中带有细菌DNA，当，当PCR扩增片段为保守的扩增片段为保守的rRNA序列时，易造成假阳性。序列时，易造成假阳性。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术怎么可能全家人都得了性病怎么可能全家人都得了性病?何某，女，何某，女，46岁，某部队卫生所护士，离婚岁，某部队卫生所护士，离婚10年，与一男友交往年，与一男友交往5年。她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚年。她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚性行为，怕万一得性病被人知道，

38、便悄悄到郊区一个小诊所去看性行为，怕万一得性病被人知道，便悄悄到郊区一个小诊所去看病。结果被告知是病。结果被告知是淋病淋病，用了许多药，未见明显好转。她通过，用了许多药，未见明显好转。她通过查书感到查书感到问题严重问题严重”，担心全家都会传染，尤其是正读初中的，担心全家都会传染，尤其是正读初中的女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了。她不仅带自己女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了。她不仅带自己的女儿、的女儿、70岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、妹夫及妹夫及14岁的外甥女都到医院检查。医师给他们用最先进的岁的外甥女都到医

39、院检查。医师给他们用最先进的PCR”检测，结果检测，结果6个人都是个人都是淋球菌感染淋球菌感染”！SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术非特异性非特异性PCR产物产物引引物物特特异异性性不不高高，引引物物用用量量过过多多，应应调调换换引引物物或或降降低低引引物物用量。用量。TaqDNA聚聚合合酶酶质质量量不不好好或或用用量量偏偏高高，应应降降低低酶酶量量或或使使用用质量较好的酶。质量较好的酶。Mg2+浓度过高，可适当调节浓度过高，可适当调节Mg2+浓度。浓度。退退火火

40、温温度度过过低低，退退火火及及延延伸伸时时间间偏偏长长，可可提提高高退退火火温温度度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增。进行扩增。热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术假阴性假阴性引物设计是否合理引物设计是否合理标本中是否有标本中是否有Taq酶抑制剂，酶抑制剂，Taq酶是否失活。酶是否失活。反反应应体体系系中中有有无无蛋蛋

41、白白酶酶或或核核酸酸酶酶降降解解DNA聚聚合合酶酶或或模模板板DNA，可在可在95以上加热以上加热10分钟使其灭活。分钟使其灭活。反反应应体体系系中中是是否否有有较较难难去去除除的的蛋蛋白白质质抑抑制制PCR系系统统，用用蛋蛋白白酶酶K重新处理常可获预期结果。重新处理常可获预期结果。循循环环温温度度，特特别别是是解解链链温温度度是是否否准准确确，退退火火温温度度是是否否过过高高。有有些些PCR仪仪指指示示温温度度与与实实际际温温度度不不符符，过过高高则则酶酶在在前前几几个个循循环环中中迅迅速速失活，过低则模板变性不彻底失活，过低则模板变性不彻底检测检测PCR产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳

42、法敏感性较低。产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低。靶序列发生突变、缺失等靶序列发生突变、缺失等SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物二聚体引物二聚体v两两个个相相同同的的或或不不同同的的引引物物分分子子之之间间有有较较多多的的碱碱基基配配对对，特别是引物特别是引物3端有互补区。端有互补区。v引物模板比例太高，可增加模板用量。引物模板比例太高，可增加模板用量。v退火温度过低。退火温度过低。v热循环次数过多。热循环次数过多。SchoolofLaborat

43、oryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR污染及预防措施污染及预防措施分开操作区域。分开操作区域。耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌。耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌。使用一次性使用一次性Tip头、头、Eppendorf管等。管等。小量分装试剂。小量分装试剂。样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染。样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染。操作者带手套操作，且应勤换手套。操作者带手套操作，且应勤换手套。使用尿嘧啶使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制糖基化酶控制PCR产物交叉污染。产物

44、交叉污染。每次每次PCR操作都应设阳性及阴性对照操作都应设阳性及阴性对照。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术RNA酶的污染与预防酶的污染与预防去除外源去除外源RNase污染污染玻璃器皿常规洗净后，应用玻璃器皿常规洗净后，应用0.1%DEPC处理。处理。所有溶液应加所有溶液应加DEPC至至0.05%0.1%，室温处理过夜，室温处理过夜，然后高压处理。然后高压处理。操作者戴口罩和手套。操作者戴口罩和手套。材料器材使用灭菌一次性用品。材料器材使用灭菌一次性用品。抑制内源

45、性抑制内源性RNase的活性的活性使用低特异性使用低特异性RNase抑制物：如皂土、复抑制物：如皂土、复合硅酸盐、肝素、合硅酸盐、肝素、DEPC等。等。去除蛋白质物质：蛋白质变性剂、蛋白去除蛋白质物质：蛋白质变性剂、蛋白酶酶K、阴离子去污剂等，常与、阴离子去污剂等，常与RNA酶抑酶抑制物联合使用，以加强对制物联合使用，以加强对RNase活力的抑活力的抑制。制。RNase的特异性抑制剂：如的特异性抑制剂：如RNase阻抑蛋阻抑蛋白（白（RNasin）、氧钒核糖核苷复合物。）、氧钒核糖核苷复合物。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生

46、物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR衍生技术衍生技术巢式巢式PCR（nestedPCR）逆转录逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重多重PCR(multiplexPCR)重组重组PCR(recombinantPCR)锚定锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不对称不对称PCR（asymmetricPCR）反向反向PCR（inversePCR）扩增长片段扩增长片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫免疫PCR(immuno-PCR)定量定量PCRSchoolofLaboratoryM

47、edicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术巢式巢式PCR（nestedPCR）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术逆转录逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）逆转录酶逆转录酶AMV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为42）MoMLV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为37）逆转录引物逆转录引物随机引物；随机引物；Oligo(dT)；特

48、异性引物。特异性引物。one-stepRT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、引物、TaqDNA聚合酶、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和缓冲液，直和缓冲液，直接以接以mRNA为模板进行逆转录和为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法扩增，称为一步法RT-PCR。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术多重多重PCR(multiplexPCR)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedica

49、lCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术重组重组PCR(recombinantPCR)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术锚定锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）基本原理：抽提细胞总基本原理：抽提细胞总RNA或或mRNA，在逆转录酶，在逆转录酶作用下合成作用下合成cDNA，通过，通过DNA末端转移酶在末端转移酶在cDNA3端加上端加上poly(dG)尾。据此设计锚定引物尾。据此设计锚定引物poly(dC)，为

50、，为提高扩增特异性，提高扩增特异性，poly(dC)在十二聚以上，锚定引物在十二聚以上，锚定引物5端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信息。根据已知的息。根据已知的3端序列设计基因特异性引物，与锚端序列设计基因特异性引物，与锚定引物一起进行定引物一起进行PCR扩增。扩增。用途：检测用途：检测T细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术不对称不对称PCR（a