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1、 Human genome project 人类基因组计划人类基因组计划河南师范大学生命科学学院河南师范大学生命科学学院 卢龙斗卢龙斗 第六章第六章(3)一、一、何谓人类基因组计划何谓人类基因组计划 1 1、人类基因组计划：、人类基因组计划：（Human Genome Human Genome ProjetProjet)简简 称：称：HGPHGP。测定人类基因组核苷酸的排。测定人类基因组核苷酸的排 列顺序、基因排列顺序、揭示基因的功列顺序、基因排列顺序、揭示基因的功 能以及基因间的相互关系，从而解码能以及基因间的相互关系，从而解码 生命的计划。生命的计划。2 2、基因：、基因：(Gene)DN

2、A(Gene)DNA上具有一定的遗传效应的核上具有一定的遗传效应的核 苷酸序列苷酸序列 3 3、基因组：、基因组：(Genome)(Genome)又叫染色体组，指又叫染色体组，指 一个生物一个生物 物种配子中的物种配子中的 一套染色体或全部基因。一套染色体或全部基因。19201920年，德国遗传学家温克勒把年，德国遗传学家温克勒把GeneGene和和 ChromosomeChromosome缩合缩合 创创 造了基因组这个词。造了基因组这个词。在人类指包括在人类指包括X X、Y Y在内的在内的2424条染色体条染色体 4 4、基因组学：、基因组学：（genomicsgenomics）从整个基因组

3、的视角来）从整个基因组的视角来 研究遗传学的科学。研究基因组及其基因研究遗传学的科学。研究基因组及其基因 的科学的科学 5 5、结构基因组学：、结构基因组学：（Structural genomicsStructural genomics）研究基）研究基 因组的物理特点的科学因组的物理特点的科学 6 6、功能基因组学：、功能基因组学：（Functional genomicsFunctional genomics）研究基）研究基 因组中基因的产物和表达模式的科学（后因组中基因的产物和表达模式的科学（后 基因组计划）基因组计划）7 7、基因组文库：、基因组文库：（genomic librarygen

4、omic library）整个生物体基）整个生物体基 因组随机产生的重叠因组随机产生的重叠DNADNA片段的克隆的总和片段的克隆的总和 8 8、基因库：、基因库：gene bank gene bank 某一生物群体中全部个体某一生物群体中全部个体 所共有的全部基因所共有的全部基因 9 9、蛋白质组：、蛋白质组：proteome proteome 在某种细胞或组织中整个在某种细胞或组织中整个 基因组所产生的各种蛋白质的组合。由基基因组所产生的各种蛋白质的组合。由基 因组编码的全部蛋白质总合因组编码的全部蛋白质总合 1010、蛋白质组学：、蛋白质组学：proteomics proteomics 研

5、究一个基因组中基研究一个基因组中基 因编码的所有蛋白质的结构、功能以及相因编码的所有蛋白质的结构、功能以及相 互作用模式的科学互作用模式的科学 1111、转录组；、转录组；transcriptometranscriptome 某一特定组织在某一某一特定组织在某一 特定时间由基因组转录形成的全部特定时间由基因组转录形成的全部RNARNA总合总合 1212、工作草图：、工作草图：人类基因组计划最终目标的中间阶人类基因组计划最终目标的中间阶 段段 1313、完成图、完成图：高水平、高质量、精细的人类基因组：高水平、高质量、精细的人类基因组 框架框架 1414、酵母人工染色体：、酵母人工染色体：(YA

6、C)(YAC)能携带人类基因组能携带人类基因组 10000001000000碱基的、能在酵母菌中复制的碱基的、能在酵母菌中复制的 一种载体一种载体 1515、细菌人工染色体、细菌人工染色体 （BACBAC）能携带人类基因组）能携带人类基因组 300000300000碱基的、能在细菌中复制的一种载体碱基的、能在细菌中复制的一种载体 1616、塞莱拉公司：、塞莱拉公司：（Celera Celera 公司）公司）19981998年年CraigCraig Venter Venter创建的快速测序的专门公司。创建的快速测序的专门公司。Celera Celera 在拉丁语意为快速的、发现了在拉丁语意为快速

7、的、发现了 决不等待。决不等待。与美国国立公司公开竞争。与美国国立公司公开竞争。二、人类基因组计划的由来二、人类基因组计划的由来 1 1、19721972 19821982年，美国庞大肿瘤研究计划最后失败年，美国庞大肿瘤研究计划最后失败 8080年代，由于分子生物学的发展，人们试图彻底年代，由于分子生物学的发展，人们试图彻底 解决生物学问题，提出了遗传工程计划、讯号传解决生物学问题，提出了遗传工程计划、讯号传 导计划、脑的十年计划、蛋白质计划等，都没有导计划、脑的十年计划、蛋白质计划等，都没有 解决根本问题，特别是美国解决根本问题，特别是美国庞大肿瘤研究计划最庞大肿瘤研究计划最 后失败，使人们

8、思考从另外一个角度解决问题后失败，使人们思考从另外一个角度解决问题 2 2、19831983年，美国能源部负责核武器研制的两个国家年，美国能源部负责核武器研制的两个国家 实验室实验室洛斯阿拉莫斯实验室、劳伦斯利佛摩尔洛斯阿拉莫斯实验室、劳伦斯利佛摩尔 实验室，实验室，提出，要研究日本广岛、长崎幸存者基提出，要研究日本广岛、长崎幸存者基 因突变情况，必须把人因突变情况，必须把人3030亿碱基对搞清楚。亿碱基对搞清楚。1984 1984 年年1212月国能源部讨论此方案，月国能源部讨论此方案，19861986年年3 3月决定实施月决定实施 3 3、19861986、3 3、7 7美国著名生物学家杜

9、尔贝（美国著名生物学家杜尔贝（DulbeccoDulbecco)在在科学科学杂志发文杂志发文癌症研究的转折点癌症研究的转折点人类基人类基 因组的全序列分析因组的全序列分析。“现在我们不应再东一棒子现在我们不应再东一棒子 西一榔头按喜好去研究各自感兴趣的基因，这样只西一榔头按喜好去研究各自感兴趣的基因，这样只 会事倍功半，我们应集中力量去解读整个人类基因会事倍功半，我们应集中力量去解读整个人类基因 序列，描绘出人类自己的设计图，这才是正道序列，描绘出人类自己的设计图，这才是正道”。“这一计划的意义，可以与征服宇宙的计划相媲美这一计划的意义，可以与征服宇宙的计划相媲美 我们应该以征服宇宙的气魄来进

10、行这一计划。我们应该以征服宇宙的气魄来进行这一计划。”“这样的工作任何一个实验室都难以承担，它应该这样的工作任何一个实验室都难以承担，它应该 成为国际性的项目，人类的成为国际性的项目，人类的DNADNA序列是人类的真序列是人类的真 谛，这个世界上发生的一切事情，都与这一序列息谛，这个世界上发生的一切事情，都与这一序列息 息相关息相关 4 4、19871987年年3 3月美国能源部、国家健康研究院拨款月美国能源部、国家健康研究院拨款550550 万美金筹建人类基因组计划实验室。能源部健康万美金筹建人类基因组计划实验室。能源部健康 和环境研究室主任和环境研究室主任CharlisCharlis De

11、lisiDelisi在计划启动上在计划启动上 作了关键作用，因此，他被称为作了关键作用，因此，他被称为人类基因组计划人类基因组计划 之父之父 5 5、19881988年年1212月美国国家科学研究委员会组织撰写月美国国家科学研究委员会组织撰写 （人类基因组做图测序）报告全面介绍人类基因（人类基因组做图测序）报告全面介绍人类基因 组计划成立组计划成立“国家人类基因组研究中心国家人类基因组研究中心”由由华生华生担担 任第一任中心主任任第一任中心主任 6 6、19901990年美国国会正式批准人类基因组计划，年美国国会正式批准人类基因组计划，1010月月 1 1号人类基因组计划正式启动，计划在号人类

12、基因组计划正式启动，计划在1515年内，年内，投资投资3030亿美金，破解人类生命密码的天书。亿美金，破解人类生命密码的天书。在在DulbeccoDulbecco论文的影响下，整个西欧都动了起来论文的影响下，整个西欧都动了起来 7 7、19871987年意大利组织年意大利组织3030个实验室开始个实验室开始 HGPHGP 8 8、19891989年英国成立年英国成立“英国人类基因组资源中心英国人类基因组资源中心 9 9、19901990年法国宣布开始人类基因组计划，法国民众年法国宣布开始人类基因组计划，法国民众 踊跃捐款踊跃捐款50005000万美金万美金 1010、19901990年日本启动

13、人类基因组计划年日本启动人类基因组计划 1111、19951995年德国启动人类基因组计划。先后又有澳大年德国启动人类基因组计划。先后又有澳大 利亚、丹麦、荷兰、俄罗斯、西班牙、瑞典、斯利亚、丹麦、荷兰、俄罗斯、西班牙、瑞典、斯 里兰卡共有里兰卡共有1515个国家参与个国家参与 1212、19981998年美国克来格年美国克来格 文特尔博士（文特尔博士（Craig Venter)Craig Venter)创立塞莱拉基因公司创立塞莱拉基因公司(Celera)(Celera)，展开竞争，展开竞争 1313、19991999年年9 9月中国正式加入国际基因组测序俱乐部月中国正式加入国际基因组测序俱乐

14、部 19881988年中国已有年中国已有4040多名科学家加入俱乐部多名科学家加入俱乐部 19931993年中国国家自然科学基金已经资助年中国国家自然科学基金已经资助 杨焕明杨焕明19881988年在丹麦获博士学位，后在法国、美年在丹麦获博士学位，后在法国、美 国作博士后，国作博士后，19941994年回国，任人类基因组计划中年回国，任人类基因组计划中 国项目执行人。又有于军、刘斯奇、王建等把技国项目执行人。又有于军、刘斯奇、王建等把技 术带回国内，又呼吁、又推波助澜术带回国内，又呼吁、又推波助澜 浙江温州乐清市市长陆光中资助浙江温州乐清市市长陆光中资助800800万元万元 北京顺义区免费提供

15、实验基地北京顺义区免费提供实验基地 人基因组测序战略第五次会议杨焕明人基因组测序战略第五次会议杨焕明5 5分钟发言分钟发言 19981998年中科院院士陈竺在上海挂帅成立中国南方年中科院院士陈竺在上海挂帅成立中国南方 基因组中心基因组中心 19981998年杨焕明、余军在中科院成立中国科学院遗年杨焕明、余军在中科院成立中国科学院遗 传研究所，专门从事人类基因组研究传研究所，专门从事人类基因组研究 19991999年中科院院士强佰勤挂帅成立中国北方基因年中科院院士强佰勤挂帅成立中国北方基因 组中心主任组中心主任 19991999年陈竺院士成为国际基因组委员会委员年陈竺院士成为国际基因组委员会委员

16、 三、人类基因组计划的任务和内涵三、人类基因组计划的任务和内涵 1 1、人类基因组计划的任务、人类基因组计划的任务 1 1）人类基因组的基因图构建与序列分析（遗传）人类基因组的基因图构建与序列分析（遗传 图谱、图谱、物理图谱、序列图谱、基因图谱）物理图谱、序列图谱、基因图谱）2 2）人类基因的鉴定）人类基因的鉴定 3 3）基因组研究技术的建立）基因组研究技术的建立 4 4）人类基因组研究的模式生物（细菌、酵母）人类基因组研究的模式生物（细菌、酵母 菌、线虫、果蝇、小鼠、拟南介）的基因组菌、线虫、果蝇、小鼠、拟南介）的基因组 5 5）信息系统的建立）信息系统的建立 6 6）有关的伦理、法律和社会

17、问题研究）有关的伦理、法律和社会问题研究 2 2、后人类基因组计划、后人类基因组计划 1 1）绘制基因组遗传整合图（单体型图）绘制基因组遗传整合图（单体型图）寻找不同人群之间、不同人之间的差异，建立寻找不同人群之间、不同人之间的差异，建立 “个人医学个人医学”美国美国31%31%、英国、英国24%24%、本、本25%25%、加拿、加拿 大大10%10%、中国、中国10%10%。（。（3 3、8 8、2121染色体）。单核染色体）。单核 苷酸多态性研究（苷酸多态性研究（SNP)SNP)2 2）功能基因组学）功能基因组学 是人类基因组计划的核心和焦点，主要是对基是人类基因组计划的核心和焦点，主要是

18、对基 因组进行功能研究，对非编码区进行基因调控因组进行功能研究，对非编码区进行基因调控 功能的研究功能的研究 3 3）比较基因组学）比较基因组学 揭示生命起源，解决生物进化的重大问题。比揭示生命起源，解决生物进化的重大问题。比 较人类与细菌的基因组，筛选出仅在细菌中存较人类与细菌的基因组，筛选出仅在细菌中存 在的基因，成为新的抗菌素药靶在的基因，成为新的抗菌素药靶 4 4）蛋白质组学）蛋白质组学 在蛋白质水平研究基因的功能，翻译后的修饰机在蛋白质水平研究基因的功能，翻译后的修饰机 理蛋白质的生化功能、蛋白质之间的相互作用、理蛋白质的生化功能、蛋白质之间的相互作用、借助计算机技术，模拟出未知蛋白

19、基因的蛋白质借助计算机技术，模拟出未知蛋白基因的蛋白质 产物的立体结构，预测蛋白质的功能产物的立体结构，预测蛋白质的功能 5 5）医学基因组学）医学基因组学 6 6）环境基因组学：）环境基因组学：肌体在恶劣环境下敏感性基因和抗性基因的活动肌体在恶劣环境下敏感性基因和抗性基因的活动 规律规律 7 7）药物基因组学：）药物基因组学：研究不同个体不同的基因多态性对药物的反应，研究不同个体不同的基因多态性对药物的反应，指导科学用药指导科学用药 8 8）病理基因组学：）病理基因组学：不同个体发病情况和基因活动情况不同个体发病情况和基因活动情况 9 9）生殖基因组学：）生殖基因组学：受精、个体发育中基因活

20、动情况受精、个体发育中基因活动情况 1010）群体基因组学：）群体基因组学：1111）生物信息学：）生物信息学：由于人类基因组计划的实施使生命科学与信息由于人类基因组计划的实施使生命科学与信息 科学相结合而产生的交叉学科。科学相结合而产生的交叉学科。通过对生物学通过对生物学 实验数据的获取、加工、存储、检索和分析，实验数据的获取、加工、存储、检索和分析，揭示数据所蕴藏的的生物学意义。揭示数据所蕴藏的的生物学意义。四、人类基因组计划的核心内容四、人类基因组计划的核心内容 1 1、遗传图谱、遗传图谱 （连锁图谱）（连锁图谱）1 1）概念：人类基因组内基因以及专一的多态性）概念：人类基因组内基因以及

21、专一的多态性DNADNA 标记相对位置的图。以某个遗传位点上具有标记相对位置的图。以某个遗传位点上具有 多个等位基因的遗传标记做多个等位基因的遗传标记做“路标路标”，以两个，以两个 位点之间进行交换、重组的百分率位点之间进行交换、重组的百分率 cMcM作为作为 图距反映基因遗传效应的基因组图。基因组图距反映基因遗传效应的基因组图。基因组 计划启动时人类学研究已将计划启动时人类学研究已将1.61.6万个基因确定万个基因确定 了相对位置了相对位置 2 2）图距单位：）图距单位：cMcM，相对距离相对距离 3 3）图谱意义：育种的字典、基因组测序的路标）图谱意义：育种的字典、基因组测序的路标 4 4

22、）图谱的遗传标记：遗传标记指可以识别的等位基）图谱的遗传标记：遗传标记指可以识别的等位基 因或一些等位性的片段。随着分子遗因或一些等位性的片段。随着分子遗 传学的发展和基因概念的发展遗传标传学的发展和基因概念的发展遗传标 记也在不断从形态、细胞水平发展到记也在不断从形态、细胞水平发展到 生化和分子水平生化和分子水平 原始遗传标记：为性状标记，人类的双眼皮、单原始遗传标记：为性状标记，人类的双眼皮、单 眼皮，男性、女性，色盲、正常，血眼皮，男性、女性，色盲、正常，血 友病、正常，多指、五指等。由于人友病、正常，多指、五指等。由于人 类已经了解的性状非常少、（人类大类已经了解的性状非常少、（人类大

23、 约了解的性状有几百个）这些性状的约了解的性状有几百个）这些性状的 多态性又少，而且每一个性状都是由许多基多态性又少，而且每一个性状都是由许多基 因控制的，因此，性状作为遗传标记来进行因控制的，因此，性状作为遗传标记来进行 人类的基因组计划显然是不行的人类的基因组计划显然是不行的 第一代遗传标记：为蛋白质、同工酶或免疫学的标第一代遗传标记：为蛋白质、同工酶或免疫学的标 记，如记，如A,B,OA,B,O血型位点、血型位点、HLAHLA位点、位点、MNMN血型位血型位 点、点、RhRh血型位点等。但是，已知道多态的蛋血型位点等。但是，已知道多态的蛋 白质很少，等位基因的数目少，在白质很少，等位基因

24、的数目少，在2 2米长的米长的 “路上路上”路标太少，不易找到人们要找的目路标太少，不易找到人们要找的目标标 第二代遗传标记：第二代遗传标记：限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性：RFLPRFLP遍布在人类基因组遍布在人类基因组 中，可达中，可达10105 5以上。工作原理是用限制性内切酶以上。工作原理是用限制性内切酶 特异性切割特异性切割DNADNA链，链，DNADNA上一个点的变异造成上一个点的变异造成“能能 切切”，“不能切不能切”，因而产生不同长度的等位片，因而产生不同长度的等位片段段 在凝胶电泳上显示，从片段多态性的信息与疾病在凝胶电泳上显示，从片段多态性的信息与疾病 表型间的关

25、系进行连锁分析，找到致病基因。表型间的关系进行连锁分析，找到致病基因。RFLPRFLP 标记的优点：标记的优点：无表型效应，检测不受环境和发育阶段影响无表型效应，检测不受环境和发育阶段影响 共显性杂交组合时不受杂交方式影响共显性杂交组合时不受杂交方式影响 互相之间不存在上位效应，忽不干扰互相之间不存在上位效应，忽不干扰 源于基因组自身的变异，在数量上几乎不受限源于基因组自身的变异，在数量上几乎不受限 制因此，制因此，19871987年，建立了人类第一张年，建立了人类第一张RFLPRFLP图图 谱，有谱，有393393个个RFLPRFLP 标记，标记，1010多个其他标记，密度多个其他标记，密度

26、10Mb10Mb RFLP RFLP 标记的缺点：标记的缺点：一种酶切割一个位点时只能产生一种酶切割一个位点时只能产生2323个多态性个多态性 片段，因此，提供的信息量有限片段，因此，提供的信息量有限 真核生物基因组大，酶切后产生数百万片段，真核生物基因组大，酶切后产生数百万片段，不易分析不易分析 需要放射性同位素标记需要放射性同位素标记DNADNA探针来检测探针来检测RFLP RFLP，存在安全性和费用问题存在安全性和费用问题 小卫星标记小卫星标记：VNTR 1985VNTR 1985年年 微卫星标记微卫星标记：STR 1989STR 1989年发现。年发现。又称简单重复又称简单重复 序列（

27、序列（simple sequence repeat simple sequence repeat SSR)1996 SSR)1996年已经建立了年已经建立了60006000多个此种多个此种 标记，标记之间距离为标记，标记之间距离为0.7cM0.7cM 第三代遗传标记：第三代遗传标记：单核苷酸多态性单核苷酸多态性:(:(single nucleotide single nucleotide polymorphysmpolymorphysm)SNP.1996)SNP.1996年发现，大多数基因位年发现，大多数基因位 点上都有若干个等位型，每一个核苷酸在任何一点上都有若干个等位型，每一个核苷酸在任何

28、一 代人群中大约每代人群中大约每1101109 9 个个体就会发生一次变异个个体就会发生一次变异简单序列长简单序列长度多态性度多态性SSLP 人类基因组中有此标记人类基因组中有此标记300300万个，平均每万个，平均每10001000个个 碱基就会有一个。在基因组中数目多、覆盖面碱基就会有一个。在基因组中数目多、覆盖面 大，可以用基因芯片操作，所以，具有优越性和大，可以用基因芯片操作，所以，具有优越性和 潜力潜力 5 5）图谱缺陷）图谱缺陷 标记密度小：真核生物尤其人类可利用的交配组标记密度小：真核生物尤其人类可利用的交配组 合、连锁后代少，可利用的研究个合、连锁后代少，可利用的研究个 体不容

29、易获得，因此，已经有的遗体不容易获得，因此，已经有的遗 传标记较少，在计划开始时，人类传标记较少，在计划开始时，人类 遗传图谱才几百个，而计划需要至遗传图谱才几百个，而计划需要至 少少3 3万个标记万个标记 分辨率低：平均分辨率低：平均600kb600kb才有一个标记，既分辨率才有一个标记，既分辨率 仅仅600kb600kb，而人类基因组计划测序，而人类基因组计划测序 需要需要100kb100kb的分辨率一个标记的密度的分辨率一个标记的密度 精确性不高：相对位置、相对距离、由于交换不是精确性不高：相对位置、相对距离、由于交换不是 当年摩尔根描述的那样，因此，已经当年摩尔根描述的那样，因此，已经

30、 得到的数据不准确，不能用于基因组得到的数据不准确，不能用于基因组 测序测序 2 2、物理图谱、物理图谱 （生命周期表）（生命周期表）1 1）概念：限制性酶切位点、序列标签位点等在）概念：限制性酶切位点、序列标签位点等在 基因组的位置和距离的图基因组的位置和距离的图 利用分子生物学技术直接确定一些利用分子生物学技术直接确定一些DNA DNA 序列的位置的图序列的位置的图 2 2）图距单位：）图距单位：bpbp kbpkbp Mb Mb 3 3）图谱意义：是生命的元素周期表，与遗传图谱）图谱意义：是生命的元素周期表，与遗传图谱 结合进行精细基因定位，是基因组测结合进行精细基因定位，是基因组测 序

31、的必经步骤序的必经步骤 4 4）图谱的标记：）图谱的标记：限制性酶切位点：例如限制性酶切位点：例如AluAlu 识别序列为识别序列为AGCT,AGCT,则则 平均每平均每256256对核苷酸就有一个切点对核苷酸就有一个切点 EcoREcoR识别序列为识别序列为GAATTCGAATTC则平均每则平均每 40964096对核苷酸就有一个切点对核苷酸就有一个切点.不能用不能用 于大的基因组于大的基因组 序列标记位点：（序列标记位点：（sequence tagged sequence tagged site,STSsite,STS)一一 段长段长100500bp100500bp、易于识别的、仅存、易于

32、识别的、仅存 在于待研究的基因组中的在于待研究的基因组中的DNADNA序列序列.一一 个个STSSTS必须是序列已知、在染色体上必须是序列已知、在染色体上 有唯一位置有唯一位置 一个一个1000bp1000bp的的DNADNA分子分子,用酶用酶A A、酶、酶B B、酶、酶C C切割，得到切割，得到 如下片段（厦门大学考研试题）如下片段（厦门大学考研试题）酶酶A A切割、切割、1000bp1000bp 酶酶B B切割、切割、100bp100bp、300bp300bp、600bp600bp 酶酶C C 切割、切割、200bp200bp、800bp800bp 酶酶A A B B切割、切割、50bp5

33、0bp、100bp100bp、300bp300bp、550bp550bp 酶酶B BC C切割、切割、75bp75bp、100bp100bp、125bp125bp、225bp225bp、475bp475bp 酶酶A A C C切割、切割、200bp200bp、375bp375bp、425bp425bp 确定此三种限制性内切酶在此确定此三种限制性内切酶在此DNADNA分子上的位置分子上的位置 1、根据酶、根据酶A切得到一个切得到一个 2、根据酶、根据酶B切得到三个片切得到三个片 1000bp的片段的片段BC,说明说明 段，段，100bp、300bp、该该DNA分子为环状，分子为环状，600bp，

34、说明酶说明酶B在此环在此环 酶酶A在其上有一个切点在其上有一个切点 状状DNA分子上有三个切点分子上有三个切点 A B BB600 100300 3、根据酶、根据酶C切得到切得到200、800二二 片段，说明酶片段，说明酶C在此环状在此环状 DNA上有上有2个切点个切点4、根据、根据AB双酶解时得到双酶解时得到50、100、300、550四个段，四个段，与与A、B单酶解时比较，与酶单酶解时比较，与酶B单切时比较是多了一个单切时比较是多了一个 50，但出现了一个，但出现了一个550，正好是酶，正好是酶B切的切的600的分割的分割C C 200800 A BBB55050 100300BBBA55

35、0503001005、根据酶、根据酶BC得到得到75 6、根据、根据A+C酶切得到酶切得到 200 100、125、225、475五五 375、425、单独、单独C切切 得得 到到 200、800。375、425刚刚 个片段，个片段，75+225=300，好好 是是800的分割，的分割，所以，所以，A是是 300得分割、得分割、475+125 酶切点在酶切点在800上上 =600，是，是600的分割的分割 BBBCCBCCB BA4751257522510050100 22575125475 A BB B CC首先确定切点多的酶的切首先确定切点多的酶的切点点,最后确定切点少的酶的最后确定切点少

36、的酶的切点切点确定确定B的三个位点的三个位点,再确定再确定C的两个位点的两个位点,最后确定最后确定A的一个位点（的一个位点（A若在下面则酶若在下面则酶A、酶、酶C共切时切不出共切时切不出200bp片片段段）酶酶A切割、切割、1000bp 1步、酶步、酶B切割、切割、100bp、300bp、600bp 酶酶C 切割、切割、200bp、800bp 酶酶A B切割、切割、50bp、100bp、300bp、550bp 2步、酶步、酶BC切割、切割、75bp、100bp、125bp、225bp、475bp 3步、酶步、酶A C切割、切割、200bp、375bp、425bp 表达序列标签：表达序列标签：(

37、expressed sequence(expressed sequence tag,ESTtag,EST)通通 过互补过互补DNADNA克隆分析获得的短序列。克隆分析获得的短序列。是是cDNAcDNA的的3 3端或端或5 5端的序列。端的序列。300500bp300500bp.每一个每一个ESTEST代表一个表达基因的部分片段。代表一个表达基因的部分片段。是基因的转录非翻译区。是序列标记位点是基因的转录非翻译区。是序列标记位点 的源泉，通过它可以寻找基因的源泉，通过它可以寻找基因 5 5）取得的成绩：）取得的成绩：19951995年以年以STSSTS为物理标记，约为物理标记，约16000160

38、00 个个STSSTS位点已经定位，把基因组分成位点已经定位，把基因组分成 了了1600016000个小区。平均间距：个小区。平均间距：200kb200kb。以后达到了以后达到了2010420104个个STSSTS位点，基本位点，基本 达到了达到了100kb100kb一个标记的密度。物理一个标记的密度。物理 图谱图谱=里程碑里程碑=生命周期表生命周期表 6 6）物理图谱与遗传图谱的关系）物理图谱与遗传图谱的关系 项目项目 遗传图谱遗传图谱 物理图谱物理图谱 标标 记记 基因基因 多态性序列多态性序列 STSSTS 单单 位位 cMcM bpbp kb Mb kb Mb 信信 息息 生物信息生物

39、信息 物理信息物理信息 标标 志志 路标路标 界标界标 距距 离离 相对距离相对距离 绝对距离绝对距离 位位 置置 连锁关系连锁关系 相对位置相对位置 位置关系位置关系 绝对位置绝对位置 分辨率分辨率 低低 ,600kb ,600kb 高，高，100kb100kb 精确性精确性 低低 高高 操操 作作 难度大难度大 容易容易 3 3、序列图谱（人类基因组计划的核心）、序列图谱（人类基因组计划的核心）1 1）概念：人类基因组）概念：人类基因组3030亿对核苷酸的排列顺序的图亿对核苷酸的排列顺序的图 2 2）测序流程：）测序流程：选择物种选择物种 分离分离DNA DNA 获得大量获得大量DNA D

40、NA 切割成重叠片段切割成重叠片段 片段插入载体片段插入载体 组装组装 测序测序 大量克隆大量克隆 3 3）测序方法）测序方法0 0年前，一台仪器每天只能测年前，一台仪器每天只能测00bp00bp，人类基，人类基因组测完需要因组测完需要80008000年，因此，有人激烈反对年，因此，有人激烈反对此计划，此计划，985985年发明的第一台测序仪仪每天测年发明的第一台测序仪仪每天测15000bp15000bp，以后有加速到以后有加速到00000 00000 bpbp 19981998年发明年发明ABI3700DNAABI3700DNA分析仪、分析仪、MegaBACE1000DNAMegaBACE1

41、000DNA 测序仪每分钟既可测测序仪每分钟既可测12000bp12000bp，不到个月就测，不到个月就测 完了人类基因组的完了人类基因组的0 0 北京中心每天可测千万北京中心每天可测千万bpbp，是世界上第六大测序，是世界上第六大测序 中心费用也从开始的每碱基中心费用也从开始的每碱基1010美元降到了美元降到了1010美分美分链终止法链终止法(977,Sanger)977,Sanger)原理原理1:1:聚丙烯酰胺凝胶电泳可以把长度只差一个核苷聚丙烯酰胺凝胶电泳可以把长度只差一个核苷 酸的单链酸的单链DNADNA分子区分开分子区分开 原理原理2 2：复制时复制时ddNTPddNTP一旦结合上去

42、，就使其它核苷酸一旦结合上去，就使其它核苷酸 不能再往上结合，不能再往上结合，(ddNTP缺少可连接下一个核苷缺少可连接下一个核苷 酸的酸的3羟基）羟基）形成长短不一的单链形成长短不一的单链DNADNA分子分子 每个反应器中有每个反应器中有 3 5 单链单链DNA 5 3 引物引物DNA Klenow酶仅具酶仅具3 5 外切活性外切活性 dNTP 其中其中dATP是是32P标记的标记的 ddATP 是双脱氧的是双脱氧的dNTP dNTP dNTP dNTPddATP ddTTP ddCTP ddGTP反应器反应器反应器反应器反应器反应器反应器反应器 ddATP ddATP ddATP ddAT

43、P 各反应器中的各反应器中的dNTP都用都用32P标记，利于电泳后观察标记，利于电泳后观察 1 2 3 4 A T C G 1 2 3 4 A T C G 5 TGATACGACGAAGTACTGG 3 3 ACTATGCTGCT TCATGACC 5 链终止法测序中的链终止法测序中的DNADNA聚合酶的要求：聚合酶的要求：高延伸性：能保证在渗入链终止核苷酸之前合成高延伸性：能保证在渗入链终止核苷酸之前合成 的链片断不与模版链解离的链片断不与模版链解离 不具备或很弱的不具备或很弱的5353外切活性：外切活性：保证新合成的链不被酶切掉保证新合成的链不被酶切掉 不具备或很弱的不具备或很弱的3535

44、外切活性：外切活性：保证新合成的链不被酶切掉保证新合成的链不被酶切掉 KlenowKlenow酶：酶：大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶被枯草芽孢杆菌素裂解被枯草芽孢杆菌素裂解 后产生的一个大片断。具有聚合活性和后产生的一个大片断。具有聚合活性和33 5 5外切活性。但聚合活性较低。外切活性。但聚合活性较低。测序酶：测序酶：T T7 7噬菌体编码的一种修饰过的噬菌体编码的一种修饰过的DNADNA聚合酶。聚合酶。延伸性高、无外切活性、反应速度快可用延伸性高、无外切活性、反应速度快可用 多种修饰过的核苷酸作引物。多种修饰过的核苷酸作引物。热循环测序法：热循环测序法：（19921992）用双链用双链DNA

45、DNA，用量少，不必大量克隆，用量少，不必大量克隆 用热稳定聚合酶用热稳定聚合酶TaqTaq酶，酶，单条引物，类似单条引物，类似PCRPCR反应反应 荧光标记引物法：荧光标记引物法：不同的荧光标记加在不同的核苷不同的荧光标记加在不同的核苷 酸上，在酸上，在同一个反应器中同一个反应器中同时加入同时加入4 4种荧光标种荧光标 记的双脱氧核苷酸，电泳时记的双脱氧核苷酸，电泳时加入同一个泳道加入同一个泳道 中，电泳条带通过检测仪时，可以直接读出核中，电泳条带通过检测仪时，可以直接读出核 苷酸，电脑把核苷酸序列打印在表格上。每次苷酸，电脑把核苷酸序列打印在表格上。每次 一个样品。一个样品。毛细管电泳法：

46、毛细管电泳法：新的测序仪改为毛细管电泳，有新的测序仪改为毛细管电泳，有9696个孔道，一个孔道，一 次能测次能测9696个，每次个，每次2 2小时。小时。焦磷酸测序法：焦磷酸测序法：不用合成、分离不同长度的片断，不用电泳，不用合成、分离不同长度的片断，不用电泳，不需要加入不需要加入ddNTPddNTP。直接进行模版链复制，边。直接进行模版链复制，边 复制边测序。每种核苷酸用不同荧光色标记，复制边测序。每种核苷酸用不同荧光色标记，每次加入一种核苷酸，反应结束后，剩余的核每次加入一种核苷酸，反应结束后，剩余的核 苷酸会被分解掉，接着加入另一种核苷酸。结苷酸会被分解掉，接着加入另一种核苷酸。结 合上

47、去一个核苷酸，计算机就读出一个序列。合上去一个核苷酸，计算机就读出一个序列。如何加快测序速度和进行计算机阅读如何加快测序速度和进行计算机阅读 每一种双脱氧的核苷酸可以被标记上不同的荧光染每一种双脱氧的核苷酸可以被标记上不同的荧光染 料料,如如T T被标上红色、被标上红色、G G被标记上兰色被标记上兰色、A A被标记上被标记上 绿色绿色、C C 被标被标记上黄色记上黄色。把凝胶放在特殊的仪器上把凝胶放在特殊的仪器上 当片段在凝胶上移动时，他们会在某一点穿过一个当片段在凝胶上移动时，他们会在某一点穿过一个 激光束，标记在各种核苷酸的染料就会被激发而发激光束，标记在各种核苷酸的染料就会被激发而发 出

48、不同的荧光，此种荧光信号被探测器捕捉而在计出不同的荧光，此种荧光信号被探测器捕捉而在计 算机显示器上显示为相应色带，由计算机直接读出算机显示器上显示为相应色带，由计算机直接读出 核苷酸的顺序核苷酸的顺序）取得的成绩：）取得的成绩：框架图框架图 精细图精细图 完成图完成图 覆盖人覆盖人 类基因组的类基因组的99.9%99.9%基因组核苷酸数目：基因组核苷酸数目：31.64731.647亿亿bpbp，一个个核苷酸，一个个核苷酸 排列起来可达到排列起来可达到50005000公里长，公里长，500500 页的书页的书30003000本才能写完本才能写完 基因数目：基因数目：3.03.53.03.5万个

49、，比果蝇、线虫多万个，比果蝇、线虫多2 2万万 个，为水稻的二分之一，个，为水稻的二分之一，61%61%与果蝇与果蝇 同源同源.43%.43%与线虫同源与线虫同源 .46%.46%与酵母同与酵母同 源，源，1717号染色体上全部基因都可在小号染色体上全部基因都可在小 鼠鼠 1111号染色体上找到号染色体上找到 热点和荒漠：热点和荒漠：1717、1919、2222号染色体基因集中。号染色体基因集中。X X Y 4Y 4、8 8号染色体基因贫瘠，基因组号染色体基因贫瘠，基因组1/41/4区区 无基因存在无基因存在 编码序列：仅占基因组的编码序列：仅占基因组的5%5%基因组重复序列：基因组的基因组重

50、复序列：基因组的36%36%包含重复序列，包含重复序列，1919 号染色体号染色体57%57%区为重复序列，重复序列占区为重复序列，重复序列占 整个基因组的整个基因组的50%50%以上。插入重复、反转以上。插入重复、反转 录后整合的假基因、简单重复、片段性录后整合的假基因、简单重复、片段性 重复、串联重复重复、串联重复 基因组差异：人与人之间基因组基因组差异：人与人之间基因组9999，99%99%是相同是相同 的，差异仅万分之一，不存在优秀基因的，差异仅万分之一，不存在优秀基因 组之说。不存在白种人基因组、黄种人组之说。不存在白种人基因组、黄种人 基因组。基因组。人类只有一个基因组人类只有一个