实验三-考马斯亮蓝法测定蛋白质含量ppt课件.ppt

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1、实验三实验三 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 n一.目的:掌握考马斯亮蓝G250染色法测定蛋 白质的原理和操作.n二.原理n三.仪器与用具n四.实验试剂n五.实验操作n六 实验报告水产示范中心二.原理:n考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。n蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间

2、内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。n该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。水产示范中心三.仪器与用具n721分光光度计；10 mL量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1 mL 3支，01 mL 3支；10 mL具塞刻度试管14支。水产示范中心四.实验试剂n标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100g mL的标准蛋白溶液;n考马斯亮蓝G-250溶液：称取100g考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90乙醇中，加入8

3、5的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容到1000 mL，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。水产示范中心五.实验操作n1标准曲线(蛋白质含量为0100g mL)的绘制n牛血清蛋白溶液:浓度为100 g mL,按照表格配制 n混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。水产示范中心2.样品提取液中蛋白质浓度的测定n吸取样品提取液1.0 ml(why?)，放入 试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5Min后在595nm下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。水产示范中心注意事项:n1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为这段时间内颜色最稳定。n2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。水产示范中心思考题n（1）试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定方法的有缺点。水产示范中心