第二章 生产菌种的选育.pptx

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1、第二章第二章生产菌种的选育培养生产菌种的选育培养Microbialbreedingandcellcultivation有些微生物能在厌氧的条件下生长；有些微生物能在厌氧的条件下生长；有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长；的生长；有些微生物能进行复杂的代谢；有些微生物能进行复杂的代谢；有些微生物能利用较复杂的化合物；有些微生物能利用较复杂的化合物；有些微生物能在极端的环境下生长。有些微生物能在极端的环境下生长。微生物的特点微生物的特点概概述述一、微生物代谢产物一、微生物代谢产物（一）初级代谢产物（一）初级代谢产物(Primarymet

2、abolite)：微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物。微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物。（二）次级代谢产物（二）次级代谢产物(Secondarymetabolite)：与菌体的生长繁殖无明确关系的代谢产物，既不参与与菌体的生长繁殖无明确关系的代谢产物，既不参与细胞结构，也不是储存养料。细胞结构，也不是储存养料。抗生素抗生素(antibiotic)、生物碱、生物碱(alkaloid)、色素、色素(pigment)等等氨基酸，核苷酸，脂肪酸，维生素，蛋白质，多糖，氨基酸，核苷酸，脂肪酸，维生素，蛋白质，多糖，低级有机酸，醇等低级有机酸，醇等突变菌株：营养缺陷型、抗性变株，基因工程菌等。突变菌株：

3、营养缺陷型、抗性变株，基因工程菌等。第一节第一节微生物的代谢及调控微生物的代谢及调控1、微生物合成次级代谢产物的基本特征、微生物合成次级代谢产物的基本特征(1)次级代谢产物具有种特异性次级代谢产物具有种特异性(2)分批发酵时，产生菌生长周期三个时期分批发酵时，产生菌生长周期三个时期(3)次级代谢产物不少是结构相似的混合物次级代谢产物不少是结构相似的混合物(4)次级代谢产物的合成受多基因控制次级代谢产物的合成受多基因控制(1)次级代谢产物具有种特异性次级代谢产物具有种特异性分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素如：灰色链霉菌：如：灰色链霉菌：链霉素链霉素

4、-氨基环醇类氨基环醇类杀假丝菌素杀假丝菌素-六烯大环内酯类六烯大环内酯类不同的微生物也能产生相同的抗生素不同的微生物也能产生相同的抗生素如：头孢菌素如：头孢菌素C：顶头孢霉和克拉维链霉菌：顶头孢霉和克拉维链霉菌(2)分批发酵时，产生菌生长周期三个时期分批发酵时，产生菌生长周期三个时期三个时期三个时期:菌体生长期菌体生长期产物合成期产物合成期菌体自溶期菌体自溶期(3)次级代谢产物不少是结构相似的混合物次级代谢产物不少是结构相似的混合物产黄青霉菌合成具有不同生物活性的青霉素产黄青霉菌合成具有不同生物活性的青霉素(青霉素青霉素G、V、O、F、X)，青霉素母核，青霉素母核-6-氨基青霉烷酸（氨基青霉烷

5、酸（6-APA）R=G-C6H5CH2-,X-HOC6H4CH2-,F-CH3(CH2)4-,V-C6H50CH2-原因原因参与次级代谢产物合成酶系的底物特异性不强。参与次级代谢产物合成酶系的底物特异性不强。产生菌利用一种或两种以上初级代谢产物合成一种主产生菌利用一种或两种以上初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，产生菌继续对该产物进行多种化要的次级代谢产物，产生菌继续对该产物进行多种化学修饰而同时合成多种衍生物。此种生物合成现象，学修饰而同时合成多种衍生物。此种生物合成现象，有时称为有时称为“代谢树代谢树”。一种次级代谢产物可由两种或。一种次级代谢产物可由两种或两种以上的代谢途径合成的，这

6、种方式有时称为两种以上的代谢途径合成的，这种方式有时称为“代代谢网谢网”。原利福霉素原利福霉素I利福霉素利福霉素Y利福霉素利福霉素B利福霉素利福霉素O利福霉素利福霉素L利福霉素利福霉素W利福霉素利福霉素R利福霉素利福霉素A,C,D,E利福霉素利福霉素G利福霉素利福霉素S2丙二酸单元丙二酸单元8甲基丙二酸单元甲基丙二酸单元3-氨基氨基-5-羟基苯甲酸羟基苯甲酸利福平的生物合成（代谢树）利福平的生物合成（代谢树）红霉素的生物合成红霉素的生物合成(代谢网代谢网)1-红霉素红霉素A;2-红霉素红霉素B;3-红霉素红霉素C;4-红霉素红霉素D;5-红霉素红霉素E;6-红霉素红霉素F;EB-红霉内酯红霉内

7、酯B;EA-红霉内酯红霉内酯A;M-碳霉糖碳霉糖;C-红红霉糖霉糖;D-脱氧氨基己糖脱氧氨基己糖OCODHOOCH3CH3CH3OCH3OOEB EAEBEBOM EAEBOCODOM EAEBODOMODOC EAOCODCH2OH EAODHO123456(4)次级代谢产物的合成受多基因控制次级代谢产物的合成受多基因控制染色体基因簇结构基因；染色体基因簇结构基因；质粒调控基因，抗性基因质粒调控基因，抗性基因质粒：质粒：（1）天蓝色链霉菌生物合成次甲霉素）天蓝色链霉菌生物合成次甲霉素A的的4个或个或5个个结构基因在结构基因在SCPl质粒上质粒上（2）螺旋霉素生物合成中，结构基因编码于复制子）

8、螺旋霉素生物合成中，结构基因编码于复制子上，而调节基因位于质粒上。上，而调节基因位于质粒上。初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，而在许多抗生素产生茵如天蓝色链霉菌、金霉素链而在许多抗生素产生茵如天蓝色链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、龟裂链霉菌、卡那霉素链霉菌霉菌、灰色链霉菌、龟裂链霉菌、卡那霉素链霉菌等中发现，抗生素的合成同时受到核外遗传物质等中发现，抗生素的合成同时受到核外遗传物质-质质粒的控制，因此，有人将受到质粒控制的代谢产物粒的控制，因此，有人将受到质粒控制的代谢产物称为称为“质粒产物质粒产物”。1、次级代谢产物构建单位的生源说和生

9、物合成、次级代谢产物构建单位的生源说和生物合成生源说生源说指的是次级代谢产物分子中构建单位的各种原子指的是次级代谢产物分子中构建单位的各种原子的起源的起源有机化学。有机化学。生物合成指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级生物合成指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级代谢产物的过程代谢产物的过程生物化学。生物化学。中间产物：五碳、四碳、三碳、二碳化合物中间产物：五碳、四碳、三碳、二碳化合物“分叉中间体分叉中间体”：某些中间产物，即可用于合成初级代：某些中间产物，即可用于合成初级代谢产物，又可用于合成次级代谢产物。谢产物，又可用于合成次级代谢产物。（三）初级代谢与次级代谢之间的关系（三）初级代

10、谢与次级代谢之间的关系特殊前体特殊前体(一一)聚酮体：聚酮体是通过连续的低级羧酸如乙酸、丙酸等在聚酮体：聚酮体是通过连续的低级羧酸如乙酸、丙酸等在聚酮体合成酶聚酮体合成酶(PKS)作用下脱羧缩合作用下脱羧缩合合成起始单位有乙酰辅酶合成起始单位有乙酰辅酶A(CoA)、丙酰、丙酰CoA和丁酰和丁酰CoA等。等。（1）葡萄糖）葡萄糖(或脂肪酸或脂肪酸)降解降解-乙酰乙酰CoA（2）丙酸单位可由琥珀酰）丙酸单位可由琥珀酰CoA转化、奇数碳脂肪酸降解、支转化、奇数碳脂肪酸降解、支链氨基酸降解等形成。链氨基酸降解等形成。（3）丁酸单位通常由一个乙酰丁酸单位通常由一个乙酰CoA与一个丙酰与一个丙酰CoA缩合

11、形成，缩合形成，还可由亮氨酸经过还可由亮氨酸经过2-C-异己酸降解生成。异己酸降解生成。亮氨酸亮氨酸2-C-异已酸异已酸乙酰乙酸乙酰乙酸丁酸丁酸转氨酶转氨酶作为链的延长单位有丙二酰作为链的延长单位有丙二酰CoA、甲基丙二酰、甲基丙二酰CoA、乙基丙二酰乙基丙二酰CoA等。是等。是C2、C3和和C4的供体的供体（4）乙酰）乙酰CoA丙酰丙酰CoA缩合缩合丁酸丁酸乙基丙二酰乙基丙二酰CoA（3）丙酰）丙酰CoA+草酰乙酸草酰乙酸甲基丙二酰甲基丙二酰CoA十丙酮酸十丙酮酸羧基转移酶羧基转移酶（2）丙酰）丙酰CoA+ATP+CO2+H2O甲基丙二酰甲基丙二酰CoA+ADP+Pi丙酰丙酰CoA羧化酶羧化

12、酶（1）乙酰）乙酰CoA+ATP+C02+H2O丙二酰丙二酰CoA+ADP+Pi乙酰乙酰CoA羧化酶羧化酶-聚酮体链连续而完全的还原反应获得脂肪酸；聚酮体链连续而完全的还原反应获得脂肪酸；不完全的还原或还原位点的不同可获得变化范围广泛的不完全的还原或还原位点的不同可获得变化范围广泛的聚酮体。聚酮体。经过重复脱水常得到芳香化合物经过重复脱水常得到芳香化合物(如四环类、蒽环类抗生如四环类、蒽环类抗生素素)经过环化作用形成大内酯环经过环化作用形成大内酯环(大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素)，如果，如果形成多个双键的环状化合物，就可能导致多烯大环内酯形成多个双键的环状化合物，就可能导致多烯大环内酯类抗

13、生素的合成。类抗生素的合成。甲羟戊酸和异戊烯焦磷酸的生物合成甲羟戊酸和异戊烯焦磷酸的生物合成HHHOOOHCOSCoAMeMeCOCH2COSCoAHCH2COSCoAOHOOHHOHSCOAMeOPPHMeHHHOHOOHOHMeOOOHMeOPOOHOPOOHOMeOPPMeHHRS*-CH2COSCoAHMeCOSCoA+-+乙酰乙酰乙酰乙酰-COA硫解酶硫解酶HMGCoA合成酶合成酶HMGCoA还原酶还原酶-HRNADPHNADPH2ATPATP-CO2异构酶异构酶(二二)甲羟戊酸甲羟戊酸(3-甲基甲基-3，5-二羟基戊酸，二羟基戊酸，MVA)乙酰乙酰CoA3-羟羟-3-甲甲-戊二酰戊

14、二酰CoA甲羟戊酸甲羟戊酸甲羟戊酸甲羟戊酸-5-焦磷酸焦磷酸异戊二烯焦磷酸异戊二烯焦磷酸异戊二烯类或异戊二烯类或萜类次级代谢产物萜类次级代谢产物赤霉素赤霉素生物碱生物碱甾醇甾醇胡萝卜素胡萝卜素(三三)糖类和氨基糖糖类和氨基糖O-糖苷，糖苷，N-糖苷、糖苷、S-糖苷、糖苷、C-糖苷等与次级代谢产物分子糖苷等与次级代谢产物分子中的糖苷配体连接。中的糖苷配体连接。葡萄糖和戊糖是这些糖类和氨基糖的前体。葡萄糖和戊糖是这些糖类和氨基糖的前体。葡萄糖的碳架经过异构化、氨基化、脱氧、碳原子重排、葡萄糖的碳架经过异构化、氨基化、脱氧、碳原子重排、氧化还原或脱羧等修饰后并人次级代谢产物的分子中。氧化还原或脱羧等

15、修饰后并人次级代谢产物的分子中。葡萄糖是合成稀有戊糖的直接前体。部分稀有戊糖是在核葡萄糖是合成稀有戊糖的直接前体。部分稀有戊糖是在核苷合成之后直接对核糖部分进行修饰而形成的。苷合成之后直接对核糖部分进行修饰而形成的。链霉糖的生物合成链霉糖的生物合成灰色链霉菌提取物灰色链霉菌提取物NADPH灰色链霉菌提取物灰色链霉菌提取物二氢链霉糖二氢链霉糖L-鼠李糖鼠李糖NADPH脱氧酰苷脱氧酰苷-5-二磷酸葡萄糖二磷酸葡萄糖(四四)不常见的氨基酸不常见的氨基酸200余种非蛋白质氨基酸余种非蛋白质氨基酸(称不常见氨基酸称不常见氨基酸)，如，如D-氨基氨基酸、酸、N-甲基氨基酸；脱氢的和甲基氨基酸；脱氢的和-氨

16、基酸、稀有的二氨氨基酸、稀有的二氨基酸基酸(如二氨基丁酸如二氨基丁酸)。D-氨基酸可能由氨基酸可能由L-氨基酸通过氨基酸消旋酶催化形成氨基酸通过氨基酸消旋酶催化形成的。的。有的是由正常氨基酸生物合成途径合成的，如有的是由正常氨基酸生物合成途径合成的，如-氨基氨基己二酸是合成头孢菌素的一个构建单位。己二酸是合成头孢菌素的一个构建单位。(五五)环多醇和氨基环多醇环多醇和氨基环多醇环多醇是带有一些羟基的环碳化合物。环多醇是带有一些羟基的环碳化合物。氨基环多醇是环多醇分子中的一个或多个羟基被氨基环多醇是环多醇分子中的一个或多个羟基被氨基取代的衍生物。氨基取代的衍生物。氨基环醇类抗生素氨基环醇类抗生素(

17、如链霉素、庆大霉素、卡那如链霉素、庆大霉素、卡那霉素等霉素等)的分子中最常见的环多醇部分是由葡萄的分子中最常见的环多醇部分是由葡萄糖衍生来的，如糖衍生来的，如-脱氧链霉胺、链霉胍都是葡萄脱氧链霉胺、链霉胍都是葡萄糖经过磷酸化、环化等反应形成环多醇，继续经糖经过磷酸化、环化等反应形成环多醇，继续经过氨基化等反应衍生来的。过氨基化等反应衍生来的。比较源自比较源自D-葡萄糖的链霉胍，葡萄糖的链霉胍，2-脱氧链霉胺和脱氧链霉胺和Actinamine的标记模式的标记模式共同的中间体共同的中间体（X,Y=HorOH）(六六)非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱的生物合成非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱的生物合成在次级代谢产物中出

18、现的非核酸嘌呤碱基和嘧啶碱在次级代谢产物中出现的非核酸嘌呤碱基和嘧啶碱基是由合成核酸用的嘌岭和嘧啶经过化学修饰而形基是由合成核酸用的嘌岭和嘧啶经过化学修饰而形成的。成的。(七七)芳香中间体芳香中间体（八）甲基（八）甲基S-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)次级代谢产物生物合成的基本过程次级代谢产物生物合成的基本过程（一）构建单位的聚合（一）构建单位的聚合如柱晶白霉素由如柱晶白霉素由5个乙酰单位，个乙酰单位，1个丙酸单位，个丙酸单位，1个丁酸单位，个丁酸单位，1个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩个羟基乙酰单位经聚酮体途径缩合而成。合而成。新生霉素生源说新生霉

19、素生源说（）来自甲硫氨酸；）来自甲硫氨酸；*来自葡萄糖来自葡萄糖来自酪氨酸来自甲羟戊酸来自莽草酸OHCOOOOHNH(CH3)来自谷氨酰胺OOOHOCNH2OO(H3C)CH3(H3C)*（二）次级代谢产物的最终修饰（二）次级代谢产物的最终修饰四环素四环素土霉素土霉素脱氢四环素脱氢四环素C4氧化反应及氨化反应氧化反应及氨化反应C6羟化反应羟化反应C4-NH2甲基化反应甲基化反应四环素环四环素环四环素环四环素环C7氯化反应金霉素氯化反应金霉素O HO HN(CH3)2O HCONH2OOR1R3R2R4OHHH12345678910111211a12a二、微生物代谢的调节及控制二、微生物代谢的调

20、节及控制2、酶合成的调节（即酶量的调节）、酶合成的调节（即酶量的调节）3、能荷调节、能荷调节1、酶活性的调节、酶活性的调节酶活性的激活酶活性的激活酶活性的抑制酶活性的抑制协同反馈抑制协同反馈抑制累积反馈抑制累积反馈抑制增效反馈抑制增效反馈抑制顺序反馈抑制顺序反馈抑制（一）微生物代谢的自我调节机制（一）微生物代谢的自我调节机制反馈抑制模式反馈抑制模式 -协同反馈抑制分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性同途径中的第一个酶活性ABCDEFG反馈抑制模式反馈抑制模式 -累积反馈抑制累积反馈抑制每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中

21、第每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中第一个酶活性一个酶活性ABCDEFG58%40%30%反馈抑制模式反馈抑制模式-增效反馈抑制增效反馈抑制代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第一个酶活性，但是两个末端产物同时过反应途径中的第一个酶活性，但是两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和ABCDEFG20%15%90%反馈抑制模式反馈抑制模式-顺序反馈抑制顺序反馈抑制每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分每个分支末端产物抑制分支后的第一个

22、酶，产生部分抑制作用抑制作用BACDEFGHIJK2、酶合成的调节、酶合成的调节-诱导与阻遏诱导与阻遏（2）酶合成的阻遏）酶合成的阻遏降解酶类降解酶类由诱导作用和分解代谢产物来调节活性由诱导作用和分解代谢产物来调节活性合成酶合成酶主要由反馈抑制和反馈阻遏（指代谢的终产物达主要由反馈抑制和反馈阻遏（指代谢的终产物达到一到一定浓度时，阻遏该代谢途径中的一种酶或几种酶的生定浓度时，阻遏该代谢途径中的一种酶或几种酶的生物合成）调节。物合成）调节。（1）酶合成的诱导）酶合成的诱导组成酶：组成酶：有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在。有些酶的合成不依赖于环境中物质的存在。诱导酶：诱导酶：只有在它们催化的底

23、物只有在它们催化的底物(或底物的结构类似物或底物的结构类似物)存在时才能合成的酶。存在时才能合成的酶。3、能荷调节、能荷调节1.能荷能荷指细胞中指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可供利用的高系统中可供利用的高能磷酸键的量度。能磷酸键的量度。2.能荷调节能荷调节(或称腺苷酸调节或称腺苷酸调节)指细胞通过改变指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动。三者比例来调节其代谢活动。RUU-ATP利用体系的酶利用体系的酶R-ATP合成体系的酶合成体系的酶放线菌（链霉素放线菌（链霉素四环素；红霉素四环素；红霉素等）等）真菌（青霉素、头孢等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽

24、孢的细菌植物或动物来源植物或动物来源（一）抗生素生产有关的微生物（一）抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：目前发现的生物来源如下：一、常见的工业微生物一、常见的工业微生物第二节第二节生产菌种的选育方法生产菌种的选育方法（二）氨基酸生产有关的微生物（二）氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产菌的要求：氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属棒杆菌属，短

25、杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌草芽孢杆菌（三）食品酶制剂生产有关的微生物（三）食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验。美国开发一个新酶，都要经过一系列毒理试验。美国需要得到需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。生物能用于生产食品用酶。a-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌和地衣牙孢杆

26、菌FDA-FoodandDrugAdministration(美国美国)食品及药物管理局食品及药物管理局：generallyrecognizedassafe/一般认为安全一般认为安全GRAS工业化菌种的要求工业化菌种的要求1.生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；与致病菌无关）；2.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；合成产物；3.有关合成产物的途径尽能地简单，或者说菌种改造有关合成产物的途径尽能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；的可操作性要强；4.遗传性能要相对

27、稳定；遗传性能要相对稳定；5.不易感染它种微生物或噬菌体；不易感染它种微生物或噬菌体；6.生产特性要符合工艺要求。生产特性要符合工艺要求。二、新菌种的分离二、新菌种的分离(separation)与筛选与筛选(sereeing)1.样品采集；样品采集；2.预处理；预处理；3.富集培养；富集培养；4.初筛；初筛；5.复筛；复筛；6.性能鉴定；性能鉴定；7.保藏保藏实例：实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）8030分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性芽孢杆菌，产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌嗜碱性芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲

28、利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型constitutiveexpressioninducibleexpression一）采样时要注意的问题一）采样时要注意的问题气候、水分、空气气候、水分、空气来源要广来源要广结合产品的特点结合产品的特点标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：富集的三种方案：定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行

29、培养；行培养；二）富集培养二）富集培养富集的目的：富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。可能。当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考类学中考虑；虑；不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能时只能通过随机分离的办法。通过随机分离的办法。定向培养的富集方法定向培养的富集方法1、底物、底物(Substrate)2、pH条件条件3、培养时间、培养时间4、培养温度、培养温度一切能提高目的微生物相对生一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养长速度的手段，培

30、养(固体、固体、液体；分批连续液体；分批连续)后使目的微后使目的微生物在种群中占优势。生物在种群中占优势。案例分析案例分析工业乳酸发酵的菌种选育工业乳酸发酵的菌种选育符合工业生产的菌种的标准：符合工业生产的菌种的标准：经济性能好，能高效生产乳酸；经济性能好，能高效生产乳酸；同型发酵，即只生产单一的一种乳酸分子而无其他有同型发酵，即只生产单一的一种乳酸分子而无其他有机酸副产物；机酸副产物；具有在较高浓度的乳酸环境中生存的能力；具有在较高浓度的乳酸环境中生存的能力；具有较高的耐热性；具有较高的耐热性；菌种的营养要求相对简单；菌种的营养要求相对简单；选择抗噬菌体菌株。选择抗噬菌体菌株。Lactica

31、cidbacteria,LAB乳酸菌菌株乳酸菌菌株能否在葡萄糖上生长能否在葡萄糖上生长是否同型发酵是否同型发酵耐乳酸钠试验耐乳酸钠试验产物的立体结构专一性产物的立体结构专一性第二阶段筛选第二阶段筛选NN弃去弃去弃去弃去第一阶段流程第一阶段流程有希望的菌株有希望的菌株生长温度筛选，驯化生长温度筛选，驯化生物反应器分批发酵生物反应器分批发酵细胞细胞-发酵液分离特性发酵液分离特性耐产物驯化耐产物驯化第二阶段流程第二阶段流程有希望的菌株有希望的菌株菌种分离的一般过程菌种分离的一般过程样品的采取样品的采取预处理预处理 培养培养菌落的选择菌落的选择产品的鉴定产品的鉴定使隔离使隔离,使孤立使孤立,使绝缘使绝

32、缘,离析离析ScreenIsolate屏屏,银幕银幕,筛子筛子,掩蔽物掩蔽物,屏风，掩蔽屏风，掩蔽,包庇包庇,放映放映,拍摄拍摄ing高通量筛选高通量筛选三、菌种改良及工程菌构建三、菌种改良及工程菌构建第三节第三节微生物代谢控制育种的措施微生物代谢控制育种的措施一、一、营养缺陷型营养缺陷型初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选（1）降低终产物浓度）降低终产物浓度筛选终产物营养缺陷型筛选终产物营养缺陷型(auxotrophicmutant)筛选细胞膜透性改变的菌株筛选细胞膜透性改变的菌株（2）筛选抗反馈突变菌株）筛选抗反馈突变菌株筛选结构类似物抗性突变株筛选结构类似物抗性突变株利用

33、回复突变筛选抗反馈突变株利用回复突变筛选抗反馈突变株2、次级代谢产物高产菌株的筛选、次级代谢产物高产菌株的筛选（1）利用营养缺陷型筛选）利用营养缺陷型筛选磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸4磷酸赤藓糖磷酸赤藓糖7磷酸阿拉伯庚酮糖磷酸阿拉伯庚酮糖莽草酸莽草酸分枝酸分枝酸对氨基苯酸对氨基苯酸氯霉素氯霉素苯丙氨酸（营养物）苯丙氨酸（营养物）酪氨酸（营养物）酪氨酸（营养物）色氨酸（营养物）色氨酸（营养物）反馈调节反馈调节产黄青霉生物合成赖氨酸和青霉素的分枝途径产黄青霉生物合成赖氨酸和青霉素的分枝途径-酮戊二酸酮戊二酸+乙酰辅酶乙酰辅酶A高柠檬酸高柠檬酸赖氨酸赖氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素G反馈抑制

34、反馈抑制-氨基己二酸氨基己二酸同型柠檬酸合成酶同型柠檬酸合成酶渗漏缺陷型渗漏缺陷型(leakymutant)所谓渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营所谓渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营养缺养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量地生长。由于渗漏缺陷型不会在基本培养基上少量地生长。由于渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间代谢物的积累。中间代谢物的积累。二、抗反馈抑制突变株

35、二、抗反馈抑制突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株-酮戊二酸乙酰辅酶酮戊二酸乙酰辅酶A高柠檬酸合成酶高柠檬酸合成酶反馈调节反馈调节-氨基已二酸氨基已二酸高柠檬酸高柠檬酸结构类似物结构类似物赖氨酸赖氨酸异青霉素异青霉素N青霉素青霉素表表2-1一些用来筛选抗性突变株的结果类似物一些用来筛选抗性突变株的结果类似物三、其他类型的突变株三、其他类型的突变株工业菌种改良方法工业菌种改良方法(1)解解除除或或绕绕过过代代谢谢途途径径中中的的限限速速步步骤骤：通通过过增增加加特特定定基基因因的的拷拷贝贝数数或或增增加加相相应应基基因因的的表表达达能能力力来来提提高高限限速速酶酶的

36、的含含量量；在在代代谢谢途途径径中中引引伸伸出出新新的的代代谢谢步步骤骤，由由此此提提供供一一个个旁路代谢途径。旁路代谢途径。(2)增加前体物的浓度。增加前体物的浓度。(3)改改变变代代谢谢途途径径，减减少少无无用用副副产产品品的的生生成成以以及及提提高高菌菌种种对对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。改进菌种外泌产品的能力。(6)消消除除代代谢谢产产品品的的反反馈馈抑抑制制。如如诱诱导导代代谢谢产产品品的的结结构构类类似似物抗性。物抗性。Overviewof

37、tetrapyrrolebiosynthesisGlutamate-1-semiadenhydeGlutamyl-tRNAHemAHemL5-aminolevulinicacidglycineSuccinyl-CoA+HemC,DUroporphyrinogenIIICoproporphyrinigenIIIPrecorrin-2ProtoporphyrinIXProtoheamIXHemYHemHCobAVitaminB12siroheamheamd1PorphobilinogenHemBHemE0.00.51.01.52.02.5024487296120Time(h)Concentrati

38、onofCPIII(mg/L)pPK705pKHEM04(hemA)pKHEM05(hemA,B)pKHEM06(hemB)Piao Y,KiatpapanP,YamashitaM.et al.,EffectsofexpressionofhemAandhemBgenesonproductionofporphyrinin Propionibacterium freudenreichii.ApplEnvironMicrobiol2004,70:7561-7566第四节第四节菌种的扩大培养及保藏菌种的扩大培养及保藏菌菌种种扩扩大大培培养养是是指指将将保保存存在在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中

39、处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接接入入试试管管斜斜面面活活化化后后，再再经经过过扁扁瓶瓶或或摇摇瓶瓶及及种种子子罐罐逐逐级级扩扩大大培培养养,最最终终获获得得一一定定数数量量和和质质量量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一、菌种的扩大培养一、菌种的扩大培养:种子扩培的目的种子扩培的目的接种量的需要接种量的需要菌种的驯化菌种的驯化l缩短发酵时间、保证生产水平缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：种子的要求：总量及浓度能满足要求总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长活力强，移种至发酵后，

40、能够迅速生长无杂菌污染无杂菌污染菌种扩大培养的基本过程菌种扩大培养的基本过程实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。子培养。生产车间阶段：生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归为发酵车间管理，因此称这些培养过程为生产车厂归为发酵车间管理，因此称这些培养过程为生产车间阶段。间阶段。1）实验室阶段）实验室阶

41、段培养物选择的原则培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽胞的微生物对于不产孢子和芽胞的微生物获得一定数量和质量的菌体获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。的种子培养。（一）实验室种子的制备（一）实验室种子的制备获得一定数量和质量的孢子获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质

42、稳定的菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。种子，但操作繁琐。对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的菌丝体获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。便于操作，但需要更仔细的控制。2）培养基选择的原则）培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一

43、般都比较精细。精细。3）起始接种物的传代问题）起始接种物的传代问题细菌细菌保藏保藏活化斜面活化斜面产孢子产孢子保藏保藏母斜面母斜面子斜面子斜面要求：使菌种的传代次数尽可能的少。要求：使菌种的传代次数尽可能的少。（二）生产车间种子制备（二）生产车间种子制备（1）培养物的选择原则）培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。数量的菌丝体。缩短发酵时间缩短发酵时间有利于获得良好的发酵结果有利于获得良好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：（2）培养基选择的原则）培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基目的：获得一

44、定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本一是成本二是驯化二是驯化（3）种龄）种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。

45、原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。大，但是最终由实验结果定。（4）发酵级数的确定）发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵谷氨酸：三级发酵一级种子一级种子(摇瓶摇瓶)二级种子二级种子(小罐小罐)发酵发酵青霉素：三级发酵青霉素：三级发酵一级种子一级种子(小罐小罐)二级种子二级种子(中罐中罐)发酵发酵一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数厂从第一级种子罐开始计算发酵级数发酵级数确定的依据发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影

46、响；级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级；级；在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。的一个方面。（5）接种量的确定）接种量的确定移入种子的体积移入种子的体积接种量接种量接种后培养液的体积接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。但是一般认为大一点好。单种法单种法1个种子罐的种子接入个种子罐的种子接入1个发酵罐；个发酵罐；双种法

47、双种法2个种子罐的种子接入个种子罐的种子接入1个发酵罐；个发酵罐；倒种法倒种法以一个发酵罐部分发酵液给另一发酵罐作为种子；以一个发酵罐部分发酵液给另一发酵罐作为种子；混种法混种法以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子。以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子。接种方法：接种方法：1细胞或菌体细胞或菌体菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。的重要指标。2生化指标生化指标种子液的糖、氮、磷含量的变化和种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌生长值变化是菌生长繁殖、物质代谢的反映。繁殖、物质代谢的反映。3产物生成量产物生成量种子液中产物

48、的生成量是多种抗生素发酵考察种子质种子液中产物的生成量是多种抗生素发酵考察种子质量的重要指标。量的重要指标。4酶活力酶活力土霉素生产的种子液中测定淀粉酶活力土霉素生产的种子液中测定淀粉酶活力。种子质量标准种子质量标准二、菌种的衰退与复壮二、菌种的衰退与复壮菌种衰退菌种衰退(degeneration)：菌种经过长期人工培养或保：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。或消失的现象。防止菌种退化的措施防止菌种退化的措施控制传代次数控制传代次数选择合适的培养条件选择合适的培养条件选择合适的保藏方法选择合适的保藏方法

49、菌种稳定性检查菌种稳定性检查分离复壮分离复壮u在生产发酵中，具有高产有重要经济价在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。发酵过程极为重要。理想的菌种保藏方法应具备的条件理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；经长期保藏后菌种存活健在；(2)保保证证高高产产突突变变株株不不改改变变表表型型和和基基因因型型，特特别别是是不不改改变变初初级级代代谢谢产产物物和和次次级级代代谢谢产产物物生生产产的的高高产能力。产能力。菌种保藏

50、的基本措施是低温、干燥、真空。菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。三、菌种的保藏三、菌种的保藏1、斜面保藏法和穿刺保藏法、斜面保藏法和穿刺保藏法2、石蜡油封存法、石蜡油封存法3、沙土管、沙土管4、麸皮保藏法、麸皮保藏法5、冷冻干燥、冷冻干燥6、液氮低温保藏、液氮低温保藏7、其他方法、其他方法菌种的保藏方法菌种的保藏方法低温保藏低温保藏低温保藏种类低温保藏种类一、普通冷冻保藏技术一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术二、超低温冷冻保藏技术(-60-80)三、液氮冷冻保藏技术三、液氮冷冻保藏技术冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质（常冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的