第六章第四节 蛋白质及氨基酸的测定.ppt

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1、生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定6.46.4 蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定一一 概述概述二二 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法三三 氨基酸的测定方法氨基酸的测定方法 生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 蛋蛋白白质质是是含含氮氮的的有有机机化化合合物物，分分子子量量很很大大。主主要要由由C C、H H、O O、N N、S S五五种种元元素素组组成成。某某些些蛋蛋白白质质中中还还含含有微量的有微量的 P P、CuCu、FeFe、I I 等。等。蛋白质基本组成单位是氨基酸。蛋白质基本组成单位是氨基酸。一

2、一 概述概述1 1蛋白质的构成蛋白质的构成生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定蛋蛋白白质质是是生生命命的的物物质质基基础础，蛋蛋白白质质占占人人体体重重量量的的16.3%16.3%，人体，人体11%-13%11%-13%总热量来自蛋白质。总热量来自蛋白质。蛋蛋白白质质是是食食品品重重要要的的营营养养成成分分，是是最最重重要要的的质质量指标，是食品良好色、香、味及品质的保障。量指标，是食品良好色、香、味及品质的保障。2 2蛋白质的作用蛋白质的作用生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定3 3食物中蛋白质的含量食物中蛋白质

3、的含量食物名食物名称称蛋白质蛋白质含量含量食物名食物名称称蛋白质蛋白质含量含量猪肉猪肉9.5%9.5%苹果苹果0.4%0.4%牛肉牛肉20.0%20.0%柑橘柑橘0.9%0.9%带鱼带鱼 18.0%18.0%菠菜菠菜2.4%2.4%大豆大豆 40%40%黄瓜黄瓜1.0%1.0%生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定4 4蛋白质换算系数蛋白质换算系数 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为质含氮量为16%16%，即一份氮素相

4、当于，即一份氮素相当于6.256.25份蛋白份蛋白质，此数值质，此数值6.256.25称为蛋白质系数称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米米、肉、肉、蛋为蛋为6.256.25，花生为，花生为5.465.46，大米为，大米为5.955.95，大豆及其制品为大豆及其制品为5.715.71，小麦粉为，小麦粉为5.705.70，牛乳及其，牛乳及其制品为制品为6.386.38。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定蛋白质的测定方法分两大类：蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等

5、测一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：具体测定方法：凯氏定氮法凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。最常用的，国内外应用普遍。双缩脲法、染料结合法、酚试剂法双缩脲法、染料结合法、酚试剂法国外：国外：红外分析仪红外分析仪5 5蛋白质测定方法蛋白质测定方法生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括在食品和生物材料中常

6、包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物（如核酸、含氮碳水化合有非蛋白质含氮的化合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为为粗蛋白粗蛋白的含量。的含量。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定由由KieldhlKiel

7、dhl于于18331833年提出，年提出，凯氏定氮法凯氏定氮法是是测定测定总有机氮量较为准确总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，操作较为简单的方法之一，可用于所可用于所有动、植物食品有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析及各种加工食品的的分析分析，可同时测定多个样品，故，可同时测定多个样品，故至今仍至今仍被作为标准被作为标准检验方法。检验方法。由于食品中由于食品中propro含量不同含量不同,分为凯氏定氮分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，它们的基本原理都是常量法、半微量法和微量法，它们的基本原理都是一样的。一样的。二二 蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法(一一)凯氏定氮法凯氏定氮法

8、生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 样样品品与与硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与与硫硫酸酸结结合合成成硫硫酸酸铵铵。然然后后加加碱碱蒸蒸馏馏，使使氨氨蒸蒸出出，用用硼硼酸酸吸吸收收后后再再以以标标准准盐盐酸酸或或硫硫酸酸溶溶液液滴滴定定。根根据据标标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。原理原理1 1 常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法生命科学与技术学院生命科学与技术学院

9、蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定消化消化 总反应式：总反应式：2NH2NH2 2（CHCH2 2）2 2COOH+13HCOOH+13H2 2SOSO4 4 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4+6CO+6CO2 2 +12SO+12SO2 2 +16H+16H2 2O OH H2 2SO4SO4 脱水性脱水性脱水性脱水性氧化性氧化性氧化性氧化性测定过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定测定过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点点

10、340340，加入硫酸钾之后可以提高至，加入硫酸钾之后可以提高至400400以上。也可以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。氢铵也会分解，放出氨而造成损失。加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。生命科

11、学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 蒸馏：蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：吸收与滴定：吸收与滴定：氨气用硼酸溶液吸收，完全后，用盐氨气用硼酸溶液吸收，完全后，用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下：程式如下：2N2NaOHOH (N

12、H(NH4 4)2 2SOSO4 4 2NH2NH3 3 NaNa2 2SOSO4 4 2H2H2 2O O 2NH 2NH3 3+4H4H3 3BOBO3 3=(NH=(NH4 4)2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O O (NH (NH4 4)2 2B B4 4O O7 7+2HCl+5H+2HCl+5H2 2O=2NHO=2NH4 4Cl+4HCl+4H3 3BOBO3 3酒红色酒红色蓝绿色蓝绿色 蓝绿色蓝绿色微红色微红色 生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定具体操作具体操作生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白

13、质及氨基酸的测定生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定样品消化：样品消化：准确称取均匀的固体样品准确称取均匀的固体样品0.53g，或或半固体样品半固体样品25g,或吸取溶液样品或吸取溶液样品1525ml。小心小心移入干燥的凯氏烧瓶中移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上勿粘附在瓶壁上)。加入。加入0.51g硫酸铜硫酸铜、10g硫酸钾及硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，浓硫酸，小心摇匀后，瓶颈瓶颈45角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化。先先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，泡沫消失

14、后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色，继续加热加大火力消化至溶液呈蓝绿色，继续加热0.5h，冷冷却至室温。却至室温。具体操作具体操作生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定样品蒸馏样品蒸馏：按图装好蒸馏装置按图装好蒸馏装置，冷凝管下端浸入接冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40gL硼酸溶液及混硼酸溶液及混合指示剂合指示剂56滴）。凯氏烧瓶内滴）。凯氏烧瓶内，加入加入200ml蒸馏水蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢慢慢加入

15、加入70ml400g/L氢氧氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。用直火加热蒸馏化钠，溶液应呈蓝褐色。用直火加热蒸馏30min，将蒸将蒸馏装置出口馏装置出口离开液面继续蒸馏离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液端后停止蒸馏。在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。氨是否完全蒸要过量，二是要防止样液中氨气逸出。氨是否完全蒸馏出来，馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。试纸检查馏出液是否为碱性。混合指示液：混合指示液：1份份0.1%甲基红乙醇溶液与甲基红乙醇溶液与5份份0.1%溴甲酚绿乙醇溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。溶液临

16、用时混合。也可用也可用2份份0.1%甲基红乙醇溶液与甲基红乙醇溶液与1份份0.1%次甲基次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。蓝乙醇溶液临用时混合。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定滴定滴定：将接受瓶内的硼酸液用将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准盐酸标准溶液滴定至终点溶液滴定至终点，蓝色变为灰红色，蓝色变为灰红色。同时做一试剂。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定式中式中:W蛋白质的质量分数，蛋白质的质量分数，%；

17、c盐酸标准盐酸标准液液的浓度，的浓度，mol/L；V1空白滴定消耗标准液量，空白滴定消耗标准液量，mL；V2试剂滴定消耗标准液量，试剂滴定消耗标准液量，mL；m样品质量，样品质量，g；0.014氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmol；F蛋白质系数。蛋白质系数。结果计算结果计算生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定说明：说明：所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存

18、在的情况下消化不完全而造成氮损失。消化不完全而造成氮损失。消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。化完全。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇辛醇或或液液体石蜡体石蜡或或硅油硅油作为

19、作为消泡剂消泡剂，并同时注意控制热源，并同时注意控制热源强度。强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入冷却，加入3030过氧化氢过氧化氢 2 23 m1 3 m1 后再继续加热后再继续加热消化。消化。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸口，再蒸1 1分钟后关掉热源分钟后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸。否则可能造成吸收液倒吸。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不

20、生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在氢氧化铜在70709090时发黑。时发黑。一般消化至呈透明后，继续消化一般消化至呈透明后，继续消化3030分钟即可，但对于含有分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。深绿色。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质

21、及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定2 2 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法消化蒸馏消化蒸馏样品消化后转移至样品消化后转移至100ml100ml容量瓶中定容。容量瓶中定容。在在接受瓶中接受瓶中加入加入1010mlml 40g/L 40g/L硼酸及硼酸及2 2滴滴甲基红甲基红-溴甲酚溴甲酚绿绿混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化液准确吸取消化液10mL10mL于反应管内，经漏斗再加入于反应管内，经漏斗再加入10mL10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内

22、的水加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏指示剂变绿色后继续蒸馏5min5min，将冷凝管尖端提离液，将冷凝管尖端提离液面继续蒸面继续蒸1min1min。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定3 3 自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定3 3 自动凯氏定氮法自动凯氏定氮法特点：特点：（1 1）消化装置用优质玻璃制成的凯）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。氏消化瓶，

23、红外线加热的消化炉。（2 2）快速：几分钟可消化完毕。）快速：几分钟可消化完毕。（3 3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。收和滴定，自动数字显示装置。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 传传统统的的凯凯氏氏定定氮氮法法应应用用范范围围广广，灵灵敏敏度度高高、准确，不要大仪器，但费时间，又环境污染。准确，不要大仪器，但费时间，又环境污染。新开发的：双缩脲法、新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、染料结合法、染料结合法、水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。(二二)其它方法其它方法生命科学与技术学院

24、生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定脲脲（尿尿素素）NHNH2 2COCONHNH2 2 加加热热至至150-160150-160时时，两两分分子子缩缩合合成双缩脲。成双缩脲。NH2CONHCONH2+NH3NH2CONH2+NH2CONH2原理原理1 1 双缩脲法双缩脲法双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这种反应叫双缩脲反应。种反应叫双缩脲反应。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定方法特点及应用范围方法特点及应用范围本本法法灵灵敏敏度度较较低低，但但操操作作简简单单快快速速，故故

25、在在生生物物化化学学领领域域中中测测定定蛋蛋白白质质含含量量时时常常用用此此法法。本本法法亦亦适适用用于于豆豆类类、油油料料、米米谷谷等作物种子及肉类等样品测定。等作物种子及肉类等样品测定。操作方法：操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。准曲线。蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有肽肽键键CONH与与双双缩缩脲脲结结构构相相似似。在在同同样样条条件件下下也也有有呈呈色色反反应应，在在一一定定条条件件下下，其其颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，可可用用分分光光光光度度计计来来测其吸光度，确定含量。（测其吸光度，确定含量。（5

26、60nm）生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定R R（NHCHCO NHCHCO）对紫外光有吸收作用在对紫外光有吸收作用在280 nm280 nm下，吸光度与蛋白下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。质浓度成直线关系，求含量。2 2 紫外吸收法紫外吸收法利用蛋白质的特有基团利用蛋白质的特有基团:原理原理生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定甲醛滴定法甲醛滴定法 1.1.原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性 NHNH2 2 基，又有基，又有 酸性酸性 COOH COOH 基，成中性内盐，加入甲醛基，成中性内

27、盐，加入甲醛 溶液后，与溶液后，与 NHNH2 2 结合，碱性消失，再结合，碱性消失，再用强碱来滴定用强碱来滴定 COOH COOH 基。基。2 2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）中游离氨基酸的测定）三三 氨基酸的测定方法氨基酸的测定方法生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定3双指示剂：双指示剂：20%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将氢氧化钠将20%甲醛中和至蓝色。

28、甲醛中和至蓝色。0.0500mol/L氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。4操作：移取含氨基酸样液约操作：移取含氨基酸样液约20mg，用水定容，用水定容至至100mL，取，取20mL于烧杯中，加于烧杯中，加60mL蒸馏水，蒸馏水，用用NaOH标准溶液滴定至酸度计指示标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，加，加10mL中性甲醛溶液，继续滴定至中性甲醛溶液，继续滴定至pH9.2为终点。为终点。另作一空白试验。另作一空白试验。生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定式中式中c氢氧化钠标准溶液的浓度，氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1空白试验甲醛滴定时消耗空白试

29、验甲醛滴定时消耗NaOH标准溶液的体积，标准溶液的体积，mL;V2样品稀释后加甲醛滴定时消耗样品稀释后加甲醛滴定时消耗NaOH标准溶液的体积，标准溶液的体积，mL;m测定用样品溶液相当于样品的质量，测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014氮的毫摩尔质量，氮的毫摩尔质量，g/mmol 5 5结果计算结果计算氨基酸态氮（氨基酸态氮（%）生命科学与技术学院生命科学与技术学院蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定6.46.4 重点重点1.凯氏定氮法原理及测定方法。凯氏定氮法原理及测定方法。2.双缩脲法测定原理。双缩脲法测定原理。3.氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。