宏基因组分析和诊断技术概述.docx

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1、宏基因组分析和诊断技术概述发布时间：2020-02-13（原创2020-02-12 CMDE中国器审）近年来，造成人类感染的病原微生物日益复杂，种类增多，抗菌 药物滥用致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。感染是 急危重症患者死亡的主要原因之一，随着新发病原微生物的出现、耐 药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡 率居高不下。据WHO统计，在全球，感染性疾病导致患者死亡占全部 死因的25%以上，每年1300万儿童死于感染性疾病。在中国，感染性 疾病占所有疾病的50%以上，造血系统肿瘤患者75%死于感染，实体肿 瘤患者50%死于感染，脓毒症（严重感染）患者病死率高达

2、50虬 重症 感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生 物至关重要。面对重症感染患者，能否快速确认感染病原体，成为后 续对症治疗的关键，基于宏基因组新一代测序技术（metagenomics next-generation sequencing, mNGS）为解决这一问题提供了一个可 能的突破方向。传统的微生物鉴定方法分为培养和非培养两类，临床公认的“金 标准”是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高， 并且不是每种病原体都可以培养。不依赖培养的方法比如涂片镜检、 抗体抗原免疫等，在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强， 但在敏感性和特异性上存在较明显的劣势，

3、而且传统的微生物鉴定方 法对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。mNGS不依赖于传 统的微生物培养，也无需特异性扩增，直接对临床样本中的核酸进行 无差别、无选择性的高通量测序，然后与已知的微生物序列数据库进 行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种 类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物（包括病毒、细 菌、真菌、寄生虫）。在急危重症感染中，患者往往因为遗传性疾病、肿瘤、营养不 良、器官移植、药物等因素导致免疫缺陷，除了遭受普通感染外，尤 其容易受到机会性感染，即条件致病菌引起的感染。这类感染涉及的 微生物种类复杂，很难根据经验提前预判，常规检测方法无法覆盖。

4、相比之下，mNGS理论上可以报告所有已知基因组序列的病原体，目前 已经纳入的病原体有8000多种，其中包括3000余种细菌、4000余种 病毒、200余种真菌和140种寄生虫，除了病原体覆盖广、准确性高， mNGS还可以获取耐药突变信息和毒力基因，高覆盖度的mNGS还可以评 估病原体的药物敏感性，精准指导临床用药。凭借上述优点，mNGS逐渐开始被一些临床医生认可和尝试使用， 相关的临床指南和专家共识也对mNGS有所提及，2017年，中国利土 曼原虫感染诊断和治疗专家共识提到：“有文献报告用二代测序等 方法成功诊断骨髓穿刺与活组织检查未能发现的病例，将来有可能应 用于临床。2018年，儿童呼吸道

5、感染微生物检验标本采集转运 与检测建议（细菌篇）指出：“高通量的宏基因组测序是对感染性 疾病病原体的大规模核酸分析，可提供极为丰富的信息，对于未知病 原体的发现具有不可比拟的优势，是分子生物学诊断的研究热点。”儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检测建议（病毒篇） 提到：“二代测序技术不但在高通量方面表现出优势，而且在发现新 病原方面也有突破性进展，但目前二代测序的结果还需要验证，不能 直接用于临床诊断，且费用较高，要广泛应用尚待时日。”终末期 肝病合并感染诊治专家共识提到：“二代测序方法从组织、拭子、 抽吸物中提取DNA进行分析，可筛查鉴别多种细菌，快速获取病原学 诊断。”中国成人医院获得

6、性肺炎与呼吸机相关肺炎诊断和治疗指 南（2018版）指出：“基于测序技术的临床宏基因组学可用于快速 鉴定细菌、真菌、分枝杆菌、病毒等病原微生物及其耐药性，但技术 成本高，仅限在有条件的单位开展。” 2019年，宏基因组分析和诊 断技术在急危重症感染应用的专家共识发布。由已有发布的临床指南和专家共识可以看出，虽然在指南和专家 共识中开始对mNGS有所提及和推荐，但几乎所有的指南和专家共识仍 然对其持比较谨慎的态度，对其目前结果的验证、检测的成本和开展 的条件等方面都给出了尚不成熟的提示。mNGS作为二代测序成本快速 降低而兴起的一门全新领域，若用于体外诊断试剂的研发，有其优 势，但也存在很多技术

7、和法规监管中的难点，本文初步总结如下。一、mNGS在临床应用中存在的问题1、流程标准化mNGS需要对不同类型的临床样本进行预处理，操作步骤包括但不 限于：核酸提取、文库制备、纯化、定量、上机前质控等。再加上测 序反应和数据分析，整体流程复杂、耗时长，自动化程度低。大多数文库制备方法包含PCR扩增步骤，有可能产生气溶胶污染，在实际临 床取样、运输、样本处理、上机测序等环节中都有可能受到环境、容 器、试剂中的微生物核酸污染。因此实验室在防止污染和质量控制上 需要建立一系列标准化SOP。2、检测准确性mNGS可以覆盖8000种以上病原体，检测灵敏度很高。但这是把双 刃剑，一方面有可能受到环境、容器、

8、试剂中的微生物核酸污染；另 一方面，人体含有定植性的微生物（不同个体、不同样本类型，定植 微生物的种类和丰度有较大差异）。这些因素都会导致mNGS结果中含 有大量非致病性微生物，而真实的病原体则隐藏在定植和背景微生物 中。因此，如何结合样本类型、实验对照和临床信息来准确判断病原 体，是必须攻克的难题。对于mNGS的检测报告，检测机构应尽可能提 供检测列表，而不是做出判断，由临床医生结合检测结果和临床病史 做出判断。3、胞内菌/真菌检出率低对于胞内感染菌因释放到体液中含量较少而导致检测敏感性偏 低，对具有较厚细胞壁的病原微生物如真菌感染，由于核酸提取效率 较低，导致临床检出率和敏感性较低。因此即

9、使在检测报告中某种胞 内菌/厚壁菌检出序列数不高，也要考虑其为致病病原体的可能。mNGS 信息量大，不可能在报告中列举出所有检测到的病原体，对于罕见病 原体、胞内菌等，可能因检出序列数少、微生物丰度低，在报告中未 能列举，如果临床有疑似特殊病原体的感染，应该可以追溯原始数据库进行查询。4、检测DNA还是DNA+RNA一些病毒的基因组为RNA,用DNA建库的方法不能检出。同时， RNA丰度与基因转录活跃程度正相关，检测RNA可以识别死菌和活菌， 区分现行和既往感染。因此，DNA+RNA测序与DNA测序相比具有多重优 势，但人源RNA比DNA有更高的丰度和复杂度，且RNA易降解，对样 本运输和保存

10、有更高的要求。如何稳定有效地实现DNA和RNA同时检 测，是提升mNGS临床检出率和准确性的保障之一。5、灵敏度和经济成本的矛盾人体不同的样本类型单位体积含有的细胞数量有巨大的差异，最 终的测序数据山微生物序列和人源基因组序列组成，不同数量的人体 细胞数、病原微生物感染的类型和感染量的高低都会影响测序数据中 目标微生物序列占比，大量的人体背景细胞（如全血样本）以及很多 病原体感染后含量很低，包括用药后取样导致的病原数量降低，都会 导致限定数据量中靶病原信息太少而丢失。单纯扩大数据量，提高检 测深度是最简单的办法，但同时会带来检测成本的大幅度上升，如何 平衡临床灵敏度的需求和检测成本的迅速增加，

11、可能是mNGS面临的最 大挑战。6、耐药检测目前使用mNGS进行药敏检测还存在一定的困难，一是目前报道的 耐药基因型与耐药表型的关联程度还存在一些差距；二是如果要应用 mNGS对临床样本进行耐药相关基因的分析，那将需要极高的测序深 度，成本将数千倍地上升，因此，当前的mNGS尚不能完全指导耐药菌 抗感染药物的选择。7、应用的场景目前微生物检验室对于微生物的鉴定有一套成熟的检验流程， mNGS作为一种全新的检测手段，如何在当前微生物检验流程中找到适 合的切入点，如何科学地设计产品、合理地选择预期人群并在在正确 的时机开展检测，找到适合的应用场景是mNGS作为一种实验室新兴技 术向产业化转变的关键

12、。二、监管及审评重点mNGS作为一项优势明显的技术，向产业化转变是必然的趋势，在 医疗器械监管的过程中，尤其是体外诊断试剂审评过程中，以下一些 方面应该重点考虑。1、规范临床适应人群及临床适应症。根据目前的临床经验、研究 结果和mNGS技术的优势，mNGS的临床适应人群应以急危重症感染患者 为主，其主要适应症包括：病情危重需要尽快明确病原体；特殊 病人如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者需要 尽快明确病原体；传统微生物检测技术反复阴性且治疗效果不佳； 疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性；疑似特殊病 原体感染；长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染。2、应结合患

13、者负担和收益比，重点对产品的临床意义进行审评。3、mNGS可以早期发现病原体，指导抗菌药物的精准选择，减少抗 菌药物的使用，降低患者的病死率，但尚需要大样本的研究证实，因 此，mNGS的产品在临床试验阶段应根据其产品设计，选择预期用途的 适用人群进行足够样本量的验证。同时，由于mNGS产品临床可能的适 应人群的特殊性和罕见性，在入组足够数量的人群时可能会存在较大 的困难，这一点可能将是以后临床审评中的难点。4、对于严重感染、生命体征不稳定的患者，由mNGS获得致病病 原体后，针对病原体进行精准治疗，治疗后应密切随访患者的临床表 现和治疗效果，因此应有部分的随访数据。5、病原特征数据库与算法要有

14、系统研发，在审评中对算法的审评 应结合数据库一起作为审评的重点环节，不能简单认为把公共数据库 中的微生物纳入越多越好。目前山于该类产品的转化仍存在一定的难度，尚无体外诊断类产 品申报。参考文献：1 Charles Y. Chiu and Steven A. Miller Clinicalmetagenomics Nature Reviews Genetics 2019,20, 341-355.2张翠云，柴舟，杨芳急诊科患者医院感染的易感因素及病原菌分 析.中华医院感染学杂志,2014, 24(2): 380-382.3张文宏等中国利士曼原虫感染诊断和治疗专家共识中华传染病 杂志 2017, 3

15、5(9) :513-518 .4张海邻，陈小芳等儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与 检测建议(病毒篇)中国实用儿科杂志2018, 33(9):657-662.5林立，刘彩霞等儿童呼吸道感染微生物检验标本采集转运与检 测建议(细菌篇)中国实用儿科杂志2018, 33(9):663-669.6宁琴，王贵强等终末期肝病合并感染诊治专家共识临床肝胆病 杂志 2018, 34(9) : 1862-1872.7瞿介明等中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治 疗指南(2018版)中华结核和呼吸杂志2018年第四期.8宋振举等宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共 识 中华急诊医学杂志2019, 28(2):151-155.9周永召，李亚伦，范红等临床宏基因组学在呼吸感染性疾病精准 诊疗中的疑问解析中国呼吸与危重监护杂志2018,17(6):539-543.10周睨，艾静文，崔鹏等二代测序技术对活动性结核病患者的诊 断价值 中国防痍杂志2018, 40(2):153-156.临床与生物统计二部胡鹏供稿