第十章-基因工程菌发酵ppt课件.ppt

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1、第十章第十章 基因工程菌的发酵基因工程菌的发酵 基因工程是指在基因水平上，采基因工程是指在基因水平上，采基因工程是指在基因水平上，采基因工程是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，用与工程设计十分类似的方法，用与工程设计十分类似的方法，用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外根据人们的意愿，主要是在体外根据人们的意愿，主要是在体外根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，进行基因切割、拼接和重新组合，进行基因切割、拼接和重新组合，进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所再转入生物体内，产生出人们所再转入生物体内，产生出人们所再转入生物体

2、内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的期望的产物，或创造出具有新的期望的产物，或创造出具有新的期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之遗传特征的生物类型，并能使之遗传特征的生物类型，并能使之遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。稳定地遗传给后代。稳定地遗传给后代。稳定地遗传给后代。基因工程基因工程基因工程基因工程 基因工程的核心技术是基因工程的核心技术是基因工程的核心技术是基因工程的核心技术是DNADNADNADNA的重组技术。的重组技术。的重组技术。的重组技术。除除除除DNADNADNADNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表重组技术外，基因工程还应包括基因的

3、表重组技术外，基因工程还应包括基因的表重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。l l基因工程一般分为基因工程一般分为基因工程一般分为基因工程一般分为4 4 4 4个步骤：个步骤：个步骤：个步骤：取得符合人们要求的取得符合人们要求的取得符合人们要求的取得符合人们要求的DNADNADNADNA片片片片段，这种段，这种段，这种段，这种DNADNADNADNA片段被称为片段被称为片段被称为片段被称为“目的基因目的基因目的基因目的基因”；将目

4、的基因与质粒或病毒将目的基因与质粒或病毒将目的基因与质粒或病毒将目的基因与质粒或病毒DNADNADNADNA连接成重组连接成重组连接成重组连接成重组DNADNADNADNA；把重组把重组把重组把重组DNADNADNADNA引人某种细胞；引人某种细胞；引人某种细胞；引人某种细胞；把目的基因能表达的受体细胞把目的基因能表达的受体细胞把目的基因能表达的受体细胞把目的基因能表达的受体细胞挑选出来挑选出来挑选出来挑选出来。工程菌的获得工程菌的获得工程菌的获得工程菌的获得l l确定目的产物，找出产该产物的细胞。确定目的产物，找出产该产物的细胞。确定目的产物，找出产该产物的细胞。确定目的产物，找出产该产物的

5、细胞。l l将细胞破碎后提纯出全部信使将细胞破碎后提纯出全部信使将细胞破碎后提纯出全部信使将细胞破碎后提纯出全部信使RNARNARNARNA。这些信使中包含了该这些信使中包含了该这些信使中包含了该这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。l l利用基因扩增技术（利用基因扩增技术（利用基因扩增技术（利用基因扩增技术（PCRPCRPCRPCR），），），），找出所需的目的基因。找出所需的目的基因。找出所需的目的基因。找出所需的目的基因。l l将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组将

6、目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNADNADNADNA分分分分子。子。子。子。l l将重组后将重组后将重组后将重组后DNADNADNADNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的

7、基因的重组基因的重组基因的重组基因的重组(工程工程工程工程)菌。菌。菌。菌。工程菌具备的条件工程菌具备的条件工程菌具备的条件工程菌具备的条件l l发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。菌株。菌株。菌株。l l菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。l l菌株不是致病株，也不产内毒素。菌株不是致病株，也不产内毒素

8、。菌株不是致病株，也不产内毒素。菌株不是致病株，也不产内毒素。l l代谢控制容易进行。代谢控制容易进行。代谢控制容易进行。代谢控制容易进行。l l能进行适当的能进行适当的能进行适当的能进行适当的DNADNADNADNA重组，并且稳定，重组的重组，并且稳定，重组的重组，并且稳定，重组的重组，并且稳定，重组的DNADNADNADNA不易脱不易脱不易脱不易脱落。落。落。落。l基因工程菌发酵动力学基因工程菌发酵动力学l基因工程菌发酵设备基因工程菌发酵设备l基因工程菌的高密度发酵和控制基因工程菌的高密度发酵和控制l基因工程菌发酵的后处理技术基因工程菌发酵的后处理技术l基因工程菌的不稳定性及对策基因工程菌

9、的不稳定性及对策l应用案例与分析应用案例与分析基因工程菌发酵动力学基因工程菌发酵动力学l基因工程菌发酵动力学模型分类基因工程菌发酵动力学模型分类l基因工程菌培养过程的动力学模型基因工程菌培养过程的动力学模型理想情况：把理想情况：把细胞群体处理细胞群体处理为一种溶质为一种溶质不考虑细胞不考虑细胞结构，但各结构，但各种细胞均种细胞均一细胞之间不均一细胞之间不均一细胞内部多组分细胞内部多组分细胞之间无差异细胞之间无差异细胞内部多组分细胞内部多组分均衡生长均衡生长均衡生长均衡生长非结构模型非结构模型结构模型结构模型平均细胞近似平均细胞近似平均细胞近似平均细胞近似非非离离散散模模型型离离散散模模型型 非

10、离散、非结构模型（均衡生长模型）非离散、非结构模型（均衡生长模型）非离散、非结构模型（均衡生长模型）非离散、非结构模型（均衡生长模型）l l假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组成及代谢特性的差异成及代谢特性的差异成及代谢特性的差异成及代谢特性的差异l l适于研究细胞群体代谢生长代谢规律适于研究细胞群体代谢生长代谢规律适于研究细胞群体代谢生长代谢规律适于研究细胞群体代谢生长代谢规律离散非结构模型离散非结构模型离散非结构模型离散非结构模

11、型l l培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统是适合的。是适合的。是适合的。是适合的。结构非离散模型结构非离散模型结构非离散模型结构非离散模型l l细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相细胞被分散成多个不同功能的部分，各

12、部分相互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。离散结构模型离散结构模型离散结构模型离散结构模型l l细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组合建立高层次的离散结构模型合建立高层次的离散结构模型合建立高层次的离

13、散结构模型合建立高层次的离散结构模型1 1 1 1 基因工程菌基因工程菌基因工程菌基因工程菌 细胞细胞细胞细胞 的生长动力学模型的生长动力学模型的生长动力学模型的生长动力学模型l l以对数生长期为例以对数生长期为例以对数生长期为例以对数生长期为例,处于该时期的微生物生长的数学处于该时期的微生物生长的数学处于该时期的微生物生长的数学处于该时期的微生物生长的数学模型如下：模型如下：模型如下：模型如下：l l其中其中其中其中 为细胞数量为细胞数量为细胞数量为细胞数量 为培养时间为培养时间为培养时间为培养时间 拜为比生长速率拜为比生长速率拜为比生长速率拜为比生长速率10.1.2 基因工程菌培养过程中的

14、动力学模型基因工程菌培养过程中的动力学模型由上式可以推导出由上式可以推导出由上式可以推导出由上式可以推导出l l可用以推算在间歇发酵中可用以推算在间歇发酵中可用以推算在间歇发酵中可用以推算在间歇发酵中f f f f 值随世代数值随世代数值随世代数值随世代数n n n n的变化情况的变化情况的变化情况的变化情况,这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数这在基因工程菌株的发酵中是非常重要的参数,例如例如例如例如,假设从斜面培养到假设从斜面培养到假设从斜面培养到假设从斜面培养到33000L33000L33000L3300

15、0L发酵培养需要发酵培养需要发酵培养需要发酵培养需要25252525代时间代时间代时间代时间,25,25,25,25代代代代后含质粒细胞还占多少后含质粒细胞还占多少后含质粒细胞还占多少后含质粒细胞还占多少,即即即即f f f f25252525为多少就是一个必需考为多少就是一个必需考为多少就是一个必需考为多少就是一个必需考虑到的问题。分析结果表明虑到的问题。分析结果表明虑到的问题。分析结果表明虑到的问题。分析结果表明f f f f值随值随值随值随p p p p和和和和 的增大而减小。的增大而减小。的增大而减小。的增大而减小。2 外源基因的表达和控制机制外源基因的表达和控制机制外源基因的表达和控

16、制机制外源基因的表达和控制机制 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。可采用可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。1）可诱导性启动子 在在构建构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：表达载体时，可使用可诱导性的启动子，

17、如：laclac、trptrp、P PL L等等 在在用用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高效表达。阻遏（诱导）使质粒高效表达。例如：例如：利用利用3-3-吲哚乙酸可使吲哚乙酸可使trptrp启动子去阻遏启动子去阻遏2 2）温度敏感型质粒）温度敏感型质粒 一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增当温度升高到一定值时质粒大量扩增 脱缰质粒（r

18、unaway plasmid）如：如：pKN410pKN410在在3030时的拷贝数为时的拷贝数为202050/50/E.coliE.coli细胞；在细胞；在3535时质粒大量复制。时质粒大量复制。将将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增400400倍。倍。l l质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环境等密切相关境等密切相关境等密切相关境等密切相关l l工程菌培养过程中会发现工程菌培养过程中会发现工程菌培养过程中会发现工程菌培养过程中会

19、发现质粒丢失质粒丢失质粒丢失质粒丢失现象，现象，现象，现象，严重影响外源基因产物的产量和质量严重影响外源基因产物的产量和质量严重影响外源基因产物的产量和质量严重影响外源基因产物的产量和质量3 3 质粒的行为规律质粒的行为规律 原原 因因分配的不稳定性分配的不稳定性结构不稳定性结构不稳定性质粒不同拷贝状态质粒不同拷贝状态质粒不同拷贝状态质粒不同拷贝状态l l分配不稳定：分配不稳定：分配不稳定：分配不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质这是由于在细胞分裂过程中质这是由于在细胞分裂过程中质这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。粒缺失分配

20、到子细胞中而导致整个质粒丢失。粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。l l结构性不稳定：结构性不稳定：结构性不稳定：结构性不稳定：由于重组质粒由于重组质粒由于重组质粒由于重组质粒DNADNADNADNA发生缺失、发生缺失、发生缺失、发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。插入或重排引起的质粒结构变化。插入或重排引起的质粒结构变化。插入或重排引起的质粒结构变化。质粒保持率质粒保持率质粒保持率质粒保持率 l l为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率F F F Fn n n n的概念，的概念，

21、的概念，的概念，FnFnFnFn表示分批培养中细胞分裂表示分批培养中细胞分裂表示分批培养中细胞分裂表示分批培养中细胞分裂n n n n次后，培养液中基因次后，培养液中基因次后，培养液中基因次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即工程细胞数与总细胞数的比值，即工程细胞数与总细胞数的比值，即工程细胞数与总细胞数的比值，即 表达效率及质粒拷贝数控制表达效率及质粒拷贝数控制表达效率及质粒拷贝数控制表达效率及质粒拷贝数控制 l l在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质在工程菌培养过程中

22、，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，粒稳定基础上，粒稳定基础上，粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数应尽可能提高细胞内质粒拷贝数应尽可能提高细胞内质粒拷贝数应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。l l在工业生产中易于操作的在工业生产中易于操作的在工业生产中易于操作的在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用方法是在培养的不同阶段，采用方法是在培养的不同阶段，采用方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的不同培养温度达到提高拷贝数目的不同培养温度达到提高拷贝数目的不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低，在前培养阶段采用低，在前培养阶段采用低，在前培养阶

23、段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。产量提高。产量提高。产量提高。质粒行为动力学模型的建立意义质粒行为动力学模型的建立意义质粒行为动力学模型的建立意义质粒行为动力学模型的建立意义控控制制质质粒粒的的稳稳定定性性确确定定

24、质质粒粒的的复复制制速速率率表表达达产产物物合合成成条条件件10.2 10.2 基因工程菌发酵设备基因工程菌发酵设备l l机械搅拌发酵罐机械搅拌发酵罐机械搅拌发酵罐机械搅拌发酵罐l l气升式发酵罐气升式发酵罐气升式发酵罐气升式发酵罐l l利用机械搅拌作用，使空气利用机械搅拌作用，使空气利用机械搅拌作用，使空气利用机械搅拌作用，使空气和搅拌液充分混合，促进氧和搅拌液充分混合，促进氧和搅拌液充分混合，促进氧和搅拌液充分混合，促进氧的溶解和传递，满足微生物的溶解和传递，满足微生物的溶解和传递，满足微生物的溶解和传递，满足微生物生长代谢对溶氧的需求生长代谢对溶氧的需求生长代谢对溶氧的需求生长代谢对溶氧

25、的需求l l原理：原理：原理：原理：无菌压缩空气作为液体的提升无菌压缩空气作为液体的提升无菌压缩空气作为液体的提升无菌压缩空气作为液体的提升力，使发酵液上下翻动实现混合和传力，使发酵液上下翻动实现混合和传力，使发酵液上下翻动实现混合和传力，使发酵液上下翻动实现混合和传质传热过程。质传热过程。质传热过程。质传热过程。l l优点：优点：优点：优点：无机械搅拌机构最大限度的减无机械搅拌机构最大限度的减无机械搅拌机构最大限度的减无机械搅拌机构最大限度的减少了染菌率，减少了机械剪切力，对少了染菌率，减少了机械剪切力，对少了染菌率，减少了机械剪切力，对少了染菌率，减少了机械剪切力，对长菌丝的各种真菌尤为适

26、宜长菌丝的各种真菌尤为适宜长菌丝的各种真菌尤为适宜长菌丝的各种真菌尤为适宜 气体提升充分的气液混合使氧气气体提升充分的气液混合使氧气气体提升充分的气液混合使氧气气体提升充分的气液混合使氧气的传递利用极大提高，特别适合高粘的传递利用极大提高，特别适合高粘的传递利用极大提高，特别适合高粘的传递利用极大提高，特别适合高粘度培养基和对于溶氧要求高的产品。度培养基和对于溶氧要求高的产品。度培养基和对于溶氧要求高的产品。度培养基和对于溶氧要求高的产品。内内循环循环发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角罐体表面光

27、滑易清洗，灭菌时没有死角与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留所有的连接接口均要用密封圈封闭，不留“死腔死腔”，不得有泄漏，不得有泄漏搅拌器转速和通气应适当搅拌器转速和通气应适当空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料培养液要经化学处理或热处理后才可排放培养液要经化学处理或热处理后才可排放发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。轴封可采用磁力搅拌或双端面密封轴封可采用磁力搅拌或双端面密封基因工程菌的培养设备

28、基因工程菌的培养设备 10.3 10.3 工程菌的高密度培养工程菌的高密度培养1、高密度培养（High cell-density culture;HCDC）一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养培养1010倍以上时的生长状态或培养技术。倍以上时的生长状态或培养技术。基因工程菌广泛采用高密度培养技术基因工程菌广泛采用高密度培养技术2 2、限制高密度的主要因素、限制高密度的主要因素1 1）营养成分）营养成分2 2）抑制与阻遏）抑制与阻遏3 3）溶氧水平）溶氧水平4 4）有毒代谢物）有毒代谢物3 3、基因工程菌的高密度发酵和控制基因工程菌的高密度

29、发酵和控制l l培养基的选择培养基的选择培养基的选择培养基的选择l l培养方式的选择培养方式的选择培养方式的选择培养方式的选择l l溶解氧的控制溶解氧的控制溶解氧的控制溶解氧的控制l l温度的影响及控制温度的影响及控制温度的影响及控制温度的影响及控制l lPH PH PH PH 的影响及控制的影响及控制的影响及控制的影响及控制l l基因工程菌的发酵工艺中菌体的增殖和产物的表达均基因工程菌的发酵工艺中菌体的增殖和产物的表达均基因工程菌的发酵工艺中菌体的增殖和产物的表达均基因工程菌的发酵工艺中菌体的增殖和产物的表达均在对数期完成在对数期完成在对数期完成在对数期完成l l改进：延长对数期的生长时间、

30、缩短衰亡时间改进：延长对数期的生长时间、缩短衰亡时间改进：延长对数期的生长时间、缩短衰亡时间改进：延长对数期的生长时间、缩短衰亡时间高密度发酵工艺高密度发酵工艺（1 1 1 1）培养基的选择）培养基的选择）培养基的选择）培养基的选择l l发酵特点：发酵特点：发酵特点：发酵特点：工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度迅速升高迅速升高迅速升高迅速升高l l培养基影响：培养基影响：培养基影响：培养基影响：高浓度的碳源、氮源和无机盐造成溶液的渗透压过高，高浓度的碳源、氮源和无机盐造成溶液的

31、渗透压过高，高浓度的碳源、氮源和无机盐造成溶液的渗透压过高，高浓度的碳源、氮源和无机盐造成溶液的渗透压过高，导致细胞脱水，抑制菌体生长，目的产物得率下降导致细胞脱水，抑制菌体生长，目的产物得率下降导致细胞脱水，抑制菌体生长，目的产物得率下降导致细胞脱水，抑制菌体生长，目的产物得率下降 大量产生乙醇，抑制菌体浓度的进一步升高大量产生乙醇，抑制菌体浓度的进一步升高大量产生乙醇，抑制菌体浓度的进一步升高大量产生乙醇，抑制菌体浓度的进一步升高 多采用分批补料培养，各种培养基浓度低于抑制浓度多采用分批补料培养，各种培养基浓度低于抑制浓度多采用分批补料培养，各种培养基浓度低于抑制浓度多采用分批补料培养，各

32、种培养基浓度低于抑制浓度l l成分的选择成分的选择成分的选择成分的选择 选择容易被工程菌利用的营养物质选择容易被工程菌利用的营养物质选择容易被工程菌利用的营养物质选择容易被工程菌利用的营养物质l l浓度的选择浓度的选择浓度的选择浓度的选择 浓度比普通培养基高浓度比普通培养基高浓度比普通培养基高浓度比普通培养基高2-32-32-32-3倍，但不能太高，会使倍，但不能太高，会使倍，但不能太高，会使倍，但不能太高，会使发酵液渗透压增加，不利于工程菌的生长发酵液渗透压增加，不利于工程菌的生长发酵液渗透压增加，不利于工程菌的生长发酵液渗透压增加，不利于工程菌的生长基因工程菌发酵的基本操作方式有：基因工程

33、菌发酵的基本操作方式有：分批培养分批培养 分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限 半连续培养（补料分批）半连续培养（补料分批）在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物生长，或得到更多的代谢产物 连续培养连续培养 不断地流加营养，并不断地取出发酵液。不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。透析培养透析培养 固定化培养固定化培养(2)(2)基因工程

34、菌培养方式基因工程菌培养方式补料分批培养方式的选择补料分批培养方式的选择补料分批补料分批培养方法培养方法葡萄糖浓葡萄糖浓度反馈控度反馈控制流加制流加恒速流加恒速流加指数流加指数流加发酵-透析藕合技术：将发酵液将发酵液用透析膜与透析液隔开用透析膜与透析液隔开，随着培养的进行，随着培养的进行，菌体形成的小分子代谢产物通过透析膜进入透析液，从菌体形成的小分子代谢产物通过透析膜进入透析液，从而降低了在发酵液中的浓度，有利于解除产物抑制。而降低了在发酵液中的浓度，有利于解除产物抑制。如果在透析液中加入营养物质，则营养物质可反方向如果在透析液中加入营养物质，则营养物质可反方向进入发酵液，供菌体利用（起到补

35、料作用）。进入发酵液，供菌体利用（起到补料作用）。发酵罐透析罐透析膜发酵与透析藕合固定化培养固定化培养固定化培养是通过化学或物理方法，将游离细胞或酶固定固定化培养是通过化学或物理方法，将游离细胞或酶固定于限定的空间区域内，使其保持活性并可以反复利用，具于限定的空间区域内，使其保持活性并可以反复利用，具有菌体密度高反应速度快发酵周期短产物分离简单反应过有菌体密度高反应速度快发酵周期短产物分离简单反应过程控制容易菌体可重复连续使用和增加发酵过程中重组质程控制容易菌体可重复连续使用和增加发酵过程中重组质粒稳定性的优点粒稳定性的优点.基因工程菌的培养方式基因工程菌的培养方式 与固定化酶的制备方法大体相

36、同；与固定化酶的制备方法大体相同；常用的有常用的有吸附法吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多孔包埋法、共价结合法、交联法、多孔物质包络法、超过滤法物质包络法、超过滤法等，其中包埋法最为普遍。等，其中包埋法最为普遍。（3 3 3 3）溶解氧的控制）溶解氧的控制）溶解氧的控制）溶解氧的控制l l基因工程菌发酵过程中，溶氧浓度基因工程菌发酵过程中，溶氧浓度基因工程菌发酵过程中，溶氧浓度基因工程菌发酵过程中，溶氧浓度()()的高低影响菌的高低影响菌的高低影响菌的高低影响菌体生长乙酸生成和外源质粒丢失，从而对外源蛋白体生长乙酸生成和外源质粒丢失，从而对外源蛋白体生长乙酸生成和外源质粒丢失，从而对外源蛋

37、白体生长乙酸生成和外源质粒丢失，从而对外源蛋白的产量产生影响。的产量产生影响。的产量产生影响。的产量产生影响。l l措施：措施：措施：措施：增大搅拌转速和空气流量增大搅拌转速和空气流量增大搅拌转速和空气流量增大搅拌转速和空气流量l l方法：方法：方法：方法：提高通气中氧的分压提高通气中氧的分压提高通气中氧的分压提高通气中氧的分压 在菌体中克隆具有提高氧传质能力在菌体中克隆具有提高氧传质能力在菌体中克隆具有提高氧传质能力在菌体中克隆具有提高氧传质能力VHbVHb蛋白蛋白蛋白蛋白（4 4 4 4）温度的影响及控制）温度的影响及控制）温度的影响及控制）温度的影响及控制l l温度对工程菌发酵的影响体现

38、在多个方面，如影温度对工程菌发酵的影响体现在多个方面，如影温度对工程菌发酵的影响体现在多个方面，如影温度对工程菌发酵的影响体现在多个方面，如影响发酵基质的理化性质，工程菌的生长及代谢调响发酵基质的理化性质，工程菌的生长及代谢调响发酵基质的理化性质，工程菌的生长及代谢调响发酵基质的理化性质，工程菌的生长及代谢调控，目标产物的生成等控，目标产物的生成等控，目标产物的生成等控，目标产物的生成等 一般情况下，工程菌菌体一般情况下，工程菌菌体一般情况下，工程菌菌体一般情况下，工程菌菌体生长最适温度较高，而外源蛋白表达温度要低，生长最适温度较高，而外源蛋白表达温度要低，生长最适温度较高，而外源蛋白表达温度

39、要低，生长最适温度较高，而外源蛋白表达温度要低，l l因此工程菌发酵分为菌体生长阶段和外源基因蛋因此工程菌发酵分为菌体生长阶段和外源基因蛋因此工程菌发酵分为菌体生长阶段和外源基因蛋因此工程菌发酵分为菌体生长阶段和外源基因蛋白表达阶段白表达阶段白表达阶段白表达阶段（5 5 5 5）PH PH PH PH 的影响及控制的影响及控制的影响及控制的影响及控制l l发发发发酵酵酵酵过过过过程程程程中中中中，菌菌菌菌体体体体代代代代谢谢谢谢 产产产产 生生生生 COCOCOCO2 2 2 2 乙乙乙乙 酸酸酸酸乳乳乳乳 酸酸酸酸 等等等等产产产产物物物物不不不不断断断断积积积积累累累累，引引引引起起起起发

40、发发发酵酵酵酵基基基基质质质质pHpHpHpH值值值值的的的的改改改改变变变变.pH.pH.pH.pH值值值值的的的的变变变变化化化化，影影影影响响响响菌菌菌菌体体体体内内内内H HH H或或或或OHOHOHOH-离离离离子子子子的的的的浓浓浓浓度度度度，进进进进而而而而影影影影响响响响酶酶酶酶蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的解解解解离离离离度度度度，引引引引起起起起酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性改改改改变变变变，因因因因此此此此对对对对菌菌菌菌体体体体生生生生长长长长目目目目标标标标蛋蛋蛋蛋白表达和活性等具有非常明显的影响白表达和活性等具有非常明显的影响白表达和活性等具有非常明显的影响白表达和活性

41、等具有非常明显的影响l l菌体生长和产物合成的菌体生长和产物合成的菌体生长和产物合成的菌体生长和产物合成的PHPHPHPH控制在控制在控制在控制在6.8-7.66.8-7.66.8-7.66.8-7.6l l较高的较高的较高的较高的PHPHPHPH对产物的产量有促进作用对产物的产量有促进作用对产物的产量有促进作用对产物的产量有促进作用基因工程菌发酵的后处理技术基因工程菌发酵的后处理技术l l细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎l l蛋白质的浓缩与分离纯化蛋白质的浓缩与分离纯化蛋白质的浓缩与分离纯化蛋白质的浓缩与分离纯化l l核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的分离纯化核酸的分离纯化 酚酚酚酚/氯仿抽

42、提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。抑制作用。抑制作用。抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时具有去除植物色素和蔗糖的作用。中的酚，同时具有去除植物色素和蔗糖的作用。中的酚，同时具有去除植物色素和蔗糖的作用。中的酚，同时具

43、有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚在酚在酚在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇=25=25=25=25：24242424：1 1 1 1）。）。）。）。1 1 1 1）使用注意）使用注意）使用注意）使用注意 酚通常是

44、透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。酸的磷酸二酯键。酸的磷酸

45、二酯键。酸的磷酸二酯键。2 2 2 2）安全操作）安全操作）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。套。套。套。使用酚时应注意使用酚时应注意10.5 10.5 基因工程菌的不稳定性及对策基因工程菌的不稳定性及对策l l不稳定的表现不稳定的表现不稳定的表现不稳定的表现l l不稳定的原因及对策不稳定的原因及对策不稳定的原因及对策不稳定的原因及对策l l质粒不稳定性质粒不稳定性l l表达产物的不稳定性表达产物的不稳定性1 1 质粒不稳

46、定的表现质粒不稳定的表现l l基因工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物基因工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物基因工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物基因工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定的不稳定的不稳定的不稳定 个方面。具体表现为下列个方面。具体表现为下列个方面。具体表现为下列个方面。具体表现为下列 种形式：种形式：种形式：种形式：质粒的丢质粒的丢质粒的丢质粒的丢失，重组质粒发生、片段脱落，表达产物不稳定失，重组质粒发生、片段脱落，表达产物不稳定失，重组质粒发生、片段脱落，表达产物不稳定失，重组质粒发生、片段脱落，表达产物不稳定。l l质粒的丢失：质粒的丢失

47、：质粒的丢失：质粒的丢失：由于某种环境因素或生理、遗传学上的由于某种环境因素或生理、遗传学上的由于某种环境因素或生理、遗传学上的由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因原因原因原因,质粒从某些宿主细胞中丢失质粒从某些宿主细胞中丢失质粒从某些宿主细胞中丢失质粒从某些宿主细胞中丢失,因此工程菌的发酵过因此工程菌的发酵过因此工程菌的发酵过因此工程菌的发酵过程实际上是程实际上是程实际上是程实际上是 种菌的混合。种菌的混合。种菌的混合。种菌的混合。l l重组质粒发生、片段脱落：重组质粒发生、片段脱落：重组质粒发生、片段脱落：重组质粒发生、片段脱落：有时质粒不稳定并非由于有时质粒不稳定并非由于有时质粒不稳定

48、并非由于有时质粒不稳定并非由于质粒丢失质粒丢失质粒丢失质粒丢失,而是重组质粒上一部分片段脱落而是重组质粒上一部分片段脱落而是重组质粒上一部分片段脱落而是重组质粒上一部分片段脱落,表现为质粒表现为质粒表现为质粒表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。l l产物不稳定产物不稳定产物不稳定产物不稳定也是一个很重要的问题。也是一个很重要的问题。也是一个很重要的问题。也是一个很重要的问题。2 2 质粒不稳定的原因质粒不稳定的原因l l重组质粒引入宿主后重组质粒引入宿主后重组质粒引入宿主后重组

49、质粒引入宿主后,引起宿主细胞和重组质粒之间的引起宿主细胞和重组质粒之间的引起宿主细胞和重组质粒之间的引起宿主细胞和重组质粒之间的相互作用相互作用相互作用相互作用,在一定的环境中在一定的环境中在一定的环境中在一定的环境中,其结果是在重组质粒上表达其结果是在重组质粒上表达其结果是在重组质粒上表达其结果是在重组质粒上表达或不表达或不表达或不表达或不表达,重组质粒遗传稳定或不稳定。重组质粒遗传稳定或不稳定。重组质粒遗传稳定或不稳定。重组质粒遗传稳定或不稳定。因此一个组建因此一个组建因此一个组建因此一个组建成的工程菌的稳定与否成的工程菌的稳定与否成的工程菌的稳定与否成的工程菌的稳定与否,取决于重组质粒本

50、身的分子组取决于重组质粒本身的分子组取决于重组质粒本身的分子组取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件个方面成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件个方面成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件个方面成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件个方面l l就质粒本身的分子结构而言就质粒本身的分子结构而言就质粒本身的分子结构而言就质粒本身的分子结构而言,引起工程菌不稳定常常是引起工程菌不稳定常常是引起工程菌不稳定常常是引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响，如果质粒在重组过程中影响到由于稳定区受到影响，如果质粒在重组过程中影响到由于稳定区受到影响，如果质粒在重组过程中影响到由于稳定区受到影响，如