DB15∕T 1769—2019绵羊冷冻精液(内蒙古自治区).pdf

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1、ICS 07.080 B 40 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 17692019 代替蒙 DB 41787 绵羊冷冻精液 Frozen sheep semen 2019-12-05 发布 2020-01-05 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 17692019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准代替蒙 DB 41787羊冷冻精液。本标准与蒙 DB 41787羊冷冻精液相比，主要变化如下：增加了规范性引用文件(见第2章）；增加了试验方法(见第5章）；增加了判定规则(见第6章）；修改了适用对象(1987年版的引言；本版的第1

2、章第2段）；修改了规格与质量(1987年版的第2章；本版的第4章）；修改了检查方法(1987年版的第3章；本版的附录A)；删除了羊冷冻精液的制作程序和使用方法(1987年版的第2章和第4章）；删除了评定受胎效果的方法（1987年版的附录A)；删除了羊冷冻精液包装颜色和公羊品种代号（1987年版的附录B)。本标准附录A是规范性附录。本标准由内蒙古自治区畜牧工作站提出。本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本标准主要起草单位：内蒙古自治区畜牧工作站、内蒙古乐科生物技术有限公司、内蒙古赛诺种羊科技有限公司。本标准主要起草人：阿娜尔、海龙、苏雅、红海、高博、格力格桑、王

3、建国、包花拉、宁策勒木格、陈大勇、梁丽丽、孟怀德。DB15/T 17692019 1 绵羊冷冻精液 1 范围 本标准规定了绵羊冷冻精液的技术要求、检验方法、判定规则、标志、标签和随行文件等内容。本标准适用于各品种绵羊的冷冻精液产品，以下简称冻精。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB 20557 山羊冷冻精液 GB/T 30396 牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输 3 技术要求

4、3.1 种公羊 具有种用价值公羊，体质健康，无遗传病，不允许有已发布的动物防疫法中所明确的二类疫病中的任何一种。3.2 新鲜精液 色泽乳白色或淡黄色。精子活力65%，精子密度6108个/mL。精子畸形率15%。3.3 细管冻精外观 细管无裂痕，两端封口严密，标识清晰，信息齐全。3.4 每剂量冻精解冻后 3.4.1 剂型、剂量 细管冻精：微型，0.18 mL。3.4.2 精子活力 35%（即0.35）。3.4.3 前进运动精子数 1000 万个。3.4.4 精子畸形率 20%。DB15/T 17692019 2 3.4.5 菌落数 800 个。4 检验方法 4.1 外观 用目测法,其结果应符合

5、3.3 的规定。4.2 剂量 检验按附录 A 中 A.2 规定的方法,其结果应符合 3.4.1 的规定。4.3 解冻后每剂量精液 解冻方法及精子活力、前进运动精子数、精子畸形率、细菌菌落数的检验按照 A.3A.6 规定的方法，其结果应分别符合 3.4.2、3.4.3、3.4.4、3.4.5 的规定。4.4 检验分类 4.4.5 常规检验 对冻精的单项目检验是型式检验的一部分，主要是在生产的冻精入库前和售出使用时的检验。4.4.6 型式检验 对冻精全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监督抽样检验时选定项的检验。4.5 检验项目 4.4.5 常规检验 符合3

6、.3和3.4.2的规定。4.4.6 型式检验 符合3.33.4的规定。5 判定规则 5.1 常规检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。5.2 型式检验 样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。6 标志、标签和随行文件 6.1 标志、标签 DB15/T 17692019 3 6.4.5 细管标记 细管冻精应在管壁上依次印刷以下内容，并且印制标识要清楚：生产站名、公羊品种、生产日期或批次、公羊号。种公羊的品种代号按照 GB 20557 的规定。6.4.6 内标签 在贮精管、灭菌纱布袋上标注公羊个体号、品种、细管数量。6.4.7 外标签 可参照 G

7、B/T 30396 的规定执行。6.2 随行文件 绵羊冷冻精液产品可提供的随行文件包括：种公羊系谱、检疫证明、冷冻精液检验合格证明、生产者的生产经营许可证等。DB15/T 17692019 4 A A 附 录 A（规范性附录）绵羊冷冻精液质量检验方法 A.1 导言 本附录规定了通用的绵羊冷冻精液质量检验方法，参照了 GB/T 4789.2 的相关规定。A.2 剂量检查 A.2.1 主要器材 小试管、剪刀。A.2.2 检查方法 取三支细管冻精自然解冻后剪去两端，把精液倒入一小试管内，用 1.0 mL 吸管准确吸取精液，并检测其精液量。A.2.3 计算 三支冻精的剂量平均数为样品的剂量，按式(A.

8、1)计算:3321nnnQ（A.1）式中：Q 剂量值，单位为毫升（mL）；n1 第一支样品剂量，单位为毫升（mL）；n2 第二支样品剂量，单位为毫升（mL）；n3 第三支样品剂量，单位为毫升（mL）。A.3 精子活力检查 A.3.1 器材、溶液 显微镜或显微电视装置、恒温水浴箱、5.0 mL 试管、载玻片或精液性状板、盖玻片（18 mm18 mm）、显微镜保温箱或恒温装置、细管剪、50 L 移液器。A.3.2 方法 三支细管分别直接置于 37 水浴中解冻，取解冻三支混合后精液约 50 uL 置于载玻片上加盖玻片，立即在载物台温度保持 38 的情况下用 200 倍400 倍显微镜观察活力，也可通

9、过电视显微装置在荧光屏上观察活力。每样片观察 3 个视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。DB15/T 17692019 5 A.3.3 计算 三个视野活力评价值的平均数按式(A.2)计算：3321nnnM（A.2）式中：M 精子活力；n1 第一视野活力；n2 第二视野活力；n3 第三视野活力。A.4 每剂量前进运动精子数的检查 A.4.1 主要器材 血球计数板、血色素管、1 mL 吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、3.0%氯化钠溶液。A.4.2 检查方法 细管精液用血色素管准确吸取 20 uL 解冻精液（也可使用 A.2 已检查后的样品），注入盛有 0.98

10、mL的 3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为 50 倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流人计数室，均匀充满，不允许有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或电视荧光屏上观察计数。A.4.3 计算 a）每剂量中精子数=5 个中方格中的精子数5（即计数室 25 个中方格的总精子数）10（1 mm3 内 的精子数）1 000（每毫升精液的精子数）50（细管稀释倍数）剂量值。上式可简化为：每剂量中精子数=5 个中方格精子数250 万(细管）剂量值 b）每样品观察上下两个计数室，取平均值，如两个计数室计数结果误差超过 5%，则应重检：

11、c）每剂量中呈前进运动精子数按式(A.3)计算：msc （A.3）式中：c 每剂量中前进运动精子数，单位为个；s 每剂量中精子数，单位为个；m 活力，%。A.5 精子畸形率的检查 A.5.1 器材、溶液 显微镜、载玻片、血球分类计数器、小吸管、蒸馏水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛、甲醇、甘油。所用试剂为分析纯。DB15/T 17692019 6 A.5.2 方法 A.5.2.1 溶液配制 A.5.2.1.1 磷酸盐缓冲液 磷酸二氢钠（NaHPO42H2O）0.55 g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.25 g 双蒸馏水定容至 100mL。A.5.2.1.2 中性福尔马林固

12、定液 40%甲醛 HCHO（使用前每 100 mL 甲醛用 10.0 g 碳酸镁饱和后过滤）8.0 mL 磷酸二氢钠（NaHPO42H2O)0.55 g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）2.25 g 用 0.89%氯化钠约 50.0 mL 溶解后加入 8.0 mL 中和后的甲醛，再加 0.89%氯化钠溶液定容至100.0 mL。A.5.2.1.3 姬姆萨原液 姬姆萨染料 1.0 g 甘油C3H5(OH)3 66.0 mL 甲醇（CH3OH）66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒人并放入恒温箱中保温继续溶解 4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮

13、于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果越好。A.5.2.1.4 姬姆萨染液 姬姆萨原液 2.0 mL 磷酸盐缓冲液 3.0 mL 蒸馏水 5.0 mL 现配现用。A.5.2.2 制片染色 精液解冻见 A.3,允许同时使用精子活力检查解冻的样品。A.5.2.2.1 抹片 取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈 35夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干（约 5 min)。每样品制作两个抹片。A.5.2.2.2 固定 在已风干的抹片上滴上 1.0 mL2.0 mL 中性福尔马林固定液，固定 15 min 后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干。A.5.2.2.3

14、 染色 将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色 1.5 h 后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。DB15/T 17692019 7 A.5.2.3 镜检 将制备好的抹片在显微镜（400 倍600 倍）下观察。每个抹片观察 200 个以上的精子(分左、右两个区），取两片的平均值，两片的变异系数不得大于 20%，若超过应重新制片。A.5.2.4 计算 精子畸形率按式（A.4）计算：1001sAA（A.4）式中：A 精子畸形率，%；A1 畸形精子数，单位为个；s 精子总数，单位为个。A.6 细菌数的检查 A.6.1 主要器材 培养箱

15、、超净化工作台、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、羊角匙、高压蒸汽灭菌锅（或微波炉）、培养皿、水浴箱、pH 试纸（pH 5.59.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、放大镜、蒸馏水、营养琼脂培养基。A.6.2 培养基的配制 营养琼脂培养基：按 GB/T 4789.2 规定执行。A.6.3 检查方法 灭菌平皿事先标号。细管冻精 37 水浴解冻，用酒精棉球消毒以无菌操作，一支直接注于一个灭 菌平皿内；把已凉至 50 左右的普通琼脂以无菌操作倾倒入平皿内，每皿约 15 mL,并转动平皿使精液混合均匀，同时做空白对照平皿。待琼脂凝固后翻转平皿，置 37 恒温箱内培养 48 h 取出，计数平皿内菌落数。每头公羊样品取两支做两个平皿，取平均值。A.6.4 计算 所检样品的细菌菌落数按式（A.5）计算：221nnB（A.5）式中：B 细菌数，单位为个；n1 第一平皿菌落数，单位为个；n2 第二平皿菌落数，单位为个。_