DB15∕T 1626-2019 灵芝菌种生产技术规程(内蒙古自治区).pdf

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1、ICS 65.020.01 B 30 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 16262019 灵芝菌种生产技术规程 Regulation of Strain Manufacture for Mythic Fungus 2019-04-10 发布 2019-07-10 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 16262019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本标准由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、食用菌内蒙古自治区工程研究中心。本标准

2、主要起草人：李亚娇、孙国琴、王海燕、庞杰、于传宗、高天云、潘永圣、云利俊、郭俊波、宋秀敏、李国银、陈友君。DB15/T 16262019 1 灵芝菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了制作灵芝（Ganoderma lucidum）母种、原种和栽培种有关的定义、制作技术流程要点等。本标准适用于工厂化生产企业或专业合作社生产灵芝母种、原种和栽培种。2 规范性引用文件 下列术语和定义适用于本文件。2.1 灵芝 Ganoderma lucidum 灵芝（Ganoderma lucidum），别名瑞芝、仙草，俗称“灵芝草”，隶属于担子菌纲（Basidiomycetes）、多孔菌目（Polyporale

3、s）、灵芝科（Ganodermataceae）、灵芝属（Ganoderma）。2.2 菌种 spawn 菌丝体生长在适宜基质上具结实性的菌丝培养物。分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。2.3 母种 stock culture 经组织分离、孢子分离等方式获得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管或培养皿为培养容器和使用单位，也称为一级种、试管种。2.4 原种 pre-culture spawn 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，也称为二级种。2.5 栽培种 spawn 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，也称为三级种。栽培种只能用于扩大到栽培

4、出菇袋或直接出菇，不可以再次扩大繁殖菌种。DB15/T 16262019 2 2.6 固体菌种 solid spawn 以富含木质素、纤维素和半纤维素或淀粉含量高的谷物粒等天然有机物为主要原料，添加适量的有机氮源和无机盐类，具一定水分含量的培养基培养的纯菌丝体。是传统食用菌生产使用菌种状态，也用于菌种保存。2.7 液体菌种 liquid spawn 培养基营养成份与母种相同、不加琼脂的液体培养基，通过摇瓶震荡培养或深层发酵技术快速获得的大量的纯双核菌丝体，菌丝体在液体培养基中呈絮状或球状。液体菌种可以作为原种或栽培种直接接种在固体培养袋中，不能进行菌种保存。3 菌种生产要求 3.1 人员 菌种

5、生产所需要经过专业培训、掌握滑子菇基础知识及灵芝菌种生产技术规程要求的技术人员和检验人员。3.2 环境 应选择地势高，通风良好，空气清新，水源近，排水通畅，交通便利的场所。300m之内无酿造厂、集贸市场、规模养殖的畜禽舍、垃圾和粪便堆积场，无污水、废气、废渣、烟尘和粉尘等污染源。3.3 设施 厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库、配料分装库。配套有配料室、搅拌室、装袋（瓶）室、灭菌室、冷却室、接种室、培养室（通风好，有纱窗）、菌种检测室及菌种冷藏库等各环节的设施。冷却室、接种室，培养室都要有离子净化设施。3.4 设备 生产需要粉碎机、电子秤、搅拌机、装袋（瓶）机、高压灭菌锅或常压灭菌锅、离子净

6、化器、超净工作台或接种箱、恒温培养箱、培养架、摇床、液体菌种灌（30L250L）、显微镜等设备。3.5 容器 3.5.1 母种生产容器 试管选用18mm 180mm或者20mm 200mm；培养皿选用直径7cm9cm玻璃培养皿或一次性塑料培养皿。3.5.2 原种、栽培种生产容器 3.5.2.1 固体菌种 DB15/T 16262019 3 原种采用850ml以下、瓶口直径4cm、耐126高温的透明瓶子，或采用（1217）cm（2228）cm的聚丙烯塑料袋。栽培种采用同原种要求相同的瓶子，也可采用（1517）cm（3335）cm的聚丙烯塑料袋。3.5.2.2 液体菌种 三角瓶液体菌种容器：采用1

7、50ml500ml三角瓶，带滤膜的封口膜。液体菌种罐：采用专业厂家生产的液体菌种罐。3.6 培养原料 硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、蔗糖、葡糖糖、石膏、琼脂粉等均采用分析纯。马铃薯、麦粒、谷粒、玉米粒、柠条粉、棉籽壳、木屑、玉米芯粉、豆秸粉要求无霉变。4 母种生产 4.1 生产流程 见示例图。图1 菌种生产流程示例图 4.2 培养基 以下培养基任选其一：PDA 改良培养基。豆饼粉 20g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1g、酵母粉 1g、硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉 8g10g，pH 自然；新鲜无病去皮马铃

8、薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨1.6g、酵母粉 1.6g、硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾）1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉 8g10g，pH 自然；麦粒 100g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1.5g、酵母粉 1.5g、硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉 8g10g，pH 自然；新鲜无病去皮红薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 20min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨1.6g、酵母粉 1.6g、加入硫酸镁 0.5g、磷酸二氢

9、钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉18g10g，pH 自然；PDA 培养基。新鲜无病去皮马铃薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 20min，滤液定容至 1000ml，加入硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、蔗糖 20g、琼脂粉 8g10g，pH 自然。4.3 分装和灭菌 DB15/T 16262019 4 母种培养基温度降到90即可分装至不同容器。4.3.1 试管母种制作 4.3.1.1 分装 分装培养基至试管1/4处，用棉塞或硅胶塞封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸包棉塞，橡皮筋扎紧，棉塞向上放置。棉塞应采用梳棉，不能使用脱脂棉。4.3.1.2 灭菌 121124（0.

10、11MPa0.14MPa）保持25min。4.3.1.3 冷却 灭菌完毕后自然降压，降温至（65 5）左右时取出试管，在空气清洁的室内摆斜面，斜面长度不超过试管长度的2/3，自然降温凝固后成斜面。4.3.2 培养皿母种制作 4.3.2.1 灭菌 培养基装入300ml500ml三角瓶至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后灭菌。培养皿用报纸包好，同时放入灭菌锅灭菌。在121124（0.11MPa0.14MPa）保持25min。4.3.2.2 分装 灭菌完毕后自然降压，降温至705时取出三角瓶和培养皿放入无菌超净工作台或接种箱内，将三角瓶内培养基摇匀后快速均匀倒入无菌培养皿中，培养基占培养皿高度的

11、1/31/2。迅速盖好上盖。自然降温凝固后制成平板培养基。4.4 检测 抽取3%5%的试管和培养皿，在28下培养48h，无微生物长出为灭菌合格。4.5 接种 在超净工作台或接种箱内接种，接种前用紫外灭菌灯照射30min后打开风机20min，之后用75%酒精进行表面消毒。接种的菌块3mm5mm，接种在培养皿或试管的中部。培养皿需用石腊封口膜密封。接菌过程严格执行无菌操作，接种后及时贴好标签并做好记录。4.6 培养 温度控制在2326，空气湿度在75%以下，通风避光培养。4.7 母种检查 母种接种后第3天、第7天和菌丝体长满培养基后分别逐个进行检验，挑出未活、污染和生长不良的不合格培养物，拿到准备

12、室及时进行淘汰处理。表1 灵芝母种感官要求 DB15/T 16262019 5 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的1/4，培养皿高的1/31/2 菌种外观 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌丝体特征 菌丝洁白、绒毛状、生长致密、均匀、健壮 菌丝体表面 均匀、舒展、平整 菌丝体分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，无积水、颜色均匀、无暗斑、无色素 5 原种、栽培种生产 5.1 固体菌种 5.1.1 培养基 粮食培养基。谷粒、麦粒或玉米粒 90%，柠条粉或棉籽壳、木屑、玉米芯粉、豆

13、秸粉 9%，石膏 1%，石灰 1%，水分含量（6065）%，调节 pH 至 7.07.5。组合培养基：玉米芯 39%+木屑 39%+麸皮 20%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（6065）%调节 pH 至 7.07.5；棉籽壳 80%+麦麸 18%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（6065）%调节 pH 至 7.07.5；B.3 木屑 78%+麦麸 17%+豆饼粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（6065）%调节 pH 至 7.07.5；B.4 柠条粉 78%+麦麸 17%+玉米粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（6065）%调节 pH 至7.07.5；B.5 豆秸粉 78

14、%+麦麸 17%+玉米粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（6065）%调节 pH 至7.07.5。5.1.2 装袋（瓶）培养基的多种组成按照比例称量干料搅拌均匀，边加水边混拌均匀，含水量602%。采用装袋（瓶）机或人工进行装袋（瓶），人工装袋（瓶）需用打孔器在袋口处打孔，孔直径1cm1.5cm深度为8cm12cm，无棉盖体或海绵封口。5.1.3 灭菌 培养基质装袋（瓶）后要求在3h之内使菌种袋表面温度达到100。灭菌可分为高压灭菌和常压灭菌。常压灭菌：保持100 89h。高压灭菌：组合培养基维持121123（0.11MPa0.13 MPa）2h；粮食培养基维持121123（0.11MP

15、a0.13MPa）2.5h。5.1.4 接种 DB15/T 16262019 6 原种、栽培种在超净工作台或接种箱内接种，接种前打开紫外灯照射30min，接种时用75%酒精对超净工作台或接种箱进行表面擦拭消毒。原种接种：每个原种接入2cm3cm大小母种12块；栽培种接种：每个栽培种接入原种量不得少于15g。菌种都应从容器开口处接种，不应打孔多点接种。要严格按无菌操作接种，每批接种应为单一品种，如中途换品种时采用75%酒精对超净工作台或接种箱进行表面擦拭消毒。5.1.5 培养 温度控制在2326，空气湿度在75%以下，通风避光培养。5.1.6 检验 接种后第7天、第10天和菌丝体长满袋（瓶）后，

16、逐个全面检验，挑出未活、污染和生长不良及破损的不合格菌种袋（瓶），拿到准备室及时进行淘汰处理。表2 灵芝原种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50 5）mm 菌种外观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 菌丝体白、生长旺健、整齐 培养物表面菌丝体 生长均匀、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无、允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 子实体原基 无 表3 灵芝栽培种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求

17、培养基上表面距瓶（袋）口的距离（505）mm 表 3（续）DB15/T 16262019 7 项目 要求 菌 种 外 观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 生长均匀、色泽一致、无角变、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无 杂菌菌落 无 子实体原基 允许少量、出现原基种类5%5.1.7 贮存 原种和栽培种在04下贮存，贮存期不超过50d。贮存摆放在层架或者贮存在筐内。5.2 液体菌种生产 5.2.1 培养基 以下培养基任选其一：PDA 改良培养基。豆饼粉 20g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1g、酵母粉 1g、硫酸镁 0.

18、5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g，pH 自然；新鲜无病去皮马铃薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨1.6g、酵母粉 1.6g、硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾）1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g，pH 自然；麦粒 100g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1.5g、酵母粉 1.5g、硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g，pH 自然；新鲜无病去皮红薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 20min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨1.6g、酵母粉

19、 1.6g、加入硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g，pH 自然；PDA 培养基。新鲜无病去皮马铃薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 20min，滤液定容至 1000ml，加入硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、蔗糖 20g，pH 自然。5.2.2 三角瓶液体菌种生产 5.2.2.1 装瓶 采用150ml500ml三角瓶，培养基添加至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后灭菌。5.2.2.2 灭菌 121122(0.11MPa0.12MPa)保持25min灭菌。5.2.2.3 接种和培养 接种量是取2mm3mm大小母种10块12块放进液体培养基中，培养温度在

20、2326，振荡频率（搅拌速度）140 r/min160 r/min下振荡培养8d10d。5.2.2.4 检验 DB15/T 16262019 8 液体菌种接种后第3天对三角瓶逐个进行纯度检验，及时清理未活或污染的三角瓶。5.2.3 菌种罐液体菌种生产 5.2.3.1 装罐和灭菌 填装培养基至液体菌种罐2/3处，按照液体菌种罐说明书要求，对液体菌种罐和液体培养基灭菌，待液体培养基冷却至30以下时进行接种。5.2.3.2 接种与培养 将培养好的三角瓶液体菌种接入到液体菌种罐中，接种量为培养基总体积的8%10%，培养温度（25 2），搅拌转速150 r/min160r/min，灌压0.04MPa，通

21、风量0.7N m3/h。培养时间3d5d。液体菌种转接不得超过3次。5.2.4 检验 液体菌种接种后第3天对罐内培养基进行纯度检验，及时清理未活或污染的罐内培养基后，对液体菌种罐高压消毒。表4 灵芝液体菌种种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损、无裂纹 菌丝生长量 培养基 1/21/3 菌丝体特征 白色至透明块状、生长旺健 培养基 清澈、无杂色 杂菌 无杂菌 6 入库 检验合格的固体菌种应及时入菌种库，详细记录各生产环节，液体菌种生产应该随用随生产，不能进行入库保存。菌种库温度应该14，避光，适当通风但应该对空气进行杀菌处理。母种在库中贮存时间不应长于50d，贮存时间超出50d的母种应该进行出菇检验后再进行后续生产。每隔20d进行一次检查，提出破损、污染、生产异常的菌种。7 留样 各级菌种均应应留样，每批次留样3个（支），贮存在14，贮存至购买者购买后正常生产条件下出第一潮菇。_