聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang.ppt
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1、1 1、熟悉电泳的基本原理、熟悉电泳的基本原理2 2、掌握、掌握PAGEPAGE的基本原理与操作技术的基本原理与操作技术上午上午:制胶、原理讲解制胶、原理讲解中午:电泳(午餐)中午:电泳(午餐)下午:染色,脱色、观察结果下午:染色,脱色、观察结果电泳:电泳:是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电荷是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电荷的电极方向移动的现象。的电极方向移动的现象。应用应用:蛋白质蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。=Q=Q X/6r/6r Q Q 粒子所带电荷量粒子
2、所带电荷量 X X 电场强度电场强度 r r 粒子半径粒子半径 介质的粘度介质的粘度1 1、内在因素、内在因素:样品自身性质样品自身性质2 2、外在因素、外在因素:电场电场 缓冲液缓冲液 支持介质支持介质a.a.电荷电荷b.b.分子大小分子大小c.c.形状形状v=QX/6r 内因:内因:待分离大分子的性质待分离大分子的性质电流:电流:与电流成正比与电流成正比电压:电压:与电压成正比与电压成正比 常压电泳(常压电泳(100-500V100-500V)高压电泳(高压电泳(500-10000V500-10000V)电阻:电阻:与电阻成反比与电阻成反比 pHpH:解离性质解离性质解离程度解离程度运动方
3、向运动方向电荷量电荷量一般所用离子强度为一般所用离子强度为0.02-0.20.02-0.2之间之间离子强度:离子强度:强度强度过低过低,缓冲能力差,难以维持,缓冲能力差,难以维持pHpH恒定,同恒定,同 时样品扩散严重;时样品扩散严重;强度强度过高过高,减缓样品的迁移率。,减缓样品的迁移率。吸附吸附:支持介质对样品的滞留作用支持介质对样品的滞留作用,可导致样品的拖尾。可导致样品的拖尾。电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动。电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动。当电渗方向与电泳方向一致时,会加快颗粒泳动当电渗方向与电泳方向一致时,会加快颗粒泳动 速度;反之,当两者方向相反时,会减慢颗粒泳
4、速度;反之,当两者方向相反时,会减慢颗粒泳 动速度。动速度。分子筛:是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小,则颗粒在分子筛:是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小,则颗粒在 移动的过程中所受到的阻力也就越大。移动的过程中所受到的阻力也就越大。按按支持介质的不同可分为支持介质的不同可分为 纸电泳纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGEPAGE)SDS SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 N N N N,NNNN甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(BisBisBisBis)丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺
5、(AcrAcrAcrAcr)过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵/核黄素核黄素核黄素核黄素 N N N N,N N N N,NNNN,NNNN四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMEDTEMEDTEMEDTEMED)聚聚丙烯酰胺凝胶:丙烯酰胺凝胶:丙烯酰胺凝胶:丙烯酰胺凝胶:是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(AcrAcrAcrAcr)和交联剂和交联剂和交联剂和交联剂N N N N,N N N N,甲甲甲甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺(BisBisBisBis)在催化剂和加速剂的作用下聚在催化剂和加速剂的作用下聚在催化剂和加速剂的
6、作用下聚在催化剂和加速剂的作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。合而成的三维网状结构的凝胶。合而成的三维网状结构的凝胶。合而成的三维网状结构的凝胶。分类(根据有无浓缩效应)分类(根据有无浓缩效应)连续电泳:连续电泳:电泳体系中缓冲液组成、电泳体系中缓冲液组成、pH值及值及 凝胶孔径大小都相同。凝胶孔径大小都相同。电荷效应、分子筛效应电荷效应、分子筛效应不连续电泳:电泳体系中缓冲液组成、不连续电泳:电泳体系中缓冲液组成、pH值值 及凝胶孔径大小都不相同。及凝胶孔径大小都不相同。电荷效应电荷效应、分子筛效应、浓缩效应、分子筛效应、浓缩效应分离胶分离胶浓缩胶浓缩胶电极缓冲液电极缓冲液凝胶孔径凝胶孔径小
7、小大大缓冲体系离缓冲体系离子组成子组成Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HClTris-GlyTris-GlypHpH值值8.98.96.76.78.38.3浓缩胶浓缩胶,大孔胶大孔胶,Tris-HCl,pH6.7Tris-HCl,pH6.71.1.凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性2.2.缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性 快离子快离子(前导离子前导离子):):氯离子氯离子 ClCl-慢离子慢离子(尾随离子尾随离子):):甘氨酸根甘氨酸根 NHNH2 2CHCH2 2COOCOO-样品中蛋白质的泳动速度介于这两种离子之间样品中蛋白质
8、的泳动速度介于这两种离子之间3.3.电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性_ _+Tris/甘氨酸甘氨酸 pH 8.3Tris/HCl pH 8.9 分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时,其受阻滞的程度不同而表现出不同的分离胶时,其受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。的迁移率。进入进入pH8.9pH8.9的分离胶中的分离胶中,各种蛋白质所带净电荷各种蛋白质所带净电荷量不同而有不同的迁移率。表面电荷多量不同而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快则迁移快;反之反之,则慢则慢.分离胶(小孔胶)分离胶(小孔胶)pH8.9pH8.9分离胶分离胶,浓缩胶浓
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