电穿孔简介课件.ppt

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1、电穿孔简介Gene Pulser Xcell1电穿孔的工作原理是什么?电穿孔的基本原理是将细胞置于一个瞬时的高电场的环境中，此高电场的环境使得细胞膜的表面出现很多小孔，这种条件下细胞膜对于环境中分子的透性大大增加，这样就可以将外源分子进入细胞。利用上述的原理，那么采用电穿孔的方法就可将DNA等其他类的生物分子导入细胞内部进行研究，如蛋白分子、糖类分子等等。2采用电穿孔的优点本质上属于物理的方法，不采用任何化学试剂，因此不会对细胞产生损伤操作方便低毒性高的转染效率使用于种类广泛的细胞3电穿孔的主要应用导入标记基因，起到标记、指示的作用导入具体的功能基因进行研究导入药物、蛋白、抗体等其他分子对细胞

2、的结构和功能进行研究4具体的工作原理?将细胞和外源DNA混合后一起放在电击杯内电击杯被加上电压后，细胞膜进行重排，细胞表面出现很多小孔外源DNA分子通过上述形成的小孔进行细胞内部当外界的电场撤消后，细胞膜表面的小孔重新关闭，这时阻止外界的分子再进入细胞5Gene Pulser Xcell电穿孔系统电穿孔系统6主要的优点、特点提供指数波和方波2种电穿孔条件，可对任何的真核细胞、原核细胞的电转染实验条件进行优化采用Bio-Rad专利的 PulseTrac电路和电弧保护设计，可确保实验的重复性并保护样品模块化的设计可方便用户根据不同的实验要求进行选择友好的数字化界面，可直观的编程控制所有的参数，包括

3、附属模块的参数提供多种操作模式，包括手动设置、预设模式、用户编程等多种方式7主要的优点、特点：2种波型电穿孔的过程中可以有2种波型来控制外界电压的变化The Gene Pulser Xcell可以提供2种波型，即指数波和方波8Exponential Decay电容器充电到预定的电压(v0)放电后，即向样品释放脉冲，细胞表面的电压随时间按指数方式下降的电容器的电压值达到峰值释放脉冲后迅速的衰减电场强度 E(V/cm)是用来描述电击杯外界电场环境的一个参数（E=V/d）脉冲时间是一般用时间常数来进行衡量(37%of V0，V0/e)脉冲的时间是由电阻和电容的大小所决定的9GPX和指数波GPX产生指

4、数波的电路结构Charger充电回路放电回路电容器电击杯3ohm 电阻基本电路基本电路10GPX和指数波GPX产生指数波的电路结构Charger充电回路放电回路电容器电击杯3ohm 电阻r充电充电根据具体电压及电容的选择，可以采用主单元或者CE模块对电容进行充电11GPX和指数波GPX产生指数波的电路结构Charger充电回路放电回路电容器r电击杯3ohm 电阻放电放电The charge is delivered to the cuvette12PulseTrac 电路是如何确保每次实验电压的精确度及实验的重复性在每次放电前，PulseTrac电路都会预测整个放电回路的电阻值，并计算得到应该

5、加在电容器上的电压，确保放电后样品上获得的电压和理论电压值的一致在放电回路中3欧姆的电阻可以起到减小回路中电流的作用，适当的保护样品注意：PulseTrac 回路技术是Bio-Rad公司的专利技术，其他任何厂家都不能提供13PC模块的结构与原理?电流会经过电阻最小的通路PC模块中的电阻决定了脉冲过程中的时间常数，电阻越小，放电时间越短Charger充电回路放电回路电容器Cuvette3ohm 电阻rPC模块并联电阻当样品的电阻远远大于PC模块的电阻时，则PC模块的电阻约等于放电回路的电阻14方波电容器的指数放电过程中被截止后就会形成方波，其时间常数远大于脉冲时间脉冲时间就是细胞被放电的时间 脉

6、冲是可以被反复释放的，在低压回路最多可以重复10次，在高压回路最多可以重复2次脉冲的间隔时间就是指2个脉冲间的时间脉冲下降是指终止电压和起始电压值之间的差值15GPX和方波高电压回路:一次充电，一次脉冲。在下一次脉冲前，电容器需要重新充电最多只能进行2次脉冲，脉冲时间为0.05 5msec，脉冲间隔为5-30sec低电压回路:该电路是可调的，因此可一次充电，进行多次的脉冲最多可进行10次脉冲，脉冲时间为0.05-100msec，脉冲间隔为 0.1 10 sec16特点:PulseTrac电路和电弧保护PulseTrac电路确保样品上所加电压的精确度将CE模块中的低压电容器的精度从20%提高到1

7、0%电容器的校正方便，确保每次脉冲的精确，并且能修正随着使用而产生的电容器指标的偏差 在每次脉冲前就能预测样品的电阻当脉冲或电路中断时，可进行安全的放电，确保安全电弧保护设计，确保设备和样品的安全17什么是电弧保护?在电击杯中出现电阻特别小的区域时，就会形成短路，产生电弧。样品缓冲液中的离子成分就会造成电弧现象只要上述电阻突然变小的情况被检测到，那么电流就不会经过样品电弧保护就是在存在短路的情况下，使电流不经过样品，确保样品不受强电流的损伤如果样品量很少的话，那么产生的热量会使得样品蒸发如果由于样品的低电阻而产生电弧，那么GPX会给出提示，并不能提供脉冲Ions collect above s

8、ample18特点:模块化设计主机CE模块PC模块ShockPod电击槽系统部件19特点:友好的操作界面图表化的操作界面可以设置所有的实验参数，包括附属模块的参数20特点:可选择的程序设置HOMEHOME 1.Exponential protocol 1.Exponential protocol 2.Time constant protocol 2.Time constant protocol 3.Square wave protocol 3.Square wave protocol 4.Pre-set protocols 4.Pre-set protocols 5.User protocol

9、s 5.User protocols HOMEHOME 6.Last pulse 6.Last pulse 7.Optimize 7.Optimize 8.Data management 8.Data management 9.Measurements 9.Measurements 10.User preferences 10.User preferences主菜单211.指数波程序显示结果显示222.时间常数确定的指数波形式程序显示结果233.方波程序显示结果显示244.GPX内部预设程序Mammalian CellsBacterial CellsFungal CellsCHOE.coliS

10、.cerivisiaeCos7A.tumefaciensP.pastoris3T3P.aeruginosaC.albicans293S.aureusS.pombeHeLaB.cereusD.discoideumBHK21S.pyogenesA549L.plantrumCV1K562HL60JurkatHuT78 对于常规的细胞，经过优化的电穿孔条件255.用户自储存的程序 最多可储存144个程序 12个人，每人12个程序 可按照名字储存 可修改或删除266.最后一次电穿孔的条件即使关机后，GPX还是可以调出仪器最后一次电穿孔的条件，并利用该程序进行实验。方便实验室最常用程序的使用277.实验条

11、件的优化可用于方便的优化实验条件，可连续的对脉冲条件中的电压某一个参数进行优化该功能可在指数波、方波、特定时间常数的指数波模式下使用288.实验数据管理数据管理可以调出之前的100个实验程序显示每个程序的设置条件和结果299.仪器的测量功能该功能使用户可以在日常的工作中经常对GPX CE模块电路中的电容器进行校正，确保实验的精确，具体的步骤如下：断开ShockPod电击槽连接CE模块按下操作面板上的小数点按键在电击前预测样品的电阻 在实验前，在电击杯里加入样品后放入ShockPod电击槽内，在 Resistance Measurement的菜单下按下“回车键”3010.用户可对GPX设置的参数用户可设置时钟，这样可对实验的程序按日期排序，方便日后的调用调节LCD屏幕的亮度可调节在仪器进入睡眠状态的时间 31特点:ShockPod电击槽独特的设计单手即可操作，使用方便提高了处理样品的通量安全的联锁设计，确保电击槽在开盖的情况下发出脉冲电击杯槽的设计确保电击杯正确的放置位置非常容易清洁32