2022年DB21T 1749.3-2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程.doc

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1、DB21/T 16782008辽宁省质量技术监视局 发布2009-11-23施行2009-10-23发布黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程DB21/T 1749.32009DB21辽宁省地点标准ICS备案号：1DB21/T 1749.32009前 言本标准附录A、附录B、附录C、附录D、附录E为标准性附录。本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。本标准起草单位：辽宁省植物保护站。本标准主要起草人：蔡 明、宋雅坤、吴元华、李明福、江 冬、李 眷、李维根。I黄瓜绿斑驳花叶病毒检验检测技术规程1 范围本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus

2、， CGMMV）的检验检测与鉴定方法。本标准适用于全省各地开展黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验检测工作。2 术语和定义以下术语和定义适用于本标准。2.1检验 inspection对植物、植物产品或其他限定物进展官方的直观检查以确定是否存在有害生物和/或是否符合植物检疫法规。2.2 检测 detection为确定是否存在有害生物或为鉴定有害生物而进展的除肉眼检查以外的官方检查。2.3 鉴定 identification对可疑的有害生物是否与已经知道物种同一的鉴别过程。2.4发生 happen官方报道在一个地区存在着土生或传入的有害生物，和/或官方未报道在一个地区存在的有害生物已经被铲除。3 原理黄瓜绿斑

3、驳花叶病毒属烟草花叶病毒属。其病原形态特征见附录A，其寄主范围、地理分布、生物学特性、危害病症和传播途径见附录B，其血清学检测技术，应用双抗体夹心酶联免疫吸附法技术（ELISA）测定和分子生物学（PCR）测定，详细检测方法见附录C、附录D。4 材料、仪器、器具及药品4.1 材料葫芦科作物种子、叶片和果实。4.2 仪器、器具电子显微镜、台式离心机、分光光度计、RT-PCR仪、冰箱、酶联板、酶联读数仪、微量加样器、洗瓶、载玻片、玻棒、研钵、微量离心管、培养皿、打孔器、滴管、吸管、量筒、三角瓶、水浴锅、毛细管、针头、电泳仪、水平电泳槽、胶手套、剪刀、镊子、自封袋、油性笔、标签、记录本等。4.3 药品

4、 专化性抗体免疫球蛋白1gG(浓度约为1mg/mL)、酶标记羊抗兔抗体球蛋白1gG(市售)、碳酸钠(无水)、碳酸氢钠、叠氮化钠、磷酸氢二钠(无水)、磷酸二氢钾(无水)、氯化钠、氯化钾、Tween-20、鸡蛋清粉、聚乙烯吡咯烷酮、亚硫酸钠(无水)、牛血洁白蛋白、二乙醇胺、氯化镁等。5 现场检验鉴定5.1 种子检查在11月翌年2月份对市场销售的葫芦科作物种子和砧木种子进展扦样，每份样品取100粒，送指定的有关部门进展检测。重点检查用做砧木的种子。5.2 田间调查3月10月份在黄瓜绿斑驳花叶病毒的发生期，选择有代表性地块，检查叶片、果梗、果实，看叶片上是否出现黄绿相间斑驳、隆起、皱缩、蕨叶，果梗是否

5、有褐色条斑，果实外表是否有斑驳、凸起，果实内部是否有空洞、黄丝、果肉暗红倒瓤等。5.3 病症检验从植株上摘取病叶或果实，与附录B记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的为害病症进展比拟，符合附录B记述的黄瓜绿斑驳病毒为害病症的为疑似病株。或在调查现场将病叶取下，用快速诊断试纸条或诊断试剂盒（附录E）进展初步诊断。5.4 病害发生分级标准(以株为单位)0级：无任何病症；1级：心叶明脉，细微花叶，发病面积占整个植株面积的5%以下；3级：心叶及少数叶片花叶，发病面积占整个植株面积的615%；5级：多数叶片花叶，少数叶片皱缩、畸形，植株细微矮化，发病面积占整个植株面积的16%30%；7级：多数叶片严峻花叶，多数叶片

6、皱缩、畸形，植株矮化，或叶柄有褐色坏死斑点，发病面积占整个植株面积的31%50%；9级：严峻发病，叶片严峻畸形，植株严峻矮化，茎部有褐色条斑，发病面积占整个植株面积的51%。以上。5.5 病情指数按下式计算。（1）式中：病情指数；各级病株数；该病级数；调查总株数；最高级数。6 实验室检测鉴定经现场检验检测，不能确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒的，取样带回实验室进展检测鉴定。6.1 取样方法在发病植株上，随机选取发病叶片或果实（其数量以满足检测鉴定所需为限），装入聚乙烯塑料袋中密封，贴好标签带回。标签应注明采集时间、地点、采集人等信息。对所采集的样本，应放入低温（4）密闭保存，要尽早进展鉴定。6.2 病

7、毒鉴定将所采集的样本进展血清学检测技术（ELISA）或分子生物学技术（PCR）测定，将检测结果与附录A记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的病原特征进展比拟，符合附录A记述的黄瓜绿斑驳花叶病毒病原特征的，确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。7 标本保存7.1 应配有田间调查的植株、叶片、花、果实等材料，病症照片;当地专家的初步鉴定或识别结果。7.2 样品采集应以幼嫩叶片为主，特别材料能够依照详细情况灵敏掌握，样品数量不少于200g/份，每个标样2份，倡导冻干样品（冷冻样品），送指定的专家鉴定。7.3 当地设法保存活体样品，以备应急使用。7.4 合适压制的叶片标本，应随采随压于标本夹中。7.5 记载寄主名称、发病情况

8、、环境条件、采集地点、采集日期、采集人姓名等。附录A （材料性附录）黄瓜绿斑驳花叶病毒分类命名和病原特征A.1 分类和命名A.1.1学名 Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）A.1.2分类地位 烟草花叶病毒属(Tobamovirus)A.1.3病毒异名 Tobacco mosaic virus watermelon strain,Cucumber virus 3,Cucumber virus 4, Cucumid virus 2A.2 病原特征A.2.1 病毒粒子直棒状病毒，长300nm，宽15nm 。沉淀系数185S。等电点pH4.98；A260

9、/2801.38。A.2.2 核酸核酸含量5，单链RNA，分子量2106。G:A:C:U=23.2:24.6:20.6:31.6。A.2.3蛋白蛋白含量95，分子量17261。氨基酸160，其组成为Ala21、Arg8、Asp20、Cys0、Glu10、Gly9、His1、Ile7、Leu18、Lys4、Met0、Phe9、Pro6、Ser24、Thr10、Trp2、Tyr4、Val7。A.2.4 病毒株系依照不同别离物的血清学反响及其对苋色藜和蔓陀罗的病症反响，将其分为以下株系。主要有英国和欧洲报道的典型株系（Ainsworth, 1935），日本报道的黄瓜株系（cucumber strai

10、n）、西瓜株系（Watermelon strain）和Yodo株系（Yodo strain），以及印度 C 株系(Hollings et al.，1975)。附录B(材料性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒的寄主范围、地理分布、生物学特性、为害病症、传播途径及鉴别寄主B.1 寄主范围B.1.1 自然寄主西瓜、南瓜、甜瓜、黄瓜、葫芦、西葫芦、瓠瓜。B.1.2寄主范围苋色藜、蔓陀罗、甜瓜、笋瓜、西葫芦、葫芦、丝瓜、烟草。B.2 地理分布目前，CGMMV 在世界已广泛分布，欧洲的英国、爱尔兰、德国、荷兰、丹麦、俄罗斯、希腊、奥地利、捷克、斯洛伐克、芬兰、南斯拉夫、罗马尼亚、摩尔多瓦、波兰、乌克兰、拉托维亚、保

11、加利亚、捷克、匈牙利、西班牙、瑞典；南美洲的巴西；亚洲的日本( Yodo、Ibaraki、松山、德岛、北海道、千叶)、印度(Uttar-Pradesh、Delhi)、韩国、巴基斯坦(西北部边境省份)、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、朝鲜及我国的辽宁、河北、山东、广东、湖北等省发生。B.3 生物学特性B.3.1 致死温度黄瓜绿斑驳花叶病毒的致死温度为90 100B.3.2 稀释限点黄瓜绿斑驳花叶病毒的稀释限点为10-6 10-7 mL/LB.3.3 体外存活期体外存活期较长，达119d以上。在 0可保持数年，20病毒仍能存活。病毒在种子内可存活240d540d，病残体在土壤内深埋420d，病毒仍有侵染

12、活性。B.3.4 病毒粒体形态电镜观察病毒粒体为棒状，长约300nm，宽15nm。B.4 为害病症B.4.1 西瓜染病病症幼叶出现淡黄色花叶，其后出现斑驳、花叶、叶脉绿带状、浓绿凹凸斑等，随叶片老化病症减轻。有时也呈叶脉绿带状。果实外表浓绿圆斑，果蒂处有时坏死，种子四周的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞，同时呈丝状纤维化，腐烂变味，不能食用。B.4.2 甜瓜染病病症感病后茎端新叶出现黄斑，但随新叶老化病症减轻。成株侧枝叶出现不整形或星状黄花叶，生育后期顶部叶片有时再现大型黄色轮斑。果实有两类病症，一种在果实外表出现绿色斑。另一种在绿色部的中心出现灰白色部分。B.4.3 黄瓜染病病症

13、感病初期新叶出现黄色小斑点，以后黄色部分扩展成花叶，并发生浓绿瘤状突起，出现叶脉绿带。发病轻时果实只出现淡黄色圆形小斑点，严峻时出现浓绿色瘤状突起变成畸形。B.5 传播途径B.5.1 传播方法CGMMV有多种传播方式：1.种子传播；2.接触传染（包括植物间接触、农事操作、汁液）；3.介体传毒（如菟丝子、黄瓜叶甲）；4.花粉传毒；5.病残体6.其他（啮齿动物的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的牛粪）。其中带毒种子是远间隔传播主要途径。接触性传染是近间隔传播主要途径。B.5.2.2侵染循环该病毒在种子、病株残体、土壤中均可越冬，成为第二年的初侵染来源。带毒种子是主要初侵染

14、源。在田间， CGMMV 能非常容易地通过病株的汁液接触传播，人工嫁接和授粉等方式易再传染。因而，田间农事操作如整枝、上架、摘心、授粉、嫁接、摘果均可导致该病毒的再次传播。B.5.3流行与环境发病受温度妨碍，在16时侵染至发病需23周，显病较轻；在2835下接种1周即可发病，病症重。CGMMV适生性和抗逆性极强，所有株系都是极端稳定的，其致死温度 90 100，稀释限点10-6 10-7，常温下病毒侵染力可保持数月，在 0可保持数年，20病毒仍能存活，一旦条件适宜还能接着传播蔓延。田间一旦发病，如未进展特别的杀灭处理，病株残体中的病毒可存活多年，即便将病根埋在土壤内 365d以上，病毒仍保持侵

15、染才能。B.6 鉴别寄主B.6.1 黄瓜 新叶出现黄色小斑点，后呈花叶并带有浓绿色突起，叶脉间褪色呈叶脉绿带状。B.6.2 西瓜 茎端幼叶出现淡黄色花叶，其后出现浓绿凸凹斑，随叶片老化病症减轻。果实外表浓绿圆斑，中央有坏死点，种子四周的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色出现空洞。B.6.3 甜瓜 新叶出现黄斑，但随叶片老化呈叶脉绿带状。B.6.4 瓠瓜 叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化呈叶脉绿带状。B6.5葫芦幼叶出现淡黄色花叶，其后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化病症减轻。B.6.5 苋色藜 经西瓜株系、Yodo株系和印度C株系侵染后出现细小部分坏死斑，而欧洲黄瓜株系不出现这种病症；无系统侵染

16、。B.6.6 蔓陀罗 Yodo株系和日本的黄瓜株系在接种后7d产生能扩散的部分褪绿斑；无系统侵染。附录C(标准性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒双抗体夹心酶联免疫吸附测定（Double antibody sandwich ELISA）标准C.1仪器和器具C.1.1仪器设备离心机、电子天平（1/10 000g）、酶标仪等。C.1.2 器具可调移液器（20L200L、200L1000L）及相关吸头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、量筒、烧杯等。C.2 试剂C.2.1包被缓冲液无水碳酸钠 1.59g，碳酸氢钠 2.93g，叠氮化钠 0.2g，蒸馏水定容至1000mL，调整pH至9.6，4储存。C.2

17、2洗涤缓冲液（PBST）磷酸氢二钠（无水） 1.15g或磷酸氢二钠（十二水） 2.9g，磷酸二氢钾（无水） 0.2g，氯化钠 8.0g，氯化钾 0.2g，吐温-20 0.5g 蒸馏水定容至1000mL，调整pH至7.4，室温储存。C.2.3 提取缓冲液鸡蛋清粉 2.0g，PVP （分子量 24-40,000）20.0g，无水亚硫酸钠 1.3g，叠氮化钠 0.2g，吐温-2020.0g溶解于1000mL 1X PBST中，调整pH至7.4，4储存。C.2.4 酶标抗体缓冲液牛血清蛋白 2.0g，PVP（分子量 24-40,000） 10.0g，叠氮化钠 0.2g，溶解于1000mL 1X PBS

18、T中，调整pH至7.4，4储存。C.2.5 底物缓冲液二乙醇胺97.0mL，氯化镁0.1g，叠氮化钠0.2g，蒸馏水定容至800mL，调整pH至9.8，4储存。C.3 取样方法C.3.1种子取假设干粒种子，去皮，参加样品提取缓冲液（W/V=1：8）研磨匀浆，离心后4 保存待用。C.3.2叶片取叶片参加提取缓冲液（W/V=1：8）研磨匀浆。离心后4 保存待用。C.4 DAS-ELISA检测程序C.4.1包被 将CGMMV的包被抗体按照试剂盒指定稀释比例用包被抗体缓冲液稀释，混匀，参加酶联板中，每孔内参加100 L，放入保湿盒内，4 冰箱过夜。C.4.2洗涤 孵育完毕后，将反响孔中的试剂倒出，用P

19、BST洗涤液冲洗3次4次，每次15s，然后将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。C.4.3参加抗原（待测样品）在酶联板中参加抗原(待测样品)，同时参加阳性指控物和空白对照（即样品提取缓冲液），阳性指控物、空白对照和待测样品每孔内参加100 L，待测样品重复3次，恒温箱中或室温（2025 ）孵育2 h。C.4.4 洗涤按本规程4.2执行。C.4.5 参加酶标抗体将CGMMV的酶标抗体按照试剂盒指定稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释，混匀，参加酶联板中，混合均匀，于每个反响孔中参加100L，放入保湿盒内，室温（2025 ）孵育2 h。C.4.6 洗涤按本规程4.2执行。C.4.7 参加底物试剂孵育完

20、毕前的15 min制备PNP底物溶液，参加PNP显色剂，混合均匀，参加酶联板，每孔100 L。放入保湿盒内，室温（2025 ）避光3060 min。C.4.8 终止反响于每孔中参加50 L终止液，终止反响。C.4.9 测定用酶标仪在405 nm波长下测量结果，读取各孔溶液的光密度值（OD值）。C.5结果评定依照试剂盒提供的方法和标准。在阳性对照光密度值符合试剂盒设定值的前提下，以微孔中阴性对照的2倍为标准，大于这个数值的样品为阳性结果，小于这个数值为阴性结果。另外各参照孔（包括底物孔、缓冲液孔、阴性对照、阳性对照）测定值要符合试剂盒设定的目的值；重复样品孔的光密度值一致。C.6样品保存关于检测

21、结果显示为阳性的样品，必须对样品进展保存。种子样品应保存在4冰箱内，叶片和果实样品应保存在20冰箱内。C.7结果记录与材料保存完好的实验记录包括：样品的来源、品种、接收时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。附录D(标准性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-PCR扩增聚合酶链式反响测定(Polymerase Chain Reaction，PCR)标准D.1仪器和器具D.1.1 仪器设备PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（1/10 000g）、pH计、水浴锅、振荡器等。D.1.2器具可调移液器（0L20L、20L200L、200L1000L）及相关吸头、

22、eppendorf管、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2 mL）、量筒、烧杯、镊子等.D.2 试剂Trizol为上海生工生物工程产品；RT-PCR试剂盒为TaKaRa RNA PCR Kit （AMV） Ver 3.0 （TaKaRa Code.DRR019A）。其他试剂：液氮、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭。D.3 检疫程序D.3.1 器皿前处理为防止RNA酶降解RNA，器皿在试验前都要用DEPC水（V：V=1：1000）进展处理。将研钵、枪头、离心管等放于DEPC水中37，浸泡24 h，取出后121灭菌30min ，烘干备用。D.3.2 总RNA的提取取显症的叶片

23、液态氮中充分研磨，转入1.5 mL的离心管中，参加1 mL Trizol试剂，室温下静置5 min后参加200 L氯仿涡轮震荡15 s，室温下放置5 min。12000 r/min，4离心15 min，转移上清于一个新离心管中，加600 L异丙醇混匀后于室温下静置10 min，12000 r/min，4 离心15 min，倒掉上清液，在沉淀物中加1 mL 75%的乙醇清洗1次，吸掉上清后室温枯燥3min5 min，参加30 L DEPC ddH2O溶解总RNA。D.3.3 RT-PCR反响体系D.3.3.1 引物序列(CGMMV-西瓜株系) 上游引物（Primer F）：5-ATGGCTTAC

24、AATCCGATCAC-3； 下游引物（Primer R）：5-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGC-3。D.3.3.2 RT-PCR实验步骤D.3.3.2.1 cDNA合成 按以下组分制备RT反响体系10mL，反响以参加不含RNase 的dH2O为阴性对照，反响条件为42 1 h；99 5 min；5 5 min扩增cDNA。反响体系见表D.1。D.3.3.2.2 PCR扩增在冰浴上依次将以下组分参加PCR反响管中，反响采纳50 L体系。反响条件为：94预变性3 min；94变性30 s，53退火45s，72延伸1 min，35个循环；72延伸 10 min。反响体系见表D.2。D3.

25、3.2.3 RT-PCR扩增产物凝胶电泳检测 取5 L 扩增产物用6loading buffer溶解，点样。电泳检测，用溴化乙锭（EB）溶液进展染色30 min。在Image Master紫外成相系统（Pharmacia Biotech）上观察结果并摄像。表 D.1 RT反响体系反响组成体积（L）Primer R（10M）0.5MgCl2210RT Buffer1RNase free dH2O3.75dNTP Mixture（各10mM）1RNase Inhibitor （40 U/L）0.25AMV Reverse Transcriptase0.5RNA1Total10表 D.2 PCR反响

26、体系反响组成体积（L）5PCR buffer10ddH2O29.25TaKaRa ETaqHS0.25Primer F（10M）0.5RT产物（cDNA）10Total50D.4 结果评定观察电泳结果，PCR产物在500bp处有条带出现，推断样品携带黄瓜绿斑驳花叶病毒，否则为阴性。D.5 样品保存关于检测结果显示为阳性的样品，必须对样品进展保存备查。种子样品应保存在4冰箱内，叶片和果实样品应保存在-20冰箱内。D.6 结果记录与材料保存完好的实验记录包括：样品的来源、品种、接收时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。PCR检测需有电泳结果照片及测序结果。附录E(标准

27、性附录)黄瓜绿斑驳花叶病毒快速诊断试纸条或检测盒测定标准 E.1检测样品处理E.1.1 植物样品在检测前需经研磨，并用缓冲液稀释。植物叶片样品可使用配套制样管或制样袋进展样品处理。E.1.2 将样品叶片（半片至一片）放入制样管中，充分进展震荡混匀，使样品到达研磨效果，静置待检。E.1.3 制样袋样品处理：将样品叶片（半片至一片）放入制样袋中，用研磨棒在制样袋外侧充分研磨。E.2样品检测使用前将试纸条或检测盒恢复至室温（1530）。E.2.1试纸条从包装中取出试纸条，有“箭头”标记端为样品端。样品端垂直向下，插入预备好的样品液中。样品液不要超过胶体金试纸条上的MAX线。在检测过程中，检测条应不断

28、浸在样品液中，直到检测液爬至检测膜的中部，取出放平，阅读检测结果。E.2.2检测盒从包装中取出诊断盒，将检测盒放平，汲取待测样品12滴滴入加样窗口中，观察检测结果。测试观察的时间以10 min20 min为好。关于病毒浓度低的样品时间可适当延长。E.3结果断定 阳性结果：质控线显粉红色，测试线也显粉红色，检测结果为阳性。 阴性结果：质控线显粉红色，测试线未显色，检测结果为阴性。 无效结果：质控线和测试点线均未显色，说明试纸条失效，检测结果无效。E.4考前须知E.4.1 试纸条和快速诊断盒应在有效期内使用。E.4.2 试纸条和快速诊断盒应在28冰箱内密封枯燥保存。使用时留意未用的要密封。以免吸湿而失效。使用温度应在1530。E.4.3 样品制备对检测结果妨碍明显。如样品液中有大量组织块，会妨碍检测条汲取样品液；如样品液太稀，则易出现假阴性结果。E.4.4 检测试纸条浸入样品液的深度：浸入深度不能超过“MAX”标记。如浸入太深，试纸条的一些有效成分会被稀释进入样品液中，而不是进入检测区实现检测反响，出现无效结果。如浸入太浅，则样品液扩散速度降低，甚至无法向上扩散，同样出现无效结果。E.4.5 检测试纸条不能回收或重复使用。11