2022年XXXXCB911000-G-蛋白质的生成、修饰与质量控制.doc

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1、工程名称：蛋白质的生成、修饰与质量操纵首席科学家：Sarah Perrett 中国科学院生物物理研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学咨询题及研究内容关键科学咨询题： 本工程的关键科学咨询题是：细胞如何实现对蛋白质合成、折叠、修复、降解及修饰不同环节的质量操纵；在应激条件下蛋白质质量操纵体系如何调控；蛋白质异常修饰对质量操纵体系的妨碍及其相关疾病发生开展的机制等关键科学咨询题。重点研究蛋白质合成的准确操纵机制；蛋白质折叠尤其是内质网和线粒体氧化折叠系统中关键蛋白的构造与功能及互相作用网络；分子伴侣在错误折叠蛋白的修复与降解中的作用；应激条件下质量操纵体系中蛋

2、白质的氧化复原修饰调控；蛋白质异常修饰在细胞及动物水平产生的妨碍。通过系统研究蛋白质质量操纵体系不同环节关键蛋白的功能和互相关系，获得蛋白质质量操纵分子机制的全景网络。 主要研究内容：本工程深化系统研究蛋白质生物合成的质量操纵、蛋白质的氧化折叠与氧化复原修饰、蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用、蛋白质的异常修饰与疾病的关系。系统开展蛋白质质量操纵关键蛋白和互相作用网络研究，分析关键蛋白质或调控因子在蛋白质质量操纵过程中的功能及在生理与病理状态下的动态变化，挑选对氧化折叠和质量操纵具有调控功能的小分子化合物。探究环境要素诱导的蛋白质异常修饰与认知障碍之间的关系，开发试用于老年性痴呆症临床诊断的生物标

3、记物。 1 蛋白质翻译的准确操纵机制 研究亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）对特异氨基酸及其对应的特异tRNA之间互相识别匹配的机制；鉴定依赖和非依赖tRNA的转移前编校发生的位点；tRNA的氨基酸接受臂（amino acid acceptor arm）在氨基酰化活性中心和编校活性中心之间的动态转位过程； tRNA关键核苷酸在氨基酰化反响、编校反响各步和蛋白质翻译起始阶段的详细作用机理；探究LeuRS中某些特定构造域的功能；肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA调控下的氨基酰-tRNA正向移位与反向移位的识别条件、作用位点、信号传递途径；研究在高等生物中反向移位的生理意义。 2

4、内质网和线粒体中蛋白质氧化折叠的分子机制 研究内质网氧化折叠相关蛋白质（Ero1、Ero1、PDI和Prx4等）的互相作用网络。采取分子生物学、生物化学、细胞生物学和构造生物学等多种学穿插技术手段，研究Ero1活力的调理、Ero1与PDI互相作用、内质网过氧化氢的有效去除机制和阐述新的蛋白质氧化折叠分子QSOX1的功能等，获得内质网蛋白质氧化折叠调控的网络关系（Ero1-PDI，H2O2-Prx4/Gpx7/Gpx8-PDI, QSOX1）。解析线粒体Mia40-Erv1和Mia40-底物蛋白复合体的构造，解析线粒体膜间隙中血红素/铜转运蛋白和其他具有重要生物学功能的蛋白的构造，说明线粒体的氧

5、化折叠电子传递机制。 3 蛋白质巯基的氧化复原修饰对蛋白质质量操纵体系的妨碍 开展新的巯基氧化复原修饰检测的定量蛋白质组学方法；研究内质网氧化折叠相关蛋白质（Ero1和Prx4等）的亚硝基化及谷胱甘肽化修饰的生理意义。巯基氧化复原修饰对蛋白质质量操纵体系（分子伴侣、泛素-蛋白酶体系统及自噬系统）关键蛋白（Hsp70、Hsp40、泛素化E1连接酶UBA1、UBA6、E2连接酶UBA3、去泛素化酶USP5、USP10、ATG）功能的妨碍。挑选对氧化折叠和质量操纵具有调控功能的小分子化合物。 4 蛋白质错误折叠聚拢的机制 以几个与神经退行性疾病相关的淀粉样蛋白质（Prion、Tau、-Synucle

6、in、TDP-43、PolyQ蛋白）为模型和对象，综合应用生物化学、分子生物学、构造生物学和细胞生物学的先进技术方法，研究蛋白质的错误折叠、淀粉样聚拢和包涵体构成的分子机制和生物效应；蛋白质翻译后修饰及大分子拥堵对蛋白质聚拢的调控；蛋白质错误折叠和疾病发生的内在联络以及挑选和设计对蛋白质聚拢和包涵体具有调控功能的小分子化合物。系统研究分子伴侣（Hsp70、Hsp90、Hsp104、GroEL、TriC、ERp57）和辅伴侣（CHIP、HSJ1、USP19、BAG6）在蛋白质错误折叠的发生和去除中的调理作用。5 蛋白质异常修饰与认知功能障碍 建立蛋白质过度磷酸化的细胞和动物模型，即采纳醛类（甲醛

7、、核糖等）诱导细胞和动物脑内Tau、-Synuclein等蛋白过度磷酸化；研究过度磷酸化对Tau、-Synuclein等蛋白构造与功能的妨碍；探究在“醛应激”状态下的蛋白质过度磷酸化及其相关作用网络规律，如醛类与细胞的互相作用通讯网络，蛋白质质量操纵体系的作用、激酶与磷酸化系统的调理、突触间联络的损伤及神经细胞死亡的机制。说明异常修饰（过度磷酸化、非酶促糖基化等）与蛋白质错误折叠之间的关系，醛应激导致的蛋白质异常修饰与认知障碍之间的关系；在此根底上，研究内源性甲醛作为生物标记物用于老年性痴呆症临床诊断的可能性。二、预期目的总体目的： 本工程围绕蛋白质的生成、修饰与质量操纵这一关键科学咨询题，主

8、要研究蛋白质生物合成的质量操纵、蛋白质的氧化折叠与氧化复原修饰、蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用、蛋白质的异常修饰与疾病的关系，讨论质量操纵失衡与蛋白质错误折叠相关疾病发生开展的关系。通过优势集成团队的通力合作，确保工程研究高质量施行，着重建立较完善的蛋白质质量操纵研究体系、获得相关前沿研究打破、提醒关键蛋白质的动态规律与功能机制、阐析蛋白质质量操纵体系的作用机制和调控机制、挑选妨碍蛋白质质量操纵的小分子化合物、获得具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，促进说明重要生命活动的根本规律和向生物医学的转化应用，为蛋白质科学领域的研究理论增添新内容，为神经退行性疾病等蛋白质错误折叠相关疾病的预防、

9、诊治、药物开发等研究提供理论根底，同时明显提升我国蛋白质质量操纵研究的水平和妨碍力，使我国在该领域的研究跻身于国际前列。 五年预期目的： 1系统建立完善的蛋白质合成、折叠、修复、降解和修饰的蛋白质质量操纵体系的体内研究平台和体外研究平台; 建立和开展研究蛋白质质量操纵和修饰调控的新技术新方法，为蛋白质质量操纵机制研究的长期可持续开展和立足国际前沿奠定重要根底，促进蛋白质基地建立。 2在蛋白质合成的准确操纵机制、氧化折叠关键蛋白的构造与功能研究及氧化折叠的网络调控、蛋白质错误折叠与聚拢的机理、蛋白质质量操纵的氧化复原调控机制方面获得系统研究成果和打破进展。 3说明“醛应激”的分子细胞机制，以及内

10、源性甲醛与老年性痴呆症认知功能障碍之间的相关性，提供临床根底研究实验数据。由此建立临床检验老年性痴呆症的生物化学方法，为今后开展成为用于临床诊断和药物使用的评价指标的新方法打下根底。 4发表论文 50-80 篇，其中在国际一流期刊（IF10）发表论文5-10 篇、在国际有妨碍力期刊发表论文20-30篇。申请专利3-5项 5培养该领域战略领军人才2-3 名、副教授/研究员及高级技术型人才4-6名、博士后 10-15 名、硕博生30-50 人，建立一支具有国际竞争力的蛋白质质量操纵研究队伍。 三、研究方案学术思路 本工程聚焦蛋白质质量操纵研究领域前沿，结合最新发觉和国际开展趋势，紧扣蛋白质合成、折

11、叠、修复、降解及修饰等关键环节的质量操纵，系统研究蛋白质的“生老病死”。以蛋白质质量操纵的关键蛋白质的功能研究为切入点，从单一功能研究拓展到多种功能研究，从单蛋白功能研究拓展到互相关联蛋白的网络研究，并将功能研究与构造研究严密结合，正常和应激条件下功能研究严密结合，阐析关键蛋白质的构造、功能和修饰调控机制。应用生物化学、细胞生物学、生物物理学和系统生物学等分析蛋白质质量操纵互相作用的分子网络，提醒其与蛋白质错误折叠相关疾病发生开展的内在关系，获得蛋白质质量操纵分子机制的全景网络。 技术途径 本工程根据已有工作根底，设臵四个严密关联的蛋白质质量操纵研究课题，包括 1）蛋白质生物合成的质量操纵、2

12、）蛋白质氧化折叠与氧化复原修饰、3）蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用、4）蛋白质异常修饰与疾病的关系，针对拟处理的关键科学咨询题结合攻关，获得蛋白质质量操纵和修饰调控的创新研究方法和平台，以及质量操纵分子机制的全景网络；在应用成果方面获得能够试用于老年性痴呆症临床诊断的生物标记物；挑选调理蛋白质质量操纵的小分子化合物。工程研究技术途径示意图如下：工程总体研究技术途径示意图课题1 蛋白质生物合成的质量操纵 首先以亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）为代表，研究不同来源的LeuRS之合成和编校功能的特点，说明在蛋白质生物合成起始阶段质量操纵的机理。同时在原核和真核生物中，开展对肽酰-tRNA移位相关

13、的两个因子EF-G和LepA的研究，说明在蛋白质生物合成过程中的质量操纵机理和生理学意义。最后利用分子生物学和生物化学的方法研究：蛋白质跨膜前的新因子LepA/Guf1与其他因子的互相作用；LepA/Guf1翻译阻滞与蛋白质合成的关系；LepA/Guf1与SRP的系统效应。课题1 研究技术途径示意图课题2 蛋白质氧化折叠与氧化复原修饰 首先建立蛋白质巯基氧化复原修饰的评价体系，挑选出氧化复原敏感的蛋白质靶点，建立体外及体内研究蛋白质氧化折叠与蛋白质质量操纵的关键蛋白的研究模型。之后，详细研究各个关键蛋白质靶点的巯基氧化复原修饰关于蛋白质氧化折叠与质量操纵的调控机制。最后，利用建立好的蛋白质氧化

14、折叠与质量操纵体系的体外与体内评价体系，来挑选具有调控作用的小分子化合物，为进一步的药物设计奠定根底。课题2 研究技术途径示意图课题3 蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用 首先选定与神经退行性疾病相关的几个淀粉样蛋白质作为研究模型。所选蛋白质都有较好的遗传学背景和临床病理现象，所获得的研究成果将能够为探究病理机制和防治方法提供根据。关注分子伴侣在蛋白质错误折叠的发生和去除中的作用。采纳多学科、多技术的综合研究方法，集中精力处理蛋白质错误折叠和聚拢的机制这一中心咨询题。主要包括体外聚拢研究，提醒体外聚拢和纤维化的物理化学规律；细胞内包涵体研究，提醒细胞内包涵体构成的动态过程；分子伴侣的作用，借助体外

15、和细胞模型研究分子伴侣和辅伴侣对蛋白质聚拢和包涵体的作用，深化研究分子伴侣互相作用及纤维的形态和构成规律的构造根底。 课题3 研究技术途径示意图课题4 蛋白质异常修饰与与疾病的关系从蛋白质的异常修饰、细胞内蛋白质的修饰及其相关作用网络、动物模型的建立，再到认知功能损伤的学术研究途径。蛋白质的化学修饰，即非酶促氨基修饰（甲醛、核糖等），研究修饰后蛋白质的构造与功能；建立“醛应激”细胞模型，包括甲醛、核糖（多羟基醛）等，建立神经Tau、-Synuclein过度磷酸化的细胞模型，研究过度磷酸化及其相关激酶、磷酸化酶，蛋白质质量操纵体系的作用等；建立“甲醛应激”动物模型，研究甲醛诱导脑内神经Tau的过

16、度磷酸化，细胞功能变化、突触损伤，在此根底上说明蛋白质异常修饰与认知功能损伤的关系；同时采纳老年性痴呆症转基因鼠加以验证；内源性甲醛等与认知功能障碍之间的关系；开展临床老年性痴呆症病人内源性甲醛的测定与认知功能损伤的测评等，研究内源性甲醛与老年性痴呆症认知功能障碍之间关系。课题4 研究技术途径示意图创新与特色 整个工程学科穿插，将单个蛋白质与互相作用网络的研究严密结合，将体外生化性质与体内生理功能研究严密结合，将生理过程的平衡状态与疾病过程的失衡状态研究严密结合，全面提醒蛋白质质量操纵体系的作用机制和调控机制。详细创新点与特色表如今：1. 思路创新，注重系统和网络研究，1+12从关注蛋白质质量

17、操纵单个关键蛋白质的功能研究转为注重功能相关蛋白质互相作用网络研究，如：在氧化折叠系统作用的研究中，将（Ero1-PDI，H2O2-Prx4/Gpx7/Gpx8-PDI, QSOX1）作为一个整体研究，不仅答复单一氧化折叠酶的作用机制，还将阐述氧化折叠过程中内质网氧化复原平衡调控的机制；在分子伴侣（Hsp70、Hsp90、Hsp104、GroEL、TriC）和辅伴侣（CHIP、HSJ1、USP19、BAG6）作用的系统研究中，除了鉴定单个分子伴侣的作用，还将阐述这些分子伴侣之间的关系，从而获得更接近生理条件下的作用机制。2. 学科穿插，优势互补本工程研究队伍的特色是多数负责人和学术骨干都在蛋白

18、质质量操纵研究方面有特别好的积累。本工程在此根底上注重学科穿插，吸纳新的研究力量，加强了活细胞内蛋白质质量操纵的研究、应激条件下蛋白质质量操纵的调控机制研究以及关键蛋白质功能与构造关系的研究，全方位多角度提醒蛋白质质量操纵机制和动态变化，保证了研究成果的可靠性和先进性。 3. 紧扣前沿，探究蛋白质质量操纵的氧化复原修饰新机制 巯基氧化复原修饰的功能和方法研究是当前国际上快速开展的领域。由于蛋白质质量操纵关键蛋白活性位点或调控中心多为氧化复原敏感的半胱氨酸巯基， 氧化复原修饰在质量操纵体系中的作用日益引起关注。本工程紧扣本领域前沿，在原有工作根底上创立巯基氧化复原修饰的定量高通量检测方法，系统研

19、究氧化复原修饰对质量操纵体系不同环节关键蛋白的体内外功能调控，提醒蛋白质质量操纵的新机制，有望获得创新和特色成果。 4. 注重根底与临床及技术应用相结合 本工程将蛋白质质量操纵失衡的触发要素与蛋白质异常修饰和错误折叠及认知功能损伤严密结合，开发试用于老年性痴呆症临床诊断的生物标记物，具有重要实际意义。本工程还注重质量操纵研究平台和新技术新方法的建立，为蛋白质质量操纵机制研究的长期可持续开展和立足国际前沿奠定重要根底。 可行性分析 1. 本工程的研究方案实在可行 从学术思路方面，本工程提出的主要科学咨询题和研究目的不仅都具有理论和实际根据，而且都是该领域前沿性和关键性的咨询题。工程中各课题研究内

20、容和方案明晰明确实在可行。从技术途径方面，各课题均有成熟的蛋白质质量操纵相关研究模型和方法，应用生物化学、生物物理学、构造生物学、细胞生物学及其它现代生物学等技术保证工程预期目的的完成。 2. 本课题凝聚了相关专业的优秀研究团队 本工程的研究队伍集中了我国在蛋白质质量操纵研究领域的优权力量，包括教授及研究员11名，其中中国科学院院士2名、开展中国家科学院（TWAS）院士2名、 国家严重科学研究计划首席科学家3名、“国家出色青年基金”获得者 1 名、中科院“百人计划”入选者 1 名、长江学者特聘教授1名、985工程特聘教授1名，既有国际著名的多年在蛋白质合成和折叠方面具有坚实研究根底的前辈带头人

21、，也有在蛋白质聚拢机制和修饰调控方面的后起之秀。研究团队成员已经开展许多与本工程相关的研究，其中包括科技部“973”工程、国家自然科学基金严重、重点工程和中国科学院创新工程，特别是具有相关国家级严重/重点工程施行的丰富经历，完全能确保本工程顺利施行并到达预期目的。 3. 前期工作根底扎实 本工程研究团队在蛋白质合成、折叠、修复、降解及氧化复原修饰研究等方面，已有着特别扎实的研究根底，本工程团队成员发表的与本工程相关的通讯作者/第一作者研究论文中，在 Cell、Nature、Science 及子刊上3篇，妨碍因子大10的有5篇，妨碍因子10-5之间的有43篇。这些扎实的研究工作根底为本工程的顺利

22、施行与获得预期成果奠定了坚实的根底。 本工程也有特别多前期工作根底。本课题成员建立了多种有效的“亮氨酰-tRNA合成酶与底物氨基酸和tRNA互相作用”研究系统；深化研究了EF-G和LepA参与的核糖体移位过程；在蛋白质巯基亚硝基化修饰的功能和方法研究方面有坚实的根底；对PDI和其同源蛋白的构造与功能关系有二十多年系统的研究根底；对参与酿酒酵母氧化应激的蛋白质的构造、功能及互相作用关系进展了系统的研究，初步说明了氧化应激过程中电子传递的构造生物学根底；系统研究了酵母Prion蛋白Ure2的折叠、聚拢以及其GPx、GST、GRX酶活性；在-Synuclein和TDP-43的聚拢和包涵体构成机制方面

23、获得了重要的研究成果，在双功能辅伴侣对淀粉样聚拢蛋白的调控方面也有特别好的进展；在大分子拥堵与蛋白质聚拢关系研究方面具有特色；在甲醛作为Tau蛋白异常磷酸化的触发要素研究方面以及核糖诱导蛋白质糖基化错误折叠等方面有系统的研究，提出了“甲醛应激”的新观点。 4. 良好的工作条件和环境保障工程的顺利施行 本工程依托、承担和参加研究单位（中国科学院生物物理研究所、中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所、中国科技大学、北京大学和武汉大学）都属于国内一流的科研院校，有特别强的综合科研实力，尤其是大部分科研骨干都依托于国家级、省部级重点实验室，包括生物大分子国家重点实验室、脑与认知国家重点

24、实验室、分子生物学国家重点实验室、合肥微尺度物质科学国家实验室（筹）、病毒学国家重点实验室等，为本工程的开展提供了特别好的工作环境和研究条件，满足本工程在仪器设备和技术方法的需求。课题设置 课题1 ： 蛋白质生物合成的质量操纵 预期目的： 通过研究LeuRS对特异氨基酸及其对应的特异tRNA之间互相识别匹配的机制、鉴定依赖和非依赖tRNA的转移前编校发生的位点，tRNA的氨基酸接受臂在氨基酰化活性中心和编校活性中心之间的动态转位过程；tRNA关键核苷酸在氨基酰化反响、编校反响各步和蛋白质翻译起始阶段的详细作用机理，提醒蛋白合成前质量操纵的调理机制。通过对翻译因子（EF-G，LepA）和核糖体之

25、间的识别以及调控的研究，说明蛋白翻译过程中质量操纵的调理机制。 主要研究内容： 1. 蛋白质合成原料的质量操纵 对蛋白质新生肽链生成前的质量操纵进展全面理解。以亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）为代表，研究不同来源的LeuRS之合成和编校功能的特点，说明在蛋白质生物合成起始阶段质量操纵的机理。主要技术途径包括：通过基因克隆构建各种突变酶以及构造域的突变体；用生物化学和分子生物学的方法，比拟突变体与天然酶功能差异；用核磁共振、射线晶体衍射手段在原子水平上研究酶与底物准确识别的构造根底；用化学生物学方法得到非天然氨基酸做为探针去研究体内新生肽链生成过程的质量操纵。 2. 蛋白质翻译过程中的质量操

26、纵 在原核和真核生物中，开展对肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA的研究，说明它们在蛋白质生物合成过程中的质量操纵机理和生理学意义。主要技术途径包括基因克隆、基因打靶、SiRNA、构建各种突变体和截短体，以及构造域的突变体；用核磁共振、射线晶体衍射手段在原子水平研究EF-G/LepA与错配和正常底物准确识别的构造根底；用化学生物学方法得到非天然氨基酸做为探针去研究体内蛋白质合成过程的质量操纵；用生理学和组织细胞学的方法，比拟突变个体（细胞）与野生型个体（细胞）之间的表型差异。 3. 蛋白质跨膜前的新因子LepA/Guf1 使用体内定点光交联、化学交联、免疫印迹、免疫共沉淀、串联亲

27、和标签技术结合质谱等手段调查LepA/Guf1和其他因子的互相作用；采纳分子生物学和生物化学的方法研究LepA/Guf1翻译阻滞与蛋白质合成的关系；利用基因突变，条件敲除等实验手段研究LepA/Guf1与SRP的系统效应。 经费比例： 18% 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、中国科学院生物物理研究所 课题负责人： 王恩多 学术骨干： 秦燕、周小龙、朱萍 课题2 ： 蛋白质氧化折叠与氧化复原修饰 预期目的： 在目前已建立的蛋白质亚硝基化修饰蛋白质组学检测方法的根底上，开展新的巯基氧化复原修饰的蛋白质组学检测方法，用于挑选蛋白质折叠体系中的氧化复原修饰敏感的关键蛋白。基于已经建立的体内外

28、巯基修饰方法以及相关检测方法，结合构造解析和体外功能重建，获得内质网氧化折叠体系、线粒体氧化折叠体系及蛋白质质量操纵体系的蛋白质巯基氧化复原修饰的生理意义及调控机制，协助提醒蛋白质巯基氧化复原修饰与蛋白质折叠及相关疾病的复杂关系，挑选具有调控巯基修饰功能的小分子化合物药物先导物。研究巯基修饰酶的活性机制，获得巯基氧化复原修饰调控的分子机制，探究新发觉的巯基修饰酶的生理功能。 主要研究内容： 1. 开展新的巯基氧化复原修饰检测的蛋白质组学方法 在已经建立的IBP方法的根底上开展基于SILAC （stable isotope labeling by/with amino acids in cell

29、 culture）的定量方法来定量发生巯基修饰的蛋白质，挑选出蛋白质折叠体系中氧化复原修饰敏感的关键蛋白靶点，研究氧化应激/氮应激对蛋白质氧化折叠及蛋白质质量操纵体系的调控机制。为系统研究蛋白质氧化折叠体系及质量操纵体系提供方法上的创新。 2. 内质网的氧化折叠与巯基修饰对酶活性的调控 研究内质网氧化折叠相关蛋白质（Ero1、Ero1、PDI和Prx4等）的互相作用网络，以及这些蛋白质的亚硝基化及谷胱甘肽化修饰的生理意义。采取分子生物学、生物化学、细胞生物学和构造生物学等多学科穿插技术手段，研究Ero1活力的调理、Ero1与PDI互相作用、内质网过氧化氢的有效去除和新的蛋白质氧化折叠通路等咨询

30、题。鉴定Ero1、Ero1与Prx4的亚硝基化修饰及谷胱甘肽化修饰位点，体内外研究巯基修饰对酶活性的妨碍，在细胞水平检测巯基修饰对细胞内蛋白质氧化折叠过程的妨碍。利用蛋白质组学技术研究内质网氧化折叠相关蛋白质的巯基修饰的生理意义。 3. 线粒体的氧化折叠 结合利用生物化学和构造生物学手段，在原子分辨率水平上说明线粒体膜间隙蛋白质氧化折叠时的电子传递机理，完善线粒体膜间隙蛋白成熟过程中的氧化折叠体系。我们选用最经典的真核生物研究模型酿酒酵母，解析Mia40-Erv1和Mia40-底物蛋白复合体的构造，解析粒体膜间隙中血红素/铜转运蛋白和其他具有重要生物学功能的蛋白的构造，测量线粒体膜间隙中已经知

31、道的血红素/铜转运蛋白的活性，分析血红素/铜转运蛋白与底物蛋白的复合物的之间互相作用的界面，总结共同特征，在原子分辨率水平上提醒Mia40-Erv1依赖的氧化折叠体系和血红素/铜离子转运体系的工作原理。 4. 蛋白质质量操纵体系相关蛋白质的巯基氧化复原修饰研究 鉴定分子伴侣、泛素化降解途径关键蛋白和自噬过程相关蛋白的巯基修饰位点。体外研究分子伴侣被修饰后生化性质及活性的改变，体内研究巯基修饰对其功能的妨碍。研究泛素化降解途径受氧化应激/氮应激的调控机制以及泛素化途径失常导致的错误折叠蛋白质聚拢与细胞效应。研究关键蛋白发生巯基修饰后对自噬的调控机制，以及在氧化应激/氮应激条件下，自噬过程对蛋白质

32、错误折叠蛋白的去除机制。以CFTR、-Synuclein以及酵母Prion蛋白Ure2等蛋白为模型蛋白，在体内外研究蛋白质质量操纵体系相关蛋白的巯基修饰对的淀粉样纤维化的妨碍。研究小分子化合物对蛋白质质量操纵过程中关键蛋白巯基修饰的调控作用，挑选具有调控功能的小分子化合物药物先导物。 5. 巯基修饰酶的作用机制及生理功能研究： 研究具有GRX活性的酵母Prion蛋白Ure2新颖的酶促反响机制，Ure2的GRX活性在体内的生理意义。研究Ure2的 GRX活性的催化反响步骤；分析Ure2与反响中间体之间的互相作用，确定互相作用残基及电子转移机制，从而说明Ure2的GRX活性的催化机制。在正常和应激

33、条件下，通过已建立的蛋白质组学检测方法，比拟Ure2存在、缺失以及处于Prion状态时，酵母细胞内蛋白质的亚硝基化和谷胱甘肽化修饰情况，而阐释Ure2的GRX活性可能的生理功能。 经费比例： 37% 承担单位： 中国科学院生物物理研究所、中国科学技术大学 课题负责人： Sarah Perrett 学术骨干： 王志珍、周丛照、陈畅、黄丽华、陈立君课题3 ： 蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用 预期目的： 蛋白质错误折叠、淀粉样聚拢和包涵体的构成与神经退行性疾病的发生严密相关。研究蛋白质错误折叠发生的内在和外部缘故，错误折叠蛋白质的复性和降解的平衡调控，大分子拥堵和蛋白质包涵体的构成及对细胞的效应，分

34、子伴侣对蛋白质错误折叠和包涵体构成的妨碍及其质量操纵。通过理解细胞内外蛋白质错误折叠发生的规律机制和分子伴侣的作用，为相关疾病（如神经退行性疾病）的发生和病理机制以及可能的预防和治疗提供重要根据。 主要研究内容： 综合应用生物化学、分子生物学、构造生物学和细胞生物学的先进技术方法，研究神经退行性疾病相关蛋白质的错误折叠和包涵体的构成，分子伴侣以及辅伴侣在蛋白质错误折叠的发生和去除中的调理作用。 1. 蛋白质错误折叠，淀粉样聚拢和包涵体构成 (1) 蛋白质淀粉样聚拢和纤维化的分子机制 通过检测蛋白质的内源荧光和应用停流与平衡结合的技术，详细测定一些使体内Prion传播特点发生改变的Ure2突变体

35、的热力学和动力学折叠特征，将其与我们已经得到的野生型蛋白质的参数进展比拟。还将尝试这些突变体的结晶构造解析，以期获得详细的构造变化信息。采纳包含polyQ序列和小的完好折叠的Huntingtin （Htt）蛋白的HEAT-repeat构造域的嵌合体蛋白，研究邻近的HEAT-repeat蛋白构造域的存在对polyQ序列聚拢性质的调理，以及邻近的polyQ序列对HEAT-repeat构造域构造和折叠性质的妨碍。 (2) 翻译后修饰及大分子拥堵对蛋白质聚拢的调控 以人Prion 和Ataxin-3 （Atx3） 等蛋白质为对象，结合体内和体外研究方法，研究糖基化、磷酸化修饰，泛素化修饰和GPI 定位

36、修饰以及大分子拥堵对模型蛋白质聚拢的调控机制。比拟在生理拥堵环境和稀溶液中，翻译后修饰的蛋白质与无修饰的蛋白质的分子效应和功能差异，检测这些特异性修饰以及大分子拥堵关于这些模型蛋白质的构造稳定性、聚拢和纤维化程度的妨碍，以及对Prion蛋白的蛋白酶抗性和感染性的妨碍。阐述翻译后修饰及大分子拥堵关于蛋白质病理性聚拢的细胞效应及Prion蛋白传播中的作用。 (3) 蛋白质聚拢和细胞内包涵体构成 我们的前期研究说明-Synuclein/Synphilin-1 （-Syn/Sph1） 间的互相作用对细胞内包涵体（Inclusion Bodies）构成有明显的妨碍。将用NMR、荧光及其它生化方法体外挑选

37、和设计能够阻止-Syn/Sph1两者互相作用以及-Syn聚拢和包涵体构成的小分子化合物；并在细胞模型中验证这些化合物对-Syn聚拢和包涵体构成以及细胞毒性的妨碍。TDP-43 蛋白（TAR DNA Binding Protein of 43 kDa）的堆积与肌萎缩侧索硬化症的发生相关。我们将研究TDP-43蛋白聚拢的内在序列要素，细胞内构成包涵体的缘故和对细胞的效应和功能丧失。主要探究一些要素包括遗传突变、错误的细胞定位、生化修饰、降解片段和RNA结合等对TDP-43功能丧失和细胞毒性的妨碍。 2. 分子伴侣和辅伴侣对蛋白质质量操纵的作用 (1) 分子伴侣对Prion蛋白、Tau蛋白错误折叠和

38、聚拢的作用 以人Prion蛋白及其病理突变体，过磷酸化修饰的Tau蛋白及其病理突变体为研究对象，用各种生化和细胞技术研究分子伴侣Hsp70A1A（Hsp70家族成员）和ERp57（PDI家族成员）对这两个蛋白质病理性错误折叠的调控机制。阐释分子伴侣在疾病发活力制中的作用，进而运用分子生物学方法设计出能够抑制病理性错误折叠的分子伴侣。 (2) 分子伴侣对Prion传播及polyQ蛋白聚拢的调控 结合体内和体外方法，探测Hsp70突变体妨碍Prion传播的生物化学根底，以及Hsp70的辅分子伴侣在这种妨碍中的奉献。在体外检测妨碍Prion传播的Hsp70突变体的ATPase活性和肽结合才能，与Hs

39、p104和/或Hsp40协同作用的才能，以及与Ure2互相作用和抑制淀粉样纤维化的才能。将在体外和体内研究Hsp70的构造域缺失突变体，理解它的三个构造域在Prion治愈中各自的作用。检测分子伴侣对Prion传播发生改变的Ure2突变体的折叠和聚拢的妨碍，进而在体内检验。包括Hsp70/Hsp40、Hsp104 、GroEL 和TriC在内的分子伴侣已被发觉能在动物、细胞和体外模型抑制Huntingtin （Htt）的N-端片段的聚拢。我们将检测Htt及相关嵌合体的折叠和聚拢性质如何受分子伴侣调控。 (3) 双功能辅伴侣蛋白对蛋白质质量操纵的作用 有一类辅伴侣分子，它们既包括与分子伴侣互相作用

40、的构造域，又有参与泛素蛋白质酶体作用的构造域。我们的前期工作已发觉辅伴侣蛋白HSJ1a能够双向调理Atx3的蛋白质水平，其N端J构造域与Hsp70作用，能够减少细胞内Atx3蛋白的量，而C端的双UIM构造域参与泛素结合相关的作用，上调细胞内Atx3蛋白的水平。我们将以Atx3或-Syn蛋白为模型，研究双功能辅伴侣蛋白如CHIP、HSJ1、USP19、BAG6 （BAT3）等通过分子伴侣和泛素-蛋白酶体两大系统对细胞中蛋白质的质和量的调控。 经费比例： 18% 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、武汉大学 课题负责人： 胡红雨 学术骨干： 梁毅、宋爱新、杜芬课题4 ： 蛋白质异常修饰与相关

41、疾病的关系预期目的： 通过多种方法手段研究神经系统重要功能蛋白质的异常修饰（过度磷酸化、糖基化等）的诱导要素、分子细胞机制；蛋白质错误折叠、分子聚拢、神经细胞死亡与认知功能损伤之间的关系。建立能够试用于临床检验老年性痴呆症的生物化学方法，为老年性痴呆症的早期诊断、药物设计等提供新的方案。主要研究内容：1. 异常磷酸化、非酶促糖基化的细胞与动物模型建立建立醛诱导的过度磷酸化、糖基化等细胞模型、小鼠以及大鼠模型，测定导致细胞发生“醛应激”的醛及其衍生物之间的关系与时间动力过程；并对所建立的细胞、动物模型代谢情况进展评估，使得所建立的细胞及动物模型具有可重复性；在必要情况下建立非人灵长类模型。2.

42、神经系统重要蛋白质的异常磷酸化、非酶促糖基化机制通过申请者所建立的异常磷酸化、糖基化细胞和动物模型，研究甲醛、核糖等诱导的神经Tau、-Synuclein、A等蛋白磷酸化位点及程度；参与神经系统蛋白过度磷酸化的激酶及其调控机制，包括磷酸化酶系统的调控状态等，即“醛应激”的细胞调控通讯网络；在“甲醛应激”情况下神经系统蛋白质磷酸化位点及发活力制。3. 异常磷酸化、非酶促糖基化及其互相作用网络过度磷酸化对神经Tau、A、-Synuclein、SNAREs等蛋白构造与功能的妨碍；神经Tau蛋白等过度磷酸化的生物学意义，包括在细胞核内保护DNA功能的改变等；在建立“醛应激”细胞和动物模型的根底上，检测

43、甲醛诱导神经元中GSK3磷酸化位点及程度；GSK3对线粒体动态平衡和转运的妨碍，及在老年性痴呆症模型所致神经元凋亡和认知功能损伤中的作用；BDNF的调控并改善神经元在应激状态的功能；利用甲醛慢性认知功能损伤的细胞模型、鼠模型以及非人灵长类模型，研究蛋白质异常修饰、互相作用的网络与神经细胞变性之间关系。4. 异常磷酸化、糖基化与认知功能损伤研究神经系统蛋白质异常修饰与认知功能的损伤。从分子、细胞及整体水平研究醛类对SNAREs（soluble NSF-attachment protein receptors）及-Synuclein等蛋白质异常修饰对突触小泡上v-SNARE蛋白，VAMP2/Syn

44、taptobrevin2，与膜上t-SNARE蛋白，syntaxin1和SNAP25蛋白的组分变化及异常聚拢，妨碍神经递质外排功能、损伤突触间联络，在探究蛋白质异常修饰的机制及其相关网络的互相作用的根底上，说明蛋白质异常修饰与认知损伤之间的关系。 5. 内源性甲醛作为生物标记物用于临床诊断的根底研究 研究出能够试用于临床诊断老年性痴呆症的生物标记物。内源性甲醛与老年性痴呆症认知功能障碍之间的相关性；由此建立临床检验老年性痴呆症的生物化学方法，为今后开展成为用于临床诊断和药物使用的评价指标的新方法打下根底。 经费比例： 27% 承担单位： 中国科学院生物物理研究所、北京大学、山东大学 课题负责人

45、： 赫荣乔 学术骨干： 崔德华、陈哲宇、苏擘、张晖、魏艳课题间关系，以及与工程总体目的和五年目的的关系本工程拟从蛋白质生成、修饰与质量操纵这一关键科学咨询题出发，着眼于蛋白质质量操纵关键蛋白质的构造、功能、调控，系统研究蛋白质质量操纵关键蛋白质的作用机制及其对蛋白质错误折叠和聚拢的调理作用，提醒其与蛋白质错误折叠相关疾病发生开展的内在关系，为相关疾病的预防、诊治、药物研究提供直截了当根底和理论根据。因而，本工程围绕蛋白质质量操纵前沿性研究拟设臵严密关联的四个课题：课题一，蛋白质生物合成的质量操纵；课题二，蛋白质氧化折叠与氧化复原修饰；课题三，蛋白质错误折叠及分子伴侣的作用；课题四，蛋白质异常修

46、饰与疾病的关系。这四个课题紧紧围绕蛋白质质量操纵的关键环节，系统研究蛋白质的“生老病死”。蛋白质合成、折叠、修复、降解及修饰调控任何一个环节的质量操纵出现咨询题，均可引起蛋白质错误折叠相关疾病的发生开展。因而，本工程设臵的这四个课题，互相独立又严密关联，从体外到体内，从单蛋白到互相作用网络，从生理状态到病理状态，系统提醒质量操纵的分子机制，通过整体协作实现总体目的。四、年度计划研究内容预期目的第一年1. 构建各种突变株、相关克隆和模型：构建酿酒酵母各种tRNALeu基因敲除株。构建酿酒酵母和人线粒体tRNALeu体外转录的克隆。在低等方式生物中构建LepA的基因敲除株。建立醛诱导的过度磷酸化、

47、糖基化细胞模型、鼠模型。建立和进一步完善脑衰老及神经退行疾病易感要素对异常修饰错误折叠A、-Synuclein等蛋白质的细胞和动物模型研究体系。2. 表达纯化相关蛋白质：EcLeuRS野生型及各突变体，野生型hmLeuRS、ScLeuRS和EctRNALeu，与肽酰-tRNA移位相关的两个因子EF-G和LepA的各种突变体，人源巯基过氧化氢酶Gpx7、Gpx8、Prx4和人源巯基氧化酶QSOX1及其突变体的重组蛋白。3建立体外巯基修饰及分子伴侣研究相关方法。4. 关键蛋白的体外生化研究：鉴定人源巯基过氧化氢酶Gpx7、Gpx8和Prx4、人源巯基氧化酶QSOX1等内质网氧化折叠通路关键蛋白根本

48、的生物化学和生物物理性质。研究巯基特异性的过氧化物酶Ahp1的构造和功能关系。研究Ure2的GRX活性的催化机制。5研究酵母Prion蛋白Ure2突变体的热力学和动力学折叠特征。争取解析突变体的晶体构造。研究邻近的HEAT-repeat构造域的存在对polyQ序列聚拢的调理，以及邻近的polyQ序列对HEAT-repeat构造域构造和折叠的妨碍。6. 体内研究糖基化、磷酸化修饰、泛素化修饰和GPI定位修饰等翻译后修饰及生理拥堵环境关于人Prion蛋白病理性聚拢的细胞效应。7体外挑选和设计能够阻止a-Syn/Sph1两者互相作用以及-Syn聚拢和包涵体构成的小分子化合物。8研究导致细胞发生“醛应激”的醛及其衍生物之间的关系与时间动力过程。 比拟BDNF处理不同时间点神经细胞内蛋白质磷酸化等修饰的变化情况；寻找BDNF通过激活胞内的哪些信号途径来拮抗甲醛应激。1建立各种突变株、相关克隆和模型，获得纯化蛋白质，建立相关方法,为后续研究做好各种铺垫工作。