分析化学 第9章 色谱法概论.ppt
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1、色谱法概论色谱法概论药物分析教研室药物分析教研室1 第一节第一节 概述概述第二节第二节 色谱过程及常用术语色谱过程及常用术语第三节第三节 色谱法基本原理色谱法基本原理第四节第四节 色谱分析定量方法色谱分析定量方法2 要求要求 掌握各种色谱技术的基本原理掌握各种色谱技术的基本原理熟悉判断分离效率的指标熟悉判断分离效率的指标熟悉色谱术语熟悉色谱术语掌握定量分析计算方法掌握定量分析计算方法3 第一节第一节 概概 述述一、色谱法的发展一、色谱法的发展 二、色谱法的分类二、色谱法的分类4 一一.色谱法的发展色谱法的发展 1.定定 义义2.起源与发展起源与发展3.优优 点点4.缺缺 点点5 1.定定 义义
2、色谱法(色谱法(chromatography)分离分析混合物的一种有分离分析混合物的一种有效的物理和物理化学方法。效的物理和物理化学方法。6 2.起源与发展起源与发展 1906年年Tswett创立创立四十年代四十年代Martin发展方法发展方法五十年代五十年代Martin、synge、Van deemter建立理论建立理论六十年代六十年代Horvathc HPLC7 色谱分离示意图色谱分离示意图8 3.实实 质质:一种物理分离方法一种物理分离方法4.机机 理理:欲分离混合物在两相间发生分布欲分离混合物在两相间发生分布固定相:固定相:有巨大表面积的固定床有巨大表面积的固定床流动相:流动相:通过或
3、沿着固定床渗滤通过或沿着固定床渗滤的流体的流体9 9 色谱法的色谱法的原理原理主要是利用物质主要是利用物质在流动相与固定相之间的分配在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离。系数差异而实现分离。色谱法存在色谱法存在三要素三要素:待分离的:待分离的混合物、固定相和流动相。混合物、固定相和流动相。10105.优优 点:点:灵敏、选择性好、灵敏、选择性好、分析速度快、应用范围广分析速度快、应用范围广6.缺缺 点:点:定性能力差定性能力差11(1)与光谱法比较)与光谱法比较色谱法与光谱法的主要区别色谱法与光谱法的主要区别在于色谱法具有分离及分析在于色谱法具有分离及分析两种功能,而光谱法不具备两种功
4、能,而光谱法不具备分离功能。分离功能。12(2)与其他分离方法比较)与其他分离方法比较与其他分离方法,如蒸馏、结晶、与其他分离方法,如蒸馏、结晶、沉淀、萃取法相比,色谱法具有极沉淀、萃取法相比,色谱法具有极高的分离效率高的分离效率.不仅可使许多性质相近的混合物分不仅可使许多性质相近的混合物分离,还可使同分异构体获得分离离,还可使同分异构体获得分离.已成为各种实验室的常规手段,是已成为各种实验室的常规手段,是分析化学的重要分支。分析化学的重要分支。1313 二、色谱法的分类二、色谱法的分类 1.按两相所处状态分类按两相所处状态分类2.按分离过程机理分类按分离过程机理分类3.按操作形式分类按操作形
5、式分类14 1.按两相所处状态分类按两相所处状态分类 气固色谱气固色谱(GSC)气相色谱气相色谱 流动相流动相 (GC)气液色谱气液色谱(GLC)液固色谱液固色谱(LSC)液相色谱液相色谱 (LC)液液色谱液液色谱(LLC)超临界流体色谱法超临界流体色谱法(SFC)152.按分离过程机理分类按分离过程机理分类吸附色谱吸附色谱:吸附性能差异:吸附性能差异分配色谱分配色谱:流动相和固定相间的分:流动相和固定相间的分配系数(或溶解度)不同配系数(或溶解度)不同键合相色谱法键合相色谱法:吸附分配:吸附分配离子交换色谱离子交换色谱:离子交换能力不同:离子交换能力不同凝胶排阻色谱凝胶排阻色谱:分子尺寸大小
6、不同:分子尺寸大小不同而阻滞作用不同而阻滞作用不同1616 毛细管电泳法毛细管电泳法:以高压直流电场为驱动力,:以高压直流电场为驱动力,含有液体介质(电解质溶液)的毛细管为含有液体介质(电解质溶液)的毛细管为分离通道,利用样品中不同带电组分的电分离通道,利用样品中不同带电组分的电泳淌度的差别,而进行的一种分离分析方泳淌度的差别,而进行的一种分离分析方法。法。毛细管电色谱法毛细管电色谱法:以在高压直流电场中所:以在高压直流电场中所产生的电渗流为驱动力,毛细管色谱柱为产生的电渗流为驱动力,毛细管色谱柱为分离通道,依据样品中不同组分的分配系分离通道,依据样品中不同组分的分配系数及电泳淌度的差别,而进
7、行的一种分离数及电泳淌度的差别,而进行的一种分离分析方法。分析方法。17173.按操作形式分类按操作形式分类 填充柱色谱法填充柱色谱法柱色谱法柱色谱法 毛细管柱色谱法毛细管柱色谱法 纸色谱法纸色谱法 PC平面色谱法平面色谱法 薄层色谱法薄层色谱法 TLC184.4.按使用目的分类按使用目的分类(1 1)分析用色谱)分析用色谱(2 2)制备用色谱仪)制备用色谱仪(3 3)流程色谱)流程色谱简化分类如图简化分类如图9-1 19第二节第二节 色谱过程色谱过程 及常用术语及常用术语一、色谱过程一、色谱过程二、常用术语二、常用术语三、色谱流出曲线上的重要信息三、色谱流出曲线上的重要信息20 一一.色谱过
8、程色谱过程1.分配平衡分配平衡2.分配系数分配系数K 3.容量因子容量因子k4.保留值保留值R保留因子(比)保留因子(比)5.K、k、R的关系的关系21 1.分配平衡分配平衡22 2.2.分配系数分配系数K K 分配系数分配系数:在一定温度和压力下,组:在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡分在固定相和流动相之间分配达平衡时的时的浓度之比值浓度之比值,即,即物理意义物理意义:溶质在互不相溶的两相中达:溶质在互不相溶的两相中达到平衡时,在两相中的到平衡时,在两相中的浓度之比为常数浓度之比为常数23232424色谱过程色谱过程是物质在相对运动着的两相间分配平是物质在相对运动着的两相
9、间分配平衡的过程。衡的过程。若混合物中二个组分的分配系数不等,若混合物中二个组分的分配系数不等,则被流动相携带移动的速度不等,而则被流动相携带移动的速度不等,而被分离。被分离。分配系数不等是分离的前提。分配系数不等是分离的前提。2525 分配系数分配系数K与组分的性质、溶剂的极与组分的性质、溶剂的极性、温度等因素有关。在给定条件下,性、温度等因素有关。在给定条件下,组分性质不同,组分性质不同,K也不同。也不同。K可适用于多种机理,不同的色谱机可适用于多种机理,不同的色谱机理中理中K的含义不同:的含义不同:在吸附色谱中,在吸附色谱中,K为为吸附平衡常数吸附平衡常数,在离子交换色谱中,在离子交换色
10、谱中,K为为交换常数或交换常数或称选择系数称选择系数。2626 不论是离子交换过程、溶解过程、不论是离子交换过程、溶解过程、吸附过程,吸附过程,K值都决定于二相中组值都决定于二相中组分的相对粒子数。分的相对粒子数。如果如果K值大,则固定相中的粒子数值大,则固定相中的粒子数比流动相中的粒子数多。从总体平比流动相中的粒子数多。从总体平均来看,这一组分的分子在固定相均来看,这一组分的分子在固定相中停留的时间更长。中停留的时间更长。2727 3.容量因子容量因子k 指在一定温度和压力下,组分在指在一定温度和压力下,组分在两相间分配达平衡时,分配在固两相间分配达平衡时,分配在固定相和流动相中物质的定相和
11、流动相中物质的量的比量的比。又称又称分配比分配比,即,即 2828 称为相比率,称为相比率,是反映各种色谱柱型是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。特点的又一个参数。29294.保留因子保留因子(比比)R 保留值保留值定定 义义:样品在流动相中出现的样品在流动相中出现的几率几率,即在流动相中停留的时间分数,即在流动相中停留的时间分数,用用R表示。表示。30 3131 组分的移动速率组分的移动速率取决于分配系数取决于分配系数K数数K值相同,组分不能分离值相同,组分不能分离K值不同,组分在柱上移动速度不同值不同,组分在柱上移动速度不同色谱是色谱是不同迁移现象不同迁移现象的最终产物。的最终产物。323
12、25.K、k、R三者关系三者关系假设色谱柱的柱长为假设色谱柱的柱长为L,则,则3333 二二.常用术语常用术语 1.流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰 2.基线基线 3.峰高(峰高(h)4.峰面积(峰面积(A)5.保留值保留值 6.选择因子选择因子 7.色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度34 1.流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰色谱仪记录器记录的电信号色谱仪记录器记录的电信号信号强度对信号强度对t t作图所绘制的曲线作图所绘制的曲线流出曲线流出曲线曲线上突出的部分曲线上突出的部分色谱峰色谱峰35色谱流出曲线上的重要信息:色谱流出曲线上的重要信息:l)根根据据色色谱谱峰峰的的个个数数,可可以以判判断断样
13、样品品中中所所含组份的最少个数。含组份的最少个数。2)根根据据色色谱谱峰峰的的保保留留值值(或或位位置置),可可以以进进行定性分析。行定性分析。3)根根据据色色谱谱峰峰下下的的面面积积或或峰峰高高,可可以以进进行行定量分析。定量分析。4)色色谱谱峰峰的的保保留留值值及及其其区区域域宽宽度度,是是评评价价色谱柱分离效能的依据。色谱柱分离效能的依据。5)色谱峰两峰间的距离,是评价固定相和色谱峰两峰间的距离,是评价固定相和流动相选择是否合适的依据。流动相选择是否合适的依据。6)调整保留时间和体积反映了组分与固定调整保留时间和体积反映了组分与固定相以及流动相之间的相互作用。相以及流动相之间的相互作用。
14、36362.基线:基线:色谱柱中仅有流动相色谱柱中仅有流动相通过时,检测器响应的信号记录通过时,检测器响应的信号记录,通常与横轴平行。通常与横轴平行。基线反映检测器的噪音随时间的变基线反映检测器的噪音随时间的变化,稳定的基线应当是一条直线。化,稳定的基线应当是一条直线。373.峰高峰高(h):色谱峰顶点与基线色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。之间的垂直距离。4.峰面积峰面积(A):色谱峰所包围的面积。色谱峰所包围的面积。定定量量依依据据3838 5.保留值保留值组分在柱内滞留状况的一个指标组分在柱内滞留状况的一个指标1)死时间死时间 tM2)保留时间保留时间tR 3)调整保留时间调整保留时间tR
15、4)死体积死体积VM5)保留体积保留体积 VR6)调整保留体积调整保留体积VR7)相对保留值相对保留值2.139 40 1)死时间死时间 tM 不被固定相吸附或溶解的物质进不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时,从进样到出现峰极入色谱柱时,从进样到出现峰极大值所需的时间称为大值所需的时间称为死时间死时间。41 2)保留时间保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰极大点试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间,称为时所经历的时间,称为保留时间保留时间。如图如图OB它相应于样品到达柱末端的它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。检测器所需的时间。42423)调整保留时间调整保留时间tR某组份
16、的保留时间扣除死时间后称为该组某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的份的调整保留时间调整保留时间,即,即 tR=tR-tM由于组份在色谱柱中的保留时间由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间,所以在固定相中滞留所需的时间,所以tR实实际上是组份在固定相中停留的总时间。际上是组份在固定相中停留的总时间。43434)死体积死体积VM 指惰性组分从进样开始到柱后出现浓度指惰性组分从进样开始到柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。极大点时所通过的流动相体积。指从进样器到柱后出口未被固定相所占指从进样
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