第7章 蛋白质的分离纯化和表征.ppt

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1、第第7 7章章 蛋白质的分离纯化和表征蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质含有酸蛋白质含有酸/碱碱AAAA残基具有两性残基具有两性 碱碱/酸越大酸越大pIpI 越大越大pI通常在通常在 6.0 左右左右一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质的分子量蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿道尔顿1C12绝对质量绝对质量/12 1.6610-27千克千克二、蛋白质分子的大小（一）根据化学组成测定最小分子量（一）根据化学组成测定最小分子量1 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量、测定蛋白质中某一微量元素的含量2 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子假设蛋白质中仅含一个铁原子

2、最低相对分子质量最低相对分子质量=100*55.8/铁的百分含量铁的百分含量（二）（二）SDSPAGEPAGE测定相对分子质量测定相对分子质量蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：w所带电荷所带电荷w分子量分子量w分子形状分子形状十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基烷基 亲油亲油（蛋白质疏水区）（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键（三）凝胶过滤法测定相对分子质量（三）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质混合样蛋白质混合样w凝凝凝胶法只适于球状蛋白分子

3、测量凝胶法只适于球状蛋白分子测量三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（一）胶体性质（colloidal system）胶体溶液的特点：胶体溶液的特点：w分子直径在分子直径在1-100 nm1-100 nm内内w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液蛋白质胶体溶液的稳定因素：蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.2.水膜弹性水膜弹性w蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质运动以及不能通过半透膜等性质（二）

4、蛋白质的（二）蛋白质的沉淀沉淀 Pr从胶体溶液中析出从胶体溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀：温和条件，改变溶液温和条件，改变溶液pH或或Pr所所带电荷带电荷Pr结构和性质没有变化结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解适当条件下可重新溶解 非变性沉淀非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不可逆沉淀不可逆沉淀强烈沉淀条件强烈沉淀条件破坏破坏Pr胶体溶液稳定性胶体溶液稳定性也破坏也破坏Pr结构和性质结构和性质沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解变性沉淀变性沉淀如加热沉淀、强酸如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等和生物碱沉淀等1.1

5、.盐析法盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性盐析一般不引起变性等电点沉淀的蛋白质溶液中等电点沉淀的蛋白质溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解盐溶盐溶原因？原因？盐溶盐溶盐析盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量盐离子量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中于水中盐溶盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出会沉淀析出原因？原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（NH4）2SO4）2.2.有机溶剂沉淀有机溶剂

6、沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用加带电质点间的相互作用3.3.等电点沉淀等电点沉淀4.4.重金属盐沉淀重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.5.生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.6.加热变性沉淀加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露，天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态破坏水化层及带电状态四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活总目标：增加制品纯度或比活1.1.前处理：因动前处理：因动/植物植物/细菌而异细

7、菌而异2.2.粗分级分离：采用盐析粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀等电点沉淀/有有机溶剂分级分离等方法机溶剂分级分离等方法3.3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等层析、吸附层析以及亲和层析等4.4.结晶结晶五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料血液透析血液透析小分子溶出小分子被带出小分子被带出透析机透析机

8、透析液透析液加加压压血液血液2 2、密度梯度（区带）离心、密度梯度（区带）离心6000080000转/分重力60万80万倍3、凝胶过滤、凝胶过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法二）利用溶解度差别的纯化方法 1.1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析3.3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法w降低介电常数降低介电常数w争夺水化膜争夺水化膜（三（三)根据电荷不同的分离方法根据电荷不同的分离方法电泳电泳原理：原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 0分子大小不同，电场中移动速度也不同分子大小不同，电场中移动速度也不同（四）利用蛋白质选择性吸附的性质四）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析羟磷石灰层析疏水作用层析疏水作用层析（五）利用对配体的特异生物学五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒亲和色谱颗粒具有极强的专一性具有极强的专一性六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（略）